蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

要約

蛍光その場でハイブリダイゼーション（FISH）法は視覚的に蛍光顕微鏡を用いてウイルスゲノムRNAを検出するために開発されました。プローブをハイブリダイゼーションと免疫蛍光技術の組み合わせを用いて同定することができるウイルスRNAに特異性で作られています。この手法は、細胞内のウイルスの人身売買のイベントの制御に関する情報を提供し、定常状態でウイルスRNAまたはDNAの局在を同定するという利点があります。

要約

細胞はウイルス複製のためのエネルギーや資源を流用するのに役立つ正常な細胞機能に固有の変更を誘発感染するウイルス。宿主細胞の機能の多くの側面は、通常、募集宿主細胞タンパク質と機械そのウイルスの遺伝子産物の発現により、ウイルスによって徴用されています。また、de novoの感染時にセルの領域（ターゲットとするモバイル小胞とモータータンパク質の上でウイルスエンジニア特定の膜小器官またはタグを、ウイルス共同OPT分子モータータンパク質は、核を対象とする。以降では、ウイルスの組み立て時に、彼らは携帯電話ハイジャックされウイルスの組み立てに役立ちます機械）。以下は、ウイルスは、特にRNAゲノムを持つものは、タンパク質とRNAの両方のコンポーネントの細胞内輸送を調整し、それらが細胞内の特定の遺伝子座での感染性粒子のアセンブリを達成する方法をどのように理解されています。 RNAの局在化の研究は、以前の仕事に始まりました。 EMは、下等真核生物の開発bryosと神経細胞は、生物学的に重要な情報を提供し、また、遺伝子発現カスケードのプログラミングでRNAの局在化の重要性を強調した。他の生物と細胞システムの研究では、同様の重要な情報が得られている。ウイルスは絶対寄生虫であり、複製するためにそれらの宿主細胞を利用する必要があります。したがって、RNAウイルスが子孫ウイルス粒子¹に、核から、核膜孔を介して、細胞質を通って最終的な宛先のいずれかに彼らのRNAゲノムを指示する方法を理解することが重要です。

FISHは、ウイルスRNAの定常状態の局在の変化を識別するために有用なツールとして機能します。免疫蛍光法（IF）の解析²²と組み合わせると、FISH / IFの共同分析では、ウイルスRNAの³タンパク質の共局在についての情報を提供します。この分析は、したがって、他の生化学的または生物物理学によってRNA-タンパク質相互作用をテストするための良い出発点を提供しています単独での共局在から^4,5のテストでは、相互作用の特定であるための十分な証拠はありません。このような方法を用いてウイルスRNAの局在化の研究に、豊富な情報は、ウイルスと細胞のRNAの人身売買のイベント^6の両方で得られている。例えば、HIV-1感染細胞の核内でRNAを生成しますが、RNAは、細胞質に翻訳されています。つのキーウイルスタンパク質が欠落している（改訂^）7、ウイルスRNAのFISHは、ウイルス複製のブロックが核⁸ HIV-1ゲノムRNAの保持によるものであることを明らかにした。

ここでは、 その場でウイルスゲノムRNAの視覚的な分析手法を提案する。方法は、標識したRNAプローブを使用しています。このプローブは、ウイルスのゲノムRNAと相補的になるように設計されています。アンチセンスRNAプローブのin vitro合成中に、ジゴキシゲニン（DIG）で修飾されているリボヌクレオチドは 、in vitro で transcrに含まれていますiption反応。プローブは、細胞内の標的mRNAにハイブリダイズした後にFISH / IFを実行するときに、その後の抗体標識のステップ（ 図1）は、mRNAの局在だけでなく、目的のタンパク質を明らかにする。

プロトコル

1。プローブ調製

1. ダイジェスト1時間37℃でのin vitro転写ベクター、PKS（+）POL Kpn1酵素と236nt ^9μgの、アガロースゲル上で線状化DNAの製品を実行します。断片は、約2500 bpのでなければなりません。
2. ゲルの断片を切り取り、ロシュ社のマイクロ溶出ゲル抽出キット（使用されるすべての試薬 ​​は、表1に記載されています）を使用して精製する。 30μlの溶出バッファーの最後の溶出を実行します。精製を確認するためにアガロースゲル上で製品の5μlを実行します。
3. 2時間37℃ロシュDIG RNAラベリングキットとインキュベートを用いたin vitro転写反応（下記レシピ参照） に混ぜる。

in vitro転写反応で ：

直鎖状DNA	23μlの
1X DIG RNAラベリングミックス（ロシュ）	4μlの
1Xテリグマンnscriptionバッファ	8μlの
20UのRNase OUT	1μlの
80U T7 RNAポリメラーゼ	4μlの
合計	40μlの

