Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Özet

Bir floresan In situ Hibridizasyon (FISH) yöntemi görsel floresan mikroskobu kullanarak viral genomik RNA algılamak için geliştirilmiştir. Bir prob daha sonra hibridizasyon ve immünfloresan teknikleri bir arada kullanarak tespit edilebilir viral RNA özgüllük ile yapılır. Bu teknik, hücre içi virüs kaçakçılık olaylarının kontrolü hakkında bilgi veren, kararlı durumda viral RNA veya DNA'nın yerelleştirme belirleme avantajı sunuyor.

Özet

Hücrelerin viral replikasyon için enerji ve kaynak aktarmak için hizmet normal hücre fonksiyonları belirli değişiklikler ortaya çıkarmak etkileyecek virüsler. Konak hücre fonksiyonunda birçok açıdan genellikle viral gen ürünlerinin ifadesi ile, virüsler tarafından el edilmektedir işe konak hücre proteinleri ve makine bu. Ayrıca, mobil veziküller ve motor proteinleri virüs mühendisi spesifik membran organelleri veya etiket hücre (de novo enfeksiyon sırasında, virüslerin eş-opt moleküler motor protein çekirdeğinin hedef bölgeleri hedeflemek; sonra, virüs montaj sırasında, onlar hücresel kaçırmak olacaktır ) virüslerin mecliste yardımcı olacak makine. Daha az virüsler, özellikle de RNA genomu olan, protein ve RNA bileşenleri her ikisinin intraselüler ticareti koordine ve bunlar, hücre özel lokuslar bulaşıcı parçacıklar montaj elde nasıl nasıl anlaşılmaktadır. RNA yerelleşme çalışmada daha önceki çalışmaları başladı. Düşük ökaryotik em geliştirilmesibryos ve nöronal hücrelerin önemli biyolojik bilgiler, hem de gen ekspresyonu şelaleden oluşan programlama RNA yerelleşmenin önemi vurgulamıştır. Diğer organizmalar ve hücre sistemleri çalışmada da benzer önemli bilgiler vermiştir. Virüsler zorunlu parazitlerdir ve çoğaltmak için bunların ana hücre kullanmalıdır. Bu nedenle, RNA virüsleri döl virüs partikülleri ¹ içine sitoplazma yoluyla ve nihai varış noktalarından biri nükleer gözenek yoluyla nükleus,,, kendi RNA genomu yönlendirmek anlamak önemlidir.

BALIK viral RNA kararlı durum lokalizasyon değişiklikleri tanımlamak için yararlı bir araç olarak hizmet vermektedir. Co-analiz viral RNA ³ ile proteinlerin ortak lokalizasyon hakkında bilgi sağlayacak IF immunfloresan (IF) analizi ^22, FISH ile / birleştirildiği zaman. Bu analiz, bu nedenle diğer biyokimyasal ve biyofiziksel olarak, RNA-protein etkileşimleri test etmek için iyi bir başlangıç ​​noktası sağlarkendisi tarafından eş-lokalizasyon yana ^4,5 testler, bir etkileşim belli olması için yeterli kanıt değildir. Böyle bir yöntemi kullanarak viral RNA yerelleştirme incelerken, bol bilgi viral ve hücresel RNA kaçakçılığı olayları ⁶ hem de elde edilmiştir. Örneğin, HIV-1 hücre çekirdeğine RNA üretir, ancak, sadece RNA sitoplazmadaki tercüme edilir. bir anahtar viral proteini eksik (Rev) ^7, viral RNA'nın BALIK viral için blok çekirdeği ^8'de HIV-1 genomik RNA'nın retansiyon bağlı olduğunu ortaya çıkarmıştır.

Burada, in situ viral genom RNA 'nın görsel analizi için yöntem sunmaktadır. Yöntem bir etiketli RNA prob yararlanır. Bu prob viral genom RNA tamamlayıcı olacak şekilde tasarlanmıştır. Boyunca antisens RNA prob, digoxigenin (DIG) ile değiştirilmiştir ribonukleotid in vitro sentezinde vitro transcr bir dahildiription reaksiyon. Prob hücreleri hedef RNA ile melezleştirilebilir sonra BALIK / IF gerçekleştirirken, daha sonra antikorun etiketleme adım (Şekil 1) mRNA Lokalizasyon gibi ilgi proteinleri ortaya çıkaracaktır.

