זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Summary

הקרינה באתרו (דגים) שיטת ההכלאה פותח כדי לזהות ויזואלית RNA הגנומי ויראלי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדיקה הוא עשה עם סגוליות על RNA ויראלי ניתן לזהות באמצעות שילוב של הכלאה וטכניקות immunofluorescence. טכניקה זו מציעה את היתרון של זיהוי לוקליזציה של רנ"א נגיפי או דנ"א על ​​המצב היציב, מתן מידע על שליטה של ​​אירועים הסחר תאיים וירוס.

Abstract

וירוסים להדביק תאים לעורר שינויים ספציפיים פונקציות תאים רגילים המשמשים להסיט את האנרגיה והמשאבים לצורך שכפול נגיפי. היבטים רבים של תפקוד התא המארח הם השתלטו על ידי וירוסים, בדרך כלל על ידי ביטוי של מוצרים גנים ויראלי סלולריים לגייס המארחות חלבונים מנגנונים. יתר על כן, וירוסים ספציפיים מהנדס האברונים קרום או תג על מנת שלפוחית ​​ניידים וחלבונים רכב למקד אזורים של התא (בזמן זיהום דה נובו, וירוסים משתלטים חלבונים רכב מולקולריים כדי למקד את הגרעין, לאחר מכן, במהלך הרכבת הנגיף, הם יוכלו לחטוף את הסלולרי מנגנונים שיסייעו באסיפה של וירוסים). פחות מובן כיצד וירוסים, במיוחד אלו עם הגנום RNA, לתאם את הסחר תאיים של חלבונים ושל רכיבים רנ"א וכיצד להשיג הרכבה של חלקיקים זיהומיות בבית לוקוסים ספציפיים בתא. המחקר של לוקליזציה RNA החלה במחקר מוקדם. לפתח אותם האיקריוטים נמוכותbryos תאים עצביים סיפק מידע ביולוגי חשוב, וכן הדגיש את החשיבות של לוקליזציה RNA בתכנות של מפלי ביטוי גנים. מחקר באורגניזמים אחרים ומערכות תאים הניב מידע חשוב דומה. וירוסים הם טפילים המחייבות וחייבים לנצל את התאים המארחות לשכפל. לכן, חשוב להבין כיצד וירוסים RNA לכוון את הגנום שלהם רנ"א מהגרעין, דרך נקבוביות הגרעין, דרך הציטופלסמה ועל לאחד היעדים הסופיים שלה, אל תוך חלקיקי וירוס צאצאי ^1.

דגים משמש ככלי יעיל לזיהוי שינויים לוקליזציה היציב של רנ"א נגיפי. בשילוב עם immunofluorescence (IF) ניתוח ^22, דגים / אם שיתוף ניתוחים יספק מידע על איתור משותף של חלבונים עם RNA ויראלי ^3. ניתוח זה ולכן מהווה נקודת התחלה טובה לבדוק RNA אינטראקציות חלבון ידי ביוכימי אחר או Biophysicalבדיקות ^4.5, מאז לוקליזציה שיתוף כשלעצמו אינו מספיק ראיות כדי להיות בטוח של אינטראקציה. בחקר נגיפי RNA לוקליזציה באמצעות שיטה כמו זו, מידע בשפע כבר זכה בשני אירועים נגיפיים הסלולר רנ"א סחר ^6. לדוגמה, HIV-1 מייצר רנ"א בגרעין של תאים נגועים אבל RNA מתורגם רק בציטופלסמה. כאשר חלבון נגיפי המפתח חסר (חזור) ^7, דג של רנ"א נגיפי גילה כי לחסום את התרבות הנגיף בשל החזקת של HIV-1 RNA הגנומי בגרעין ^8.

כאן, אנו מציגים את שיטת ניתוח ויזואלי של RNA הגנומי ויראלי באתרו. השיטה עושה שימוש בדיקה RNA שכותרתו. בדיקה זו נועדה להיות משלים את RNA הגנומי ויראלי. במהלך בסינתזה חוץ גופית של RNA antisense בדיקה, ribonucleotide כי הוא שונה עם digoxigenin (DIG) נכלל במבחנה transcription התגובה. לאחר בדיקה יש הכלאה כדי mRNA המטרה בתאים, לאחר תיוג נוגדנים שלבים (איור 1) יגלה לוקליזציה של ה-mRNA, כמו גם חלבונים בעלי עניין בעת ביצוע דגים / אם.

