Обнаружение вирусной РНК с помощью флуоресцентного<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация (FISH)

Резюме

Флуоресценции На месте Гибридизации (FISH) был разработан метод визуального обнаружения вирусной геномной РНК с помощью флуоресцентной микроскопии. Зонд сделал со спецификой с вирусной РНК, которые затем могут быть идентифицированы с помощью комбинации гибридизации и иммунофлюоресценции техники. Этот метод имеет то преимущество, определения локализации вирусной РНК или ДНК в стационарном состоянии, предоставление информации по контролю за оборотом событий внутриклеточных вирусов.

Аннотация

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles ¹.

FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis ²², FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA³. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests ^4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events ⁶. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) ⁷, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus ⁸.

Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

протокол

1. Подготовка зонда

1. Дайджест 1 мкг в векторном транскрипции пробирке, ПКС (+) пол 236nt ⁹ с Kpn1 фермента при 37 ° С в течение 1 часа и запустить продукт линеаризованной ДНК в агарозном геле. Фрагмент должна быть около 2500 базисных пунктов.
2. Вырезать фрагмент из геля и очищают использовании Roche Micro элюировать гель Добыча Kit (все реагенты, используемые перечислены в Таблице 1). Выполните окончательное элюирование в 30 мкл буфера для элюции. Выполните 5 мкл продукта на агарозном геле для проверки очистки.
3. Смешайте в пробирке транскрипции реакции (см. рецепт ниже), используя Рош DIG РНК маркировке комплекта и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 2 часов.

В ответ транскрипции пробирке:

Линеаризованной ДНК	23 мкл
1X DIG РНК маркировке смеси (Roche)	4 мкл
1X Траnscription буфер	8 мкл
20U РНКазы OUT	1 мкл
80У Т7 РНК-полимеразы	4 мкл
Общий	40 мкл

4. Добавить 228 U из ДНКазы I и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 15 мин.
5. Остановить реакцию добавлением EDTA рН от 8,0 до конечной концентрации 20 мМ.
6. Очисти реакции с помощью быстрого Столбцы Спин от Roche, указанных изготовителем.
7. Очистите датчик от осадков с 1/10 объема DEPC обработанных 3М NaOAc рН 5,2 и 2,5 объемов ледяной 95% этанола. Смешать и инкубировать при температуре -80 ° C в течение 30 минут, чтобы за одну ночь.
8. Центрифуга зонда в течение 15 мин при 4 ° С на 15000 х г.
9. Удалить супернатант и промыть осадок в ледяной 70% этанола. Центрифуга в течение 5 мин при 4 ° C при 15000 х г.
10. Удалить супернатант и высушите осадок. Ресуспендируют гранул в 50 мкл WВодный (ДНКазы / РНКазы бесплатно), содержащей 10 U Invitrogen РНКазы OUT.
11. Оценка концентрации зонда спектрофотометрически (мера РНК при 260 нм), и разбавить до концентрации 5 нг / мкл. Хранить в аликвоты при -20 ° С для краткосрочного использования или -80 ° C для длительного хранения. Рекомендуется выполнять в том сравнений анализ так сохранения аликвоту для этого.

2. Сотовые фиксации

1. Это изначально важно семена прилипшие клетки на необработанные, стерильные покровные стекла, так что окончательный слияния на сбор составляет примерно 70-80%. Для не прилипшие клетки растут как обычно, и когда будете готовы к сбору, инкубировать их покровные, которые были обработаны с 0,01% в / о поли-L-лизина (Sigma-Aldrich, Inc) в течение 1 часа. Для типичного 12-и полистирол культуре ткани пластины (3,8 см ^2), 150 000 клеток (например, HeLa) высевают на 24 часов до трансфекции. Номера прилипшие клетки могут быть инфицированы или трансфекции, как обычно, и позволила объявлениеЗдесь в стеклянной крышкой скользит перед фиксацией ^3.
2. Откажитесь от средств массовой информации и промыть клетки 1X фосфатном буферном растворе, подготовленный в дистиллированной воде (DPBS) в течение 1 мин. Диэтилпирокарбонатом (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc), обработанные 1X PBS также могут быть использованы, однако необработанные PBS не может, как она может содержать РНКазы ферментов.
3. Откажитесь от PBS и добавить 4% параформальдегида, достаточно, чтобы покрыть клетки полностью. Выдержите в течение 15-20 мин.
4. Откажитесь от paraformaldeyhyde и промыть клетки 1X DPBS в течение 1 мин.
5. Откажитесь от DPBS и добавить 0,1 М глицин (растворяется в 1X DPBS). Инкубировать 10 мин.
6. Откажитесь от глицина и промыть клетки 1X DPBS в течение 1 мин.
7. Откажитесь от DPBS и добавить 0,2% Triton-X (1X, растворенных в DPBS). Выдержите в течение 5-10 мин. Если окрашивания ядрышек или ядерные белки оболочки, permeabilize с Тритон Х-100 не более чем на 5 минут или белка локализация станет расплывчатым.
8. Отменить Тритон Х-100 и мыть один раз в1X DPBS в течение 1 мин.
9. Для длительного хранения, заменить PBS с 70% этанола и хранят при температуре 4 ° C в течение четырех месяцев. Кроме того, еще раз промыть с 1X DPBS и перейти на рыбу.