Protokol

1. Prob Hazırlık

1. In vitro transkripsiyonu vektör içinde digest 1 ug, 1 saat boyunca PKS (+) pol 37 ° C'de Kpn1 enzim ile 236nt ⁹ ve bir agaroz jeli üzerine lineerize DNA ürünü çalıştırın. Fragmanı yaklaşık 2500 bp olması gerekir.
2. Jel parçası kesip Roche Micro Zehir Jel Ekstraksiyon Kiti (kullanılan tüm reaktifler Tablo 1'de verilmiştir) kullanarak arındırmak. 30 ul elüsyon tampon içinde nihai elüsyon gerçekleştirmek. Saflaştırma doğrulamak için bir agaroz jeli üzerine ürün 5 ul çalıştırın.
3. 2 saat 37 ° C'de Roche DIG RNA etiketleme seti ve inkübe kullanılarak in vitro transkripsiyon reaksiyonu (aşağıdaki tarife bakınız) bir karıştırın.

In vitro transkripsiyon reaksiyonunda:

Lineerleştirilmiş DNA	23 ul
1X DIG RNA etiketleme karışımı (Roche)	4 ul
1X Traoyma yazıyı tampon	8 ul
20U RNaz OUT	1 ul
80U T7 RNA polimeraz	4 ul
Toplam	40 ul

4. 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe DNase I ve 228 U ekleyin.
5. 20 mM nihai bir konsantrasyona EDTA pH 8.0 ilave edilerek reaksiyon durdur.
6. Üretici tarafından belirtilen şekilde Roche Hızlı Spin Sütunlar kullanarak reaksiyon arındırın.
7. 1/10 hacim DEPC tedavi edilen 3M NaOAc pH 5.2 ve buz gibi soğuk% 95 etanol 2.5 hacim ile yağış tarafından prob arındırın. Karıştırmak ve bir gece boyunca 30 dakika süreyle -80 ° C'de inkübe edilir.
8. 15,000 x g hızında 15 dakika 4 ° C'de santrifüje prob.
9. Süpernatantı ve buz gibi soğuk% 70 etanol içinde pelet yıkayın. 15,000 x g hızında 5 dakika 4 ° C'de tekrar santrifüje.
10. Süpernatantı ve pelet kurulayın. 50 ul w pelletini10 U Invitrogen RNaz OUT içeren ater (DNaz / RNaz ücretsiz).
11. Spektrofotometri ile prob konsantrasyonu (260 nm ölçüsü RNA) tahmin ve ul ng / 5 'lik bir konsantrasyon ye tamamlanır. ° C uzun süreli depolama için kısa süreli kullanım veya -80 -20 ° C'de kısım halinde saklayın. O yüzden bu bir kısım tasarruf arası karşılaştırmalar testi yapılması tavsiye edilir.

2. Hücre Sabitleme

1. Hasat sonrasında nihai konfluense yaklaşık% 70-80 olup bu yüzden tedavi edilmezse, steril cam lamelleri üzerine yapışık tohum hücreleri başlangıçta önemlidir. Yapışmaz hücreleri, normal olarak büyümeye ve ne zaman toplamak için hazır, 1 saat için 0.01% w / v poli-L-lisin (Sigma-Aldrich, Inc) ile tedavi edilmiştir lamelleri ile bunları tasarlamak. Tipik bir 12-kuyucuklu polistiren doku kültürü plakası (3,8 cm ²⁾ için, 150,000 hücreler (örneğin, HeLa) transfeksiyondan 24 saat önce az kaplanır. Sigara yapışık hücreleri enfekte veya transfekte her zamanki gibi ve reklam için izin verilebilirBurada fiksasyon ³ önce cam kapak slipleri için.
2. Medya atın ve 1 dakika süreyle çift distile su (DPBS) hazırlanan fosfat tamponlu 1X salinle hücreleri yıkayın. Diethylpyrocarbonate (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc) 1X PBS de kullanılabilir-muamele, bununla birlikte bunun arıtılmamış PBS RNaz enzim ihtiva edebilir olamaz gibi.
3. PBS atın ve tamamen hücre kapsayacak kadar% 4 paraformaldehit, ekleyin. 15-20 dakika inkübe edin.
4. Paraformaldeyhyde atın ve 1 dakika 1X DPBS hücreler yıkayın.
5. DPBS atın ve 0.1 M glisin (1X DPBS çözünmüş) ekleyin. 10 dakika inkübe edin.
6. Glisin atın ve 1 dakika 1X DPBS hücreleri yıkayın.
7. DPBS atın ve Triton-X (1X DPBS çözünmüş)% 0,2 ekleyin. 5-10 dakika inkübe edin. Nükleoler veya nükleer zarf proteinleri için boyama ise, Triton en fazla 5 dk veya protein lokalizasyonu için X-100 diffüz olacak olan geçirgenliği artar.
8. Triton X-100 atın ve bir kez yıkayın1 dakika 1X DPBS.
9. Uzun süreli depolama için, dört ay için 4 ° C de% 70 etanol ve mağaza ile PBS değiştirin. Alternatif olarak, 1X DPBS ile bir kez daha yıkayın ve FISH geçin.