4. 15分間37℃でのDNase Iとインキュベート228 Uを追加します。
5. 20mMの最終濃度にEDTA pHが8.0を加えることによって反応を停止します。
6. メーカーによって指定されたロシュからクイックスピンカラムを用いて反応を浄化する。
7. 1/10量のDEPC処理3M NaOAc pHが5.2と氷冷95％エタノールを2.5倍量で沈殿させることにより、プローブを精製します。混合し、一晩に30分間-80℃でインキュベートする。
8. 15000×gで4℃15分°Cのためのプローブを遠心分離します。
9. 上清を除去し、氷冷70％エタノールでペレットを洗浄する。 15000×gで4℃5分°Cのために再度遠心します。
10. 上清を除去し、ペレットを乾燥させます。 50μlのwにペレットを再懸濁し10 UインビトロジェンRNaseを含むOUTアテル（デオキシリボヌクレアーゼ/ RNaseフリー）。
11. 吸光光度法によるプローブの濃度（260 nmで測定RNA）を推定し、ng /μLの5の濃度に希釈する。 -20℃でアリコートで店短期使用、または-80℃で長期保存のために。これは、インターアッセイの比較を行うので、このためのアリコートを節約することをお勧めします。

2。細胞固定

1. 収穫時に最終的にコンフルエントには約70〜80％ですので、それは、未処理、滅菌したカバーガラス上にシード付着細胞に最初に重要である。非接着細胞の場合は、通常どおりに成長したときに収集する準備ができて、1時間に0.01％（w / v）のポリ-L-リジン（シグマアルドリッチ社製）で処理したカバースリップでそれらをインキュベートする。典型的な12ウェルのポリスチレン組織培養プレート（3.8 cm ^2）のために、150,000細胞（例えば、HeLa細胞）をトランスフェクション前に24時間でメッキされています。非接着細胞は、感染またはトランスフェクトいつものようにと広告を許可することができますここで固定^3の前にガラスカバースリップに。
2. メディアを破棄し、1分間蒸留水（DPBS）で調製した1Xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄する。ジエチル（DEPC、Sigma-Aldrich社、Inc。）を処理1X PBSは、しかし、未処理のPBSは、それがRNaseの酵素が含まれる場合がありますできないため、使用することができます。
3. PBSを捨て、細胞を完全にカバーするのに十分な4％パラホルムアルデヒドを追加します。 15から20分間インキュベートします。
4. paraformaldeyhydeを破棄し、1分間1X DPBSで細胞を洗浄する。
5. DPBSを捨てて、0.1 Mグリシン（1X DPBSに溶解）を追加します。 10分間インキュベートする。
6. グリシンを破棄し、1分間1X DPBSで細胞を洗浄する。
7. DPBSを破棄し、トリトン-X（1X DPBSに溶解した）0.2％を追加します。 5〜10分間インキュベートします。核小体や核膜タンパク質を染色する場合は5分以上またはタンパク質の局在化のためにトリトンX-100は、拡散になると、透過性。
8. トリトンX-100を破棄し、一度に洗う1分間1X DPBS。
9. 長期保存のために、最大4ヶ月までは4℃で70％エタノールストアでPBSを交換してください。また、1X DPBSで複数回洗浄し、FISHに進みます。

3。 蛍光 in situハイブリダイゼーション （FISH）

1. カバーガラスをエタノールに格納されている場合は、1X DPBSでエタノールを交換し、細胞が30分間再水和することができます。カバーグラスを4℃で保存されている場合は水分補給を一晩行うことができます
2. 1分間1X DPBSでカバーガラスを洗浄する。
3. きれいにし、それらをよくラベルに注意しながら上にカバースリップをインキュベートするためにスライドを準備します。
4. 18ミリメートルカバースリップ、スライドにDNase溶液（市販の25単位/カバースリップ）、50μlを加える。それはセル側を下に置き、室温で15分間静置している、カバースリップを追加します。
5. 1分間1X DPBSでカバーガラスを洗浄する。
6. カバースリップあたり50μlのハイブリダイゼーション混合物（以下のレシピを参照してください）​​に追加スライドと42℃16〜18時間のためにカバーガラスの細胞面を下にインキュベート℃にインキュベーションは、50％ホルムアミド、2×SSPEミックス（12.5ミリリットルの脱イオンホルムアミド、2.5ミリリットル20X SSPE、10 mlの水）を含むトレイで実行する必要があります。