Protocol

1. בדיקה הכנת

1. תקציר 1 מיקרוגרם של של וקטור שעתוק במבחנה, PKS (+) pol 236nt ⁹ עם האנזים Kpn1 על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ולהפעיל את מוצר ה-DNA לינארית על ג'ל agarose. שבר צריך להיות כ 2500 BP.
2. חותכים את קטע מתוך ג'ל ולטהר באמצעות מיקרו רוש Elute ערכת חילוץ ג'ל (כל חומרים כימיים המשמשים מפורטים טבלה 1). בצע elution האחרון חיץ 30 elution μl. הפעלה 5 μl של המוצר על ג'ל agarose לאמת טיהור.
3. מערבבים בתגובה שעתוק במבחנה (ראו מתכון בהמשך) באמצעות ה-DIG רוש RNA תיוג ערכת דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.

בתגובה שעתוק במבחנה:

לינארית DNA	23 μl
1X DIG-RNA תיוג תערובת (Roche)	4 μl
1X Transcription חיץ	8 μl
20U RNase OUT	1 μl
80U T7-RNA פולימראז	4 μl
סך הכל	40 μl

4. הוספת 228 U של DNase אני דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
5. לעצור את התגובה על ידי הוספת EDTA pH 8.0 לריכוז סופי של 20 מ"מ.
6. לטהר את התגובה באמצעות עמודות סיבוב מהיר של רוש כמפורט על ידי היצרן.
7. לטהר את החללית על ידי משקעים עם 1/10 נפח pH DEPC שטופלו NaOAc 3M 5.2 ו 2.5 כרכים של אתנול קפוא 95%. מערבבים דגירה ב -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד לילה.
8. בצנטריפוגה החללית במשך 15 דקות ב 4 ° C על 15,000 X גרם.
9. הסר את supernatant ולשטוף גלולה באתנול קפוא 70%. סרכזת שוב 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס על 15,000 X גרם.
10. הסר את supernatant ומייבשים גלולה. Resuspend גלולה ב 50 W μlater (DNase / RNase חינם) המכיל 10 U Invitrogen RNase OUT.
11. להעריך את הריכוז של בדיקה על ידי spectrophotometry (RNA למדוד ב 260 ננומטר), וכן לדלל את ריכוז של 5 ng / μl. חנות aliquots ב -20 ° C לשימוש לטווח קצר, או -80 מעלות לאחסון ארוך טווח. מומלץ לבצע השוואות בין היתר כדי לחסוך assay aliquot לכך.

2. תא קיבוע

1. חשוב תחילה בתאי זרע חסיד על גבי זכוכית, coverslips שלא טופלו סטריליים כך confluency הסופי על קצירת הוא כ 70-80%. עבור מי שאינם חסיד תאים, לצמוח כרגיל וכאשר מוכן לאסוף, דגירה להם coverslips כי טופלו 0.01% w / v פולי-L-ליזין (Sigma-Aldrich, Inc) במשך שעה 1. על צלחת טיפוסית של 12 גם רקמת תרבות קלקר (3.8 ס"מ ^2), 150,000 התאים (למשל הלה) הם מצופה ב 24 שעות לפני transfection. הלא חסיד תאים יכולים להידבק או transfected כרגיל ואיפשר למודעהכאן כיסוי זכוכית תלושי לפני קיבוע ^3.
2. מחק את מדיה ולשטוף את התאים עם מי מלח 1X פוספט שנאגרו להכין מים מזוקקים פעמיים (DPBS) דקות 1. Diethylpyrocarbonate (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc)-1X יחס PBS עשוי לשמש גם, PBS מטופל עם זאת לא יכול מכיוון שהוא עלול להכיל אנזימים RNase.
3. מחק PBS ולהוסיף paraformaldehyde 4%, מספיק כדי לכסות את התאים לחלוטין. דגירה של 15-20 דקות.
4. מחק paraformaldeyhyde ולשטוף תאים עם 1x DPBS דקות 1.
5. מחק את DPBS ולהוסיף 0.1 מ 'גליצין (מומס 1x DPBS). דגירה של 10 דקות.
6. מחק גליצין ולשטוף את התאים עם 1x DPBS דקות 1.
7. מחק את DPBS ולהוסיף 0.2% Triton-X (מומס 1x DPBS). דגירה למשך 5-10 דקות. אם מכתים עבור חלבונים המעטפה nucleolar או גרעיני, permeabilize עם טריטון X-100 דקות לא יותר מ 5 או לוקליזציה חלבון יהיה מפוזר.
8. מחק טריטון X-100 ולשטוף פעם1X DPBS דקות 1.
9. עבור אחסון לטווח ארוך, להחליף PBS עם אתנול 70% וחנות על 4 מעלות צלזיוס במשך עד ארבעה חודשים. לחלופין, לשטוף שוב עם 1x DPBS ולהמשיך לדוג.