3. In situ Hibridizasyon Floresans (FISH)

1. Lamelleri etanol içinde bekletildi ise, 1X DPBS ile etanol yerine ve hücreler 30 dakika süreyle rehidre izin verir. Lamelleri 4 ° C'de saklandığında rehidrasyon gecede yapılabilir
2. 1 dakika boyunca 1X DPBS ile lamelleri yıkanır.
3. Temiz ve iyi etiketlemek için özen üzerinde lamelleri inkübe için slaytlar hazırlayın.
4. 18mm coverslip için, sürgüye DNase çözeltisi (ticari olarak mevcut 25 ünite / coverslip), 50 ul ilave edin. Bu hücre yüzü aşağı yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika için inkübe emin olmak, coverslip ekleyin.
5. 1 dakika boyunca 1X DPBS ile lamelleri yıkanır.
6. Coverslip başına 50 ul hibridizasyon karışımı (aşağıdaki tarife bakınız) üzerine ekle42'de bir slayt ve 16-18 saat coverslip hücre yüzü aşağı kuluçkaya ° C İnkübasyon,% 50 formamid, 2X SSPE karışımı (12.5 ml deiyonize formamid, 2.5 ml 20X SSPE, 10 ml su) ihtiva eden bir tepsi yapılmalıdır.

Karışım hibridizasyon (bir coverslip, 50 ul için):

Stok miktarı	Malzeme (son konsantrasyonda)
25 ul	Formamid,% 50 (deiyonize; herhangi bir kaynak)
5 ul (10 mg / ml)	tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc)
5 ul (20X arasında)	SSPE, 2X
5 ul (50X arasında)	Denharts, 5X
0,125 ul (5 adet)	RNaz OUT
5 ul (ul / 5 ng 25 ng)	Sonda
5 ul	Nihai yapmak H2O DEPC,hacminin 50 ul

7. 42 az 15 dakika boyunca 50 ul% 50 formamid (1X DPBS ile sulandırılmış) içinde inkübe lamelleri hücre yüzü aşağı ° C
8. 42 az 5 dakika her biri için 50 ul 2X SSPE (20X SSPE 1X DPBS inceltilmiş) onları hücre tarafı aşağı kuluçkaya ° C ile 2X SSPE iki kez lamelleri yıkayın
9. 1 dakika boyunca 1X DPBS in lamelleri yıkanır.