ハイブリダイゼーションミックス（1カバースリップのために、50μL）：

在庫量	材料（最終濃度）
25μlの	ホルムアミド、50％（イオン、任意のソース）
5μlの（10 mg / mlの）	tRNAは、1 mg / mlの（シグマアルドリッチ社）
5μlの（20Xの）	SSPE、2X
5μlの（50Xの）	Denharts、5X
0.125μL（5ユニットの）	RNaseのOUT
5μlの（5、25 ngのng /μlに）	プローブ
5μlの	最終的なをするH 2 O DEPC、ボリュームを50μl

7. 42℃15分間50μlの50％ホルムアミド（1X DPBSで希釈した）℃でインキュベートカバーガラスの細胞面を下
8. 5分ごとに42℃で50μlの2X SSPE（20X SSPEは1X DPBSで希釈した）にそれらの細胞側を下にインキュベートすることにより、2X SSPEで二度カバーガラスを洗う
9. 1分間1X DPBSにカバースリップを洗ってください。

4。免疫蛍光染色

1. 30分間、50μlの1Xロシュブロッキング溶液（1×DPBSで希釈した10Xのロシュ社のブロッキング溶液）にそれらの細胞側を下に置くことによって、カバースリップをブロックします。
2. 37℃で1時間50μlの一次抗体溶液にカバーガラスの細胞面を下にインキュベートします。抗DIG抗体は1Xブロッキング溶液中で、製造元の指示に従って希釈する必要があります。他の抗体は、タンパク質を染色するために使用されている場合は、それらが使用されるすべての抗体は、異なるホスト仕様から導出されていれば正しい濃度で添加してもよいIES。
3. 1X DPBSで10分間カバースリップを洗ってください。
4. 37℃で1時間50μlの二次抗体溶液にカバーガラスの細胞面を下にインキュベートします。のAlexa Fluor®標識抗体（Invitrogen）を色の範囲を生成するために使用することができ、1Xブロッキング溶液、1X DPBSで1:500で使用されます。
5. 1X DPBSで10分ごとに倍カバースリップを洗ってください。
6. ワットマン紙の上にカバーガラスの細胞面を上にして乾かします。光と漂白への曝露を避けるために、カバースリップをカバーするようにしてください。
7. すべての液体が蒸発した後、8μlのImmunoMount（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用して、新鮮なスライドにカバースリップをマウントします。静かに気泡を除去するためにカバースリップをタップします。
8. 所定の位置に固定するためにカバースリップの端をマニキュア適用されます。
9. 顕微鏡技術によるRNAおよびタンパク質の可視化も、この技術の成功に不可欠です。それが鍵となりますので、使用する顕微鏡の設定は、視覚化を助けたり、妨げることができます顕微鏡の設定は正しく設定され、指定された実験では1つのサンプルから別の一貫性を保つことができます。詳細顕微鏡の設定については、光学系と抗体の組み合わせは、参照の^1,10を参照^してください。

5。代表的な結果

ウイルスRNA染色の例を図2に見ることができます。小細胞punctaeは珍しいものではありませんが、HIV-1ウイルスRNAは、大部分はびまん性に表示された細胞質全体に見られている。特異性は全く蛍光を表示しない周囲の細胞に陽性細胞を比較することによって見ることができます。これは核の明るいシグナルとして可視化することができ、細胞質内RNAの蛍光信号の不足などの導入で述べたように、規制のRevタンパク質を欠いているHIV-1は核内に保持されるRNAを生成します。細胞タンパク質の過剰発現はまた、HIV-1ウイルスRNAの分布をシフトさせることができます。 図2の、エンドソーム小胞輸送に関与するタンパク質の過剰発現（例えば、RAB7相互作用するリソソーム蛋白質^（RILP）11またはN-末端削除^{RILP（RILPN）11}と、ダイニン運動機能を妨げるタンパク質は、[例えばp50/dynamitin ^{1、 12]は} 、FISH分析により決定されたウイルスゲノムRNAの正常な定常状態の局在を妨げるRILP発現は微小管組織の中心^{（MTOC）13〜}ウイルスゲノムRNAの再局在化につながる; RILPN後半分散内のエンドソームダイニンモーター複雑な¹⁴ p50/dynamitinブロックダイニンモーターとリリースの大サブユニットの^集成 P150にバインドできないために、細胞質は、後期エンドソームでなく、細胞周囲にウイルスゲノムRNAとHIV-1構造タンパク質^1（ 図2）ウイルスゲノムRNAの感染性に重要な貢献者の定常状態の局在化の操作は、ウイルス粒子は、治療薬の最終的な開発の鍵となります。我々の手では、ウイルスRNAは、早ければ3時間後にトランスフェクションと感染¹⁰などのセルに表示され、12時間することによって、このFISH法により容易に観察可能になります。