3. Флуоресценции в гибридизация (FISH)

1. Если покровные хранились в этанол, заменить этиловый спирт с 1X DPBS и позволяют клеткам увлажняет в течение 30 мин. Регидратации можно сделать на ночь, если покровные хранятся при температуре 4 ° C.
2. Вымойте покровных с 1X DPBS в течение 1 мин.
3. Подготовка слайдов для инкубации на покровные, заботясь, чтобы очистить и маркировать их хорошо.
4. Для 18мм покровное, добавить 50 мкл ДНКазы решение (25 ЕД / покровное, имеющиеся в продаже) на слайде. Добавить покровное, будучи уверенным, чтобы поместить его клетку вниз, и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
5. Вымойте покровных с 1X DPBS в течение 1 мин.
6. Добавить 50 мкл смеси гибридизации (см. рецепт ниже) на покровное наслайдов и инкубировать стороны покровного ячейку вниз в течение 16-18 часов при температуре 42 ° C. Инкубационный должны быть выполнены в лоток, содержащий 50% формамида, 2X ГНПП смеси (12,5 мл деионизованной формамида, 2,5 мл 20х ГНПП, 10 мл воды).

Гибридизация Mix (для одного покровное, 50 мкл):

Количество акций	Материал (в конечной концентрации)
25 мкл	Формамид, 50% (деионизированной, любой источник)
5 мкл (10 мг / мл)	тРНК, 1 мг / мл (Sigma-Aldrich, Inc)
5 мкл (20х)	ГНПП, 2X
5 мкл (в 50 раз)	Denharts, 5X
0,125 мкл (5 единиц)	РНКазы OUT
5 мкл (25 нг 5 нг / мкл)	Зонд
5 мкл	H 2 O DEPC, чтобы сделать окончательныйОбъем 50 мкл

7. Инкубируйте покровные клетки вниз в 50 мкл 50% формамид (разводится в 1X DPBS) в течение 15 мин при 42 ° C.
8. Вымойте покровные дважды в 2х ГНПП путем инкубации их клетки вниз в 50 мкл 2х ГНПП (20X ГНПП разводят в 1X DPBS) в течение 5 минут каждый при 42 ° C.
9. Промойте в покровных 1X DPBS в течение 1 мин.

4. Окрашивание иммунофлуоресценции

1. Блок покровные, размещая их клетки вниз в 50 мкл 1X Roche блокирование решения (10X Roche блокирующий раствор разводят в 1X DPBS) в течение 30 мин.
2. Инкубируйте покровные клетки стороны вниз в 50 мкл первичных антител решение в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Anti-DIG антител следует развести по направлению производителя в 1X блокирование решения. Если другие антитела, которые используются для окрашивания белков, они могут быть добавлены в правильной концентрации при условии, что все антитела, используемые, полученных из различных спецификации хостх годов.
3. Вымойте покровные в течение 10 мин в 1X DPBS.
4. Инкубируйте покровные клетки стороны вниз в 50 мкл вторичных решение антител в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Alexa Fluor-конъюгированных антител (Invitrogen) могут быть использованы для создания цветовой гаммы и используются в 1:500 в блокирующем растворе 1X, 1X DPBS.
5. Вымойте покровные два раза по 10 минут в каждом из 1X DPBS.
6. Высушите стороны покровные клетки на ватмане. Будьте уверены, чтобы покрыть покровные, чтобы избежать воздействия света и отбеливания.
7. Когда вся жидкость испарилась, смонтировать покровные на свежие слайды, используя 8 мкл ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc.) Мягко нажмите вниз покровное для устранения пузырьков воздуха.
8. Применение лака для ногтей по краям покровного стекла, чтобы закрепить его на месте.
9. Визуализация РНК и белков микроскопии также решающее значение для успеха этого метода. Настройки на микроскоп использовали могут способствовать или препятствовать визуализации, так что ключ, которыйНастройки на микроскопе правильно установить и быть последовательными от образца к образцу в данном эксперименте. Подробную информацию о настройках микроскопа, оптики и антител комбинации см. ссылки ^1,10.