4. İmmünofloresan Boyama

1. 30 dakika 50 ul 1X Roche engelleme çözümü (1X DPBS inceltilmiş 10X Roche engelleme çözümü) bunları hücre tarafı aşağı koyarak lamelleri engelleyin.
2. 37 de 1 saat için 50 ul primer antikor çözeltisi içinde lamelleri hücre tarafı aşağı inkübe ° C. Anti-DIG antikoru 1X engelleme çözelti içinde üreticinin yönüne göre seyreltilmiş edilmelidir. Diğer antikor proteinleri leke kullanıldığı takdirde, kullanılan tüm antikorlar ev sahibi farklı Spec türetilen koşuluyla doğru konsantrasyonda eklenebilirler.
3. 1X DPBS içinde 10 dakika süreyle lamelleri yıkanır.
4. 37 de 1 saat için 50 ul sekonder antikor çözeltisi içinde lamelleri hücre tarafı aşağı inkübe ° C. Alexa Fluor-konjuge antikor (Invitrogen) bir renk aralığında üretmek için kullanılabilir ve 1X bloke edici bir çözüm, 1X DPBS olarak 1:500 kullanılmaktadır.
5. 10 dakika 1X DPBS Her iki kez lamelleri yıkayın.
6. Whatman kağıda lamelleri hücre tarafı yukarı kurulayın. Işık ve ağartma etkilenmemesi için lamelleri kapsayacak emin olun.
7. Tüm sıvı buharlaştırılır sonra, 8 ul ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc) kullanarak taze Slaytlarınıza lamelleri monte edin. Yavaşça hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için coverslip aşağı dokunun.
8. Yerine sabitlemek için lameller kenarlarına tırnak cilası sürün.
9. Mikroskopi teknikleri ile RNA ve protein görselleştirme de bu tekniğin başarısı için çok önemlidir. Bu anahtar yani kullanılan mikroskop Ayarlar görselleştirme yardımcı veya engel olabilirmikroskop ayarları doğru ve bir örnek, belirli bir deneyde başka tutarlı olması gerekir. Ayrıntılı mikroskopi ayarları için, optik ve antikor kombinasyonları referanslar ^1,10 bakın.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Viral RNA boyanması için bir örnek, Şekil 2'de görülebilir. Küçük sitoplazmik punctae nadir olmamasına rağmen, HIV-1 için viral RNA, çoğunlukla yaygın gösterilmiştir sitoplazması içinde görülmüştür. Spesifisite herhangi floresans gösterilecek çevreleyen hücrelere pozitif hücrelerin karşılaştırma tarafından görülebilir. Bu çekirdeğinde parlak bir sinyal olarak görüntülenmiştir olabilir ve sitoplazmadaki RNA floresans sinyal eksikliği: olarak Girişte belirtildiği gibi, düzenleyici Rev proteini eksikliği, HIV-1 çekirdek içinde tutulur RNA üretir. Hücresel protein aşırı ekspresyonu, aynı zamanda, HIV-1 viral RNA'nın dağılımı vites değiştirme yeteneğine sahiptir. Şekil 2 içinde , endosome vezikül kaçakçılığına karışmış proteinlerin ekspresyonu (örneğin, Rab7-etkileşim lizozomal protein (UHP) ¹¹ veya N-terminal silinmiş UHP (RILPN) ¹¹ ve dynein motor fonksiyonu ile [örneğin p50/dynamitin ¹ müdahale ^{proteinler, 12],} FISH analizleri ile belirlenen viral genomik RNA normal kararlı durum lokalizasyon müdahale UHP ifade mikrotübül organizasyonu merkezi (MTOC) ¹³ viral genomik RNA'nın yeniden yerelleştirme yol açar. RILPN geç dağılır içinde endozomlar dynein motoru kompleks ¹⁴ ve p50/dynamitin blokları dynein motor ve bültenleri büyük subünitinin ^Tutkallı P150 bağlamak için alamaması nedeniyle sitoplazma geç endozomlar aynı zamanda hücre perifere viral genomik RNA ve HIV-1 yapısal protein ¹ (Şekil 2). Viral genomik RNA'nın kararlı durum lokalizasyon manipülasyon, en bulaşıcı olduğu önemli bir katkıVirüs partiküllerinin, terapötikler nihai geliştirilmesi için önemli olabilir. Bizim ellerde, viral RNA gibi erken 3 saat sonrası transfeksiyon ve enfeksiyon ¹⁰ olarak hücrede görünür ve 12 saat bu FISH tekniği ile kolayca gözlemlenebilir hale gelir.