図1。 FISH / IFの共同分析のためのプロトコルのフローチャートである。細胞はカバースリップの上に成長し、パラホルムアルデヒドで固定されています。細胞はどちらFISH / IF用に使用したり、ストレージの70％エタノールに格納される前にグリシンおよびTriton-Xの治療が行われます。ストレージ用の脱水細胞はFISH / IFに進む前に1X DPBS（DEPC処理PBS）で再水和されています。細胞はDNase Iで処理し、プローブとハイブリダイズするために一晩放置されています。一度ハイブリダイゼーションが完了すると、細胞は同様にSSPEと同じように、ホルムアミドで洗浄し、最後の1X DPBSリンスされています。ブロッキング液とのインキュベーションに続いて、セルに適用され一次抗体。洗浄後、二次抗体が適用されます。 1X DPBS二最後の洗浄では、イメージングのためのカバースリップ上に乾燥させ、スライド上にマウントされた染色の手順を実行します。

図2。 FISH / IF共同分析を用いて代表的な結果。）HIV-1は、細胞タンパク質の過剰発現（RILP、p50/DynamitinとRILPΔN（アミノ末端欠失変異体））を引き起こすコンストラクトでHeLa細胞に、いくつかのケースでトランスフェクトされる。 FISH / IF共同分析を行った：RNAを区別するためにG3BPまたはLAMP1（赤）のいずれかで緑色で識別されます。 B）HIV-1はHeLa細胞で発現させ、異なる時点で収集されます。細胞タンパク質のhnRNP A1は、赤色に染色されている間、ウイルスRNAの発現は、緑色で追跡されます。サイズバーは10μmである。画像は、文献^1（; RILP、p50/Dynamitin、とRILPでるパネルから選択して数字）から変更^、17（パネルB）。

ディスカッション

FISH / IFの共同分析では、現在^9,15,16洗練された細胞内でウイルスRNAを可視化する信頼性の高い方法です。数年にわたって、我々はRNAを染色の洗練された方法を開発した。この手法は、プローブが標的RNA ¹⁷に固有のもので設けられたセルの種類の幅広い使用することができます。 DIGプローブを標識することによって、我々は単純な染色によるRNAを可視化することが可能である。 RNAと他のタンパク質を染色するが結合されたときに、FISH / IF共同分析は、細胞の構造と蛋白質/ RNAの局在を観察するための強力なツールになります。

RNA検出の特異性はかなり高いです。これは図2に示されています。ウイルスゲノムRNAの局在化に焦点を当てたオリジナル作品の一部で、FISHは、Revの欠如が核¹⁸でウイルスRNAをトラップことを確立した。これ以来、ウイルスゲノムRNAの局在化に関する豊富な新しい情報がtechniquを使用して得られたeは、ここで概説した。過剰発現細胞のタンパク質によって、特定の集団としないウイルスRNAすべてのセルの異なる領域にローカライズするために強制することができます。のhnRNP A2がでsiRNAによって枯渇した場合に得られる表現型HIV-1発現細胞を¹³に似ているRILPの過剰発現は、RNAが目に見えてMTOCに蓄積させる。 （携帯周囲に細胞内ドメインからのウイルスゲノムRNAのリリースでは、ダイニン重鎖^1の結果のp50/Dynamitin過剰発現やノックダウン：ウイルスゲノムRNAはマイナス端モータータンパク質、ダイニンを無効にすることにより、細胞周囲にプッシュすることができます図2）。彼らはもはや積極的にjuxtanuclearドメインに局在しているため、もはやダイニンモーターをバインドされることはありませんRILP、RILPΔNの変異体は、分散するには、細胞質に（LAMP1でタグ付けされた）エンドソーム。これらの結果は、HIV-1ゲノムRNAの、特にプラスチック製の人口の概念を指すようHIV-1ゲノムの異なるプールウイルス複製サイクルの中で時々識別可能な役割と存在するRNA。これらの同じ概念は、すでにこのmRNAによってコードされるタンパク質、ギャグ¹⁹の同定されている。