5. Представитель Результаты

Например вирусной РНК окрашивания можно увидеть на рисунке 2. Вирусной РНК ВИЧ-1 видно по всей цитоплазме отображается диффузно по большей части, хотя и небольшой цитоплазматических punctae не являются редкостью. Специфика можно увидеть, сравнив положительных клеток в окружающие клетки, которые не проявляют флуоресценции. Как уже упоминалось во введении, ВИЧ-1, что не хватает регуляторный белок Rev производит РНК, которая сохраняется в ядре: это может быть представлен в виде ярких сигнала в ядре, а также отсутствие сигнала флуоресценции РНК в цитоплазме. Избыточная экспрессия клеточных белков также может смещения распределения ВИЧ-1 РНК вируса. На рисунке 2 , гиперэкспрессия белков, вовлеченных в торговлю эндосом пузырька (например, Rab7 взаимодействующих лизосомальных белков (RILP) ¹¹ или N-терминальной удален RILP (RILPN) ^11, и белки, которые сталкиваются с функцией динеин двигателя [например p50/dynamitin ^{1 12],} мешают нормальной стационарной локализации вирусной РНК генома, как это определено FISH анализ RILP выражение приводит к повторной локализации вирусной РНК геномная к организации микротрубочек центр (КТВМ) ^13;. RILPN рассеивает поздние эндосомы в Цитоплазма в связи с невозможностью привязки к P150 ^{Клееный} из динеин автотранспортного комплекса ¹⁴ и p50/dynamitin блоков большой субъединицы динеин двигателя и выбросы поздние эндосомы, а также вирусные и геномной РНК ВИЧ-1, структурные белки периферии клетки ¹ (рис. 2). манипуляции стационарного локализации вирусной РНК генома, основной вклад в заразностивирусных частиц, будет иметь решающее значение для последующего развития терапии. В наших руках, вирусная РНК появляется в клетке уже 3 часа после трансфекции и инфекции ¹⁰ и становится легко наблюдать на этой рыбы технику на 12 часов.

Рисунок 1. Блок-схема протокола FISH / IF совместного анализа. Клетки, выращенные на покровных и затем фиксировали параформальдегида. Лечение глицина и Triton-X осуществляется до клетки, либо используются для FISH / IF или хранятся в 70% этанола для хранения. Клетки для обезвоженной хранения регидратации в 1X DPBS (DEPC обработанных PBS), прежде чем перейти к FISH / IF. Клетки обрабатывали ДНКазы I и оставляют на ночь для гибридизации с зондом. После гибридизации завершения клетки промывают формамида, а также с ГНПП, а окончательное 1X DPBS полоскания. Блокирование решение применяется к клеткам, а затем инкубации спервичных антител. После мытья вторичных антител применяются. Два последних моет в 1X DPBS завершения процедуры окрашивания, где на покровные сушат и установлены на салазках для работы с изображениями.

Рисунок 2. Представитель результатов с помощью FISH / IF совместного анализа.) ВИЧ-1 трансфекции в клетки HeLa, а в некоторых случаях с конструкциями, которые вызывают гиперэкспрессии клеточных белков (RILP, p50/Dynamitin и RILPΔN (амино-терминал удаление мутант)) . FISH / IF совместного анализа была выполнена: РНК, выявленных в зеленой либо G3BP или LAMP1 (красный), чтобы отличить. Б) ВИЧ-1, выражается в HeLa и собранные в различные моменты времени. Вирусные РНК выражение отслеживается в зеленый, а клеточный белок, hnRNP A1, окрашивается в красный цвет. Размер баров 10 мкм. Изображения, измененные из ссылки ¹ (выбрать данные из панелей; RILP, p50/Dynamitin и RILP deltaN)и ¹⁷ (группа В).

Обсуждение

FISH / IF совместного анализа является надежным методом для визуализации вирусной РНК в клетках, которая в настоящее время уточняется ^9,15,16. В течение нескольких лет, мы разработали более совершенный метод окрашивания для РНК. Этот метод может быть использован на широкий спектр типов клеток при условии зонд специфичен для РНК-мишени ^17. Называя зонд с DIG, мы способны визуализировать РНК простым окрашиванием. При окрашивании на РНК и белков в сочетании, FISH / IF совместного анализа стать мощным инструментом для наблюдения клеточных структур и белков / РНК локализации.