Şekil 1.. BALIK / co-analizleri IF. Hücreler için protokol akış şeması lamelleri yetişen ve daha sonra paraformaldehid ile sabitlenir. Hücreleri ya BALIK / IF için kullanılabilir veya depolanması için% 70'lik etanol içinde saklanan önceki glisin ve Triton X-tedavileri gerçekleştirilir. Depolama için susuz Hücreler FISH / IF devam etmeden önce 1X DPBS (DEPC tedavi edilen PBS) rehidrate edilir. Hücreler DNaz I ile tedavi ve prob ile melezleşme gece bırakılır. Bir kez hibridizasyon tamamlanınca, hücrelerin yanı SSPE ile olduğu gibi, formamit ile yıkanmış, ve nihai bir 1X DPBS durulama edilir. Engelleme çözeltisi ile inkübasyondan, ardından hücreler uygulananPrimer antikor. Yıkandıktan sonra sekonder antikor uygulanır. 1X DPBS İki son yıkar görüntüleme için lamelleri üzerinde kurutulur ve slaytlar monte boyama işlemi tamamlayın.

Şekil 2. Temsilci sonuçlar BALIK / co-analizi kullanılarak IF. A), HIV-1 hücresel protein aşırı ekspresyonu (UHP, p50/Dynamitin ve RILPΔN (bir amino-terminal iptal mutantı) neden yapıları ile HeLa hücreleri içine ve bazı durumlarda transfekte edilir) . BALIK / co-IF analizleri yapıldı: RNA ayırt etmek G3BP veya LAMP1 (kırmızı) ile ya yeşil tanımlanır. B), HIV-1 HeLa ifade ve farklı zaman noktalarında toplanır. Hücresel protein, hnRNP A1, kırmızı lekeli ise viral RNA ifade yeşil olarak izlenir. Büyüklüğü 10 mikron çubuklar vardır. Referanslar ¹ (; UHP, p50/Dynamitin ve UHP deltaN panel A select rakamlar) değiştirilerek Görüntülerve ¹⁷ (panel B).

Tartışmalar

BALIK / co-analizler IF şimdi ^9,15,16 rafine edilmiş hücrelerde viral RNA görselleştirmek için güvenilir bir yöntemdir. Birkaç yıl boyunca, biz RNA için boyama zarif bir yöntem geliştirdik. Bu teknik, prob hedef RNA ¹⁷ özgü sağlanan hücre tipleri arasında geniş bir yelpaze üzerinde kullanılabilmektedir. DIG ile etiketlenmesi prob olarak, bu basit bir boyama ile RNA görselleme yeteneğine sahiptirler. RNA ve diğer proteinler için boyama birleştirildiğinde, BALIK / IF co-analizler hücresel yapılar ve protein / RNA lokalizasyon gözlemlemek için güçlü bir araç haline gelir.

RNA tespit özgüllük oldukça yüksektir. Bu, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Rev eksikliği çekirdeğinde ¹⁸ viral RNA tuzağa tespit viral genomik RNA lokalizasyonu, BALIK odaklanmış özgün çalışma bazılarında. Bu yana, viral genomik RNA lokalizasyonuna bol yeni bilgiler techniqu kullanılarak elde edilmiştire burada özetlenen. Eksprese eden hücresel protein tarafından, belirli bir popülasyonları-değil, viral RNA'nın her bir hücrenin farklı bölgelere lokalize etmek için zorlanır. HnRNP A2 siRNA tarafından boşaldığında fenotipi benzer UHP ekspresyonu, elde edilen HIV-1-salgılayan hücrelerin ¹³ RNA gözle MTOC birikmeye neden olur. (Hücresel perifere hücre içi etki viral genomik RNA sürümde dynein ağır zincir ¹ sonuç p50/Dynamitin aşırı veya demonte: viral genomik RNA eksi uç motor protein, dynein devre dışı bırakarak hücre perifere itilebilir Şekil 2). Artık aktif juxtanuclear etki lokalize çünkü artık dynein motoru bağlar UHP, RILPΔN, bir mutant, dağılır sitoplazmaya (LAMP1 tarafından etiketlenir) endozomlar. Bu sonuçlar, HIV-1 genomik RNA ve özellikle de bir plastik nüfusun kavramı işaret ettiği, HIV-1 genomik farklı havuzlarıViral replikasyon döngüsünde bazen tanımlanabilen rolleri ile var RNA. Bunlar aynı kavramlar zaten bu mRNA, Gag ¹⁹ tarafından kodlanan proteinin tespit edilmiştir.