抗体の選択性と可用性に関連するFISH / IFの共同分析の用途に制限があります。一次および二次抗体の最適な組み合わせの最適化、およびそれらの濃度は、（ 表1＆2を参照） を最適化するために時間がかかります。大手企業によるハイブリドーマから作られた、または産生された抗体は、1:2から1:2000にどこでも異なる濃度を持っていますが、最良の結果を得るために製造元から提供されているガイドラインに従ってくださいすることができます。抗体が生成されているホストも考慮の下で撮影する必要があります。ヤギ抗体との混合の羊はまた、クロス種認識（データは示さず）に起因する高いバックグラウンドでこの組み合わせの結果として、一次および二次抗体は避けるべきである。アレクサ·弗素seconda用RY抗体は、濃度は、セットのほぼすべての抗体を1:500で使用することができます。このレポートで説明したようにFISH /共同分析IFへの他の欠点は、細胞を固定し、パラホルムアルデヒドと洗剤（ 図1）を使用して透過された後、それが定常状態でその位置でRNAを捕捉します。

しかし、生細胞内RNAイメージングは、主にGFPなどの蛍光タンパク質でタグ付けされたウイルスRNAゲノムのバリエーションを使用して、手段^{20から22まで}のさまざまなを実現しました。しかし、生細胞中のRNAの局在を同定するための追加手段が表面に進みます。これらの新しいメソッドは、ほうれん草^{23、SNAP 24}の手段、またはMTRIP ²タギングRNAを含んでいます。これらの技術はまた部分が顕微鏡でmRNAを検出するためにmRNAをタグ付けするように設計されなければならないこと基板を追加したりする前に、細胞を透過処理するための要件を含むいくつかの欠点がある。確かに、主要なアドバこのレポートで概説したFISH解析のntageは、ネイティブのRNAが最も生理学的に関連性の高い結果につながる不変であるという事実にある。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
18ミリメートルカバースリップ	VWR	48380 046
16％パラホルムアルデヒド	JTベーカー	S898-07	百分の四を作るために：5滴NaOHで60°Cで500mLに1XDPBSで20グラムを溶かす。 -20℃で、熱や店舗から7.2へのpH 70を超えないようにしてください°C！
トリトン-X	OmniPur	9400
マイクロ溶出ゲル抽出キット	ロシュ社	D6294-02
DIG RNAラベリングミックス	ロシュ社	11277073910
転写T7 RNAポリメラーゼ	インビトロジェン	18033-019
クイックスピンカラム	ロシュ社	11814427001
DNアーゼI	インビトロジェン	18047-019
1XのDPBS	ギブコ	14190-250
ホルムアミド	EMD	FX0420-8
tRNAの	インビトロジェン	15401-021
RNaseのOUT	インビトロジェン	10777-019
蛍光抗体エンハンサーは、DIG検出のための＃4（ブロッキング溶液）を設定します。	ロシュ社	1768506
のAlexa Fluor®二次抗体	インビトロジェン	表2を参照してください。
ハイブリダイゼーションオーブン	Boekel科学他の同種	モデル24100
Microslides	VWR	48300-047
Immunomount	Thermoscientific	9990402

抗DIG抗体の種（希釈;会社、カタログ番号）	色	のAlexa Fluor使用（1:500）
マウス（1:500、Sigma社、B7405）	緑	のAlexa Fluor 488ロバ抗マウス（Invitrogen社、A21202）
	赤	Alexa Fluor 594のロバ抗マウス（Invitrogen社、A21203）
	青	のAlexa Fluor 647ロバ抗マウス（Invitrogen社、A31571）
羊（1:200;ロシュ、11376623）	緑	のAlexa Fluor 488ロバ抗ヒツジ（Invitrogen社、A11015）
	赤	Alexa Fluor 594のロバ抗ヒツジ（Invitrogen社、A11016）
	青	のAlexa Fluor 647ロバ抗ヒツジ（Invitrogen社、A21448）