Специфика выявления РНК достаточно высок. Это показано на рисунке 2. В некоторых из оригинальных работ, которые направлены на вирусную РНК геномная локализация, FISH установлено, что отсутствие Rev ловушку вирусной РНК в ядре ^18. Так как эта, обильная новая информация о вирусных локализации геномной РНК была получена использованием techniquэлектронной изложены здесь. По гиперэкспрессией белка клеточного, конкретных групп населения, и не все из вирусной РНК может быть принужден к локализации в различных регионах ячейки. RILP гиперэкспрессия, который похож на фенотип, полученные при hnRNP A2 исчерпывается миРНК ВИЧ-1-экспрессирующие клетки ^13, приводит к тому, РНК заметно накапливаться в КТВМ. Геномной РНК вируса могут быть прижаты к периферии клетки, отключив минус-концу белка двигателя, динеин: p50/Dynamitin гиперэкспрессия или нокдаун динеин тяжелой цепи ^{1 приводит} к освобождению вирусного генома РНК из внутриклеточных доменов сотовой периферии ( Рисунок 2). Мутант RILP, RILPΔN, которые уже не связывает динеин двигателя, рассеивается эндосомы (помечены LAMP1) в цитоплазму, потому что они больше не активно локализованы на juxtanuclear области. Эти результаты указывают на понятие пластикового населения РНК ВИЧ-1 генома и, в частности, что различные бассейны ВИЧ-1 геномаРНК существует с иногда идентифицировать роль в репликации вируса. Эти же понятия уже определены для белка, кодируемого этой мРНК, Gag ^19.

Существуют ограничения на использование FISH / IF совместного анализа, связанные с выбором антител и доступность. Оптимизация лучшее сочетание первичных и вторичных антител и их концентрации, потребуется время, чтобы оптимизировать (см. Таблицу 1 и 2). Антитела из гибридом, или производятся крупными компаниями может иметь концентрациях, которые варьироваться от 1:2 до 1:2000, но обязательно следуйте указаниями производителя для достижения наилучших результатов. Хозяина, в котором антитела производятся также должны быть приняты в стадии рассмотрения. Смешивание овец с козьими антителами также следует избегать в начальной и средней антител, так как это сочетание приводит к высоким фоном из-за перекрестного признания видов (данные не представлены). Для Alexa Fluor-secondaры антител, концентрации могут быть использованы при 1:500 практически для любых антител в наборе. Другой недостаток FISH / IF совместного анализа, как описано в настоящем докладе, это отражает РНК в месте его нахождения в стационарном состоянии, после того, как клетки были зафиксированы и проницаемыми использованием параформальдегид и моющих средств (рис. 1).

Тем не менее, РНК изображений в живых клетках было достигнуто с помощью различных средств ^20-22, в основном используя вариации вирусных геномов РНК, помеченные флуоресцентными белками, такими как GFP. Тем не менее, дополнительные средства для выявления РНК локализация в живых клетках продолжать поверхность. Эти новые методы включают пометки РНК с помощью шпината ^23, SNAP ^24, или MTRIP ^2. Эти методы также страдает от нескольких недостатков, включая требования к permeabilize клетки перед добавлением субстратов или часть должна быть разработана, чтобы отметить мРНК в целях обнаружения мРНК с помощью микроскопа. Действительно, основные ADVAntage из FISH анализа, изложенные в этом докладе, заключается в том, что родной РНК неизменной, ведущие к наиболее физиологически релевантные результаты.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
18мм покровные	VWR	48380 046
16% параформальдегид	JT Baker	S898-07	Для 4%: Растворите 20 г в 500 мл 1XDPBS при 60 ° С с 5 капель раствора NaOH. рН до 7,2 с огня и хранят при температуре -20 ° C. Не превышает 70 ° C!
Triton-X	OmniPur	9400
Micro элюировать гель Добыча Kit	Roche	D6294-02
DIG РНК маркировке Mix	Roche	11277073910
Транскрипция Т7 РНК-полимеразы	Invitrogen	18033-019
Быстрый Столбцы Спин	Roche	11814427001
ДНКазы I	Invitrogen	18047-019
1X DPBS	Гибко	14190-250
Формамид	EMD	FX0420-8
тРНК	Invitrogen	15401-021
РНКазы OUT	Invitrogen	10777-019
Флуоресцентные антител Enhancer Набор для обнаружения DIG # 4 (блокирование решения)	Roche	1768506
Alexa Fluor вторичными антителами	Invitrogen	См. Таблицу 2
Гибридизация печи	Научно Boekelentific	Модель 24100
Microslides	VWR	48300-047
Immunomount	Thermoscientific	9990402

Виды анти-DIG антител (разбавление, компании, номер по каталогу)	Цвета	Alexa Fluor используемых (1:500)
Мышь (1:500; Sigma, B7405)	зеленый	Alexa Fluor 488 осел анти-мышь (Invitrogen, A21202)
	красный	Alexa Fluor 594 осел анти-мышь (Invitrogen, A21203)
	синий	Alexa Fluor 647 осел анти-мышь (Invitrogen, A31571)
Овцы (1:200; Roche, 11376623)	зеленый	Alexa Fluor 488 осла против овец (Invitrogen, A11015)
	красный	Alexa Fluor 594 осла против овец (Invitrogen, A11016)
	синий	Alexa Fluor 647 осла против овец (Invitrogen, A21448)