BALIK / antikor seçimi ve yer durumu ile ilgili ortak analizler IF kullanımlarına sınırlamalar vardır. Primer ve sekonder antikorlar ve bunların konsantrasyonları, en iyi kombinasyonu optimizasyonu (Tablo 1 ve 2) optimize etmek zaman alacaktır. Büyük şirketler tarafından hibridomlar yapılan veya üretilen antikorlar 01:02 dan 1:2000 her yerde değişir, fakat en iyi sonuç için üretici tarafından sağlanan yönergelere emin olun konsantrasyonları olabilir. Antikorun üretildiği ev sahibi, aynı zamanda dikkat edilmesi gerekir. Keçi antikorları ile karıştırılarak koyun da çapraz türleri tanıma (veriler gösterilmemiştir) nedeniyle yüksek arka planda bu kombinasyon sonucu olarak birincil ve ikincil antikor kaçınılmalıdır. Alexa-Fluor orta dereceli içinry antikorlar, konsantrasyon set hemen hemen herhangi bir antikor 1:500 de kullanılabilir. Bu raporda açıklanan BALIK / co-analizleri IF diğer dezavantajı hücreler tespit ve formaldehit ve deterjan (Şekil 1) kullanarak permeabilize edilmiştir sonra, kararlı durumda olan yerde RNA yakalar olduğunu.

Ancak, canlı hücrelerde RNA görüntüleme çoğunlukla gibi GFP gibi floresan proteinleri tarafından etiketlenir viral RNA genomu varyasyonları kullanarak, aracı ^20-22 çeşitli yoluyla elde edilmiştir. Bununla birlikte, canlı hücreler içinde RNA Lokalizasyon tanımlamak için ek aracı yüzey devam eder. Bu yeni yöntemler Ispanak ^{23, 24} vasıtası SNAP veya MTRIP ² tarafından etiketleme RNA içerir. Bu teknikler aynı zamanda bir parçası mikroskop ile mRNA tespit amacıyla mRNA etiketlemek için tasarlanmış olması gerektiğini yüzeylerde eklemeden önce veya hücre geçirgenliği gereksinimi de dahil olmak üzere birkaç dezavantajları muzdarip. Gerçekten de, büyük AdvaBu raporda özetlenen FISH analiz ntage yerli RNA en fizyolojik ilgili sonuçlara yol değişmeden olduğu gerçeği yatıyor.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
18mm lamelleri	VWR	48380 046
% 16 paraformaldehit	JT Baker	S898-07	% 4 yapmak için: 5 damla NaOH ile 60 ° C 500ml 1XDPBS içinde 20g eritin. -20 ° C'de ısı ve mağaza kapatma 7.2 pH 70 aşmayın ° C!
Triton-X	OmniPur	9400
Mikro Zehir Jel Ekstraksiyon Kiti	Roche	D6294-02
DIG RNA Etiketleme Mix	Roche	11277073910
Transkripsiyon T7 RNA polimeraz	Invitrogen	18033-019
Hızlı Spin Sütunlar	Roche	11814427001
DNase I	Invitrogen	18047-019
1X DPBS	Gibco	14190-250
Formamid	EMD	FX0420-8
tRNA	Invitrogen	15401-021
RNaz OUT	Invitrogen	10777-019
Floresan Antikor Enhancer DIG Algılama için # 4 (engelleme çözüm) ayarlayın	Roche	1768506
Alexa Fluor sekonder antikorlar	Invitrogen	Tablo 2'ye bakınız
Hibridizasyon Fırını	Boekel Bilimşan birçok çıkar	Model 24100
Lamlar	VWR	48300-047
Immunomount	Thermoscientific	9990402

Anti-DIG antikoru Türlerinin (seyreltme; şirketi, katalog numarası)	Renkler	Alexa Fluor used (1:500)
Fare (1:500; Sigma, B7405)	yeşil	Alexa Fluor 488 eşek anti-fare (Invitrogen, A21202)
	kırmızı	Alexa Fluor 594 eşek anti-fare (Invitrogen, A21203)
	mavi	Alexa Fluor 647 eşek anti-fare (Invitrogen, A31571)
Koyun (1:200; Roche, 11.376.623)	yeşil	Alexa Fluor 488 eşek anti-koyun (Invitrogen, A11015)
	kırmızı	Alexa Fluor 594 eşek anti-koyun (Invitrogen, A11016)
	mavi	Alexa Fluor 647 eşek anti-koyun (Invitrogen, A21448)