3. הקרינה של הכלאה באתרו (דגים)

1. אם coverslips אוחסנו אתנול, תחליף אתנול עם 1x DPBS ולאפשר לתאים rehydrate למשך 30 דקות. להחזרת נוזלים ניתן לעשות זאת בן לילה אם coverslips מאוחסנים 4 ° C.
2. לשטוף את coverslips עם 1x DPBS דקות 1.
3. להכין שקופיות כדי לדגור על coverslips על, מקפיד לנקות לתייג אותם היטב.
4. עבור coverslip 18mm, הוסף 50 μl של פתרון DNase (25 יחידות / coverslip, זמינים מסחרית) לשקופית. הוסף coverslip, להיות בטוח למקם אותו בצד התא למטה, דגירה אותו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
5. לשטוף את coverslips עם 1x DPBS דקות 1.
6. הוסף 50 μl תערובת ההכלאה (ראו מתכון בהמשך) לכל coverslip עלשקופיות דגירה בצד התא coverslip למטה H 16-18 ב 42 ° C. הדגירה יש לבצע במגש המכיל לפוראמיד 50%, 2X SSPE תערובת (12.5 לפוראמיד deionized מ"ל, 2.5 מ"ל 20X SSPE, 10 מ"ל מים).

מערבבים ההכלאה (למשל coverslip, 50 μl):

כמות המניות	חומר (בריכוז הסופי)
25 μl	לפוראמיד, 50% (deionized, כל מקור)
5 μl (של 10 מ"ג / מ"ל)	tRNA, 1 מ"ג / מ"ל ​​(Sigma-Aldrich, Inc)
5 μl (של 20X)	SSPE, 2X
5 μl (של 50X)	Denharts, 5X
0.125 μl (5 יחידות)	RNase OUT
5 μl (25 ng של 5 ng / μl)	בדיקה
5 μl	H 2 O DEPC, כדי להפוך את סופינפח 50 μl

7. דגירה coverslips בצד התא למטה לפוראמיד 50 50% μl (מדולל 1x DPBS) במשך 15 דקות על 42 ° C.
8. לשטוף את coverslips פעמיים 2X SSPE ידי דוגרים עליהם בצד התא למטה 50 μl 2X SSPE (20X SSPE מדולל 1x DPBS) 5 דקות כל אחד ב 42 ° C.
9. לשטוף את coverslips ב 1X DPBS דקות 1.

4. Immunofluorescence מכתים

1. חסום את coverslips ידי הצבתם לצד התא למטה 50 μl פתרון 1X חסימת רוש (Roche 10X פתרון חסימת מדולל 1x DPBS) למשך 30 דקות.
2. דגירה בצד התא coverslips את בתמיסה הנוגדן μl 50 ראשונית במשך שעה 1 ב 37 ° C. Anti-DIG נוגדנים יש לדלל לפי הכיוון של היצרן בפתרון 1X חוסם. אם נוגדנים אחרים נמצאים בשימוש כדי להכתים חלבונים, הם יכולים להוסיף בריכוז הנכון בתנאי שכל נוגדנים המשמשים נגזרות המפרט שורה אחרתies.
3. לשטוף את coverslips 10 דקות ב 1X DPBS.
4. דגירה בצד התא coverslips את בתמיסה הנוגדן μl 50 משנית שעה 1 ב 37 ° C. Alexa פלואוריד, מצומדות נוגדנים (Invitrogen) ניתן להשתמש כדי ליצור מגוון של צבעים והם משמשים ב 1:500 ב 1X, חסימת DPBS פתרון 1X.
5. לשטוף את coverslips פעמיים 10 דקות כל אחד DPBS 1X.
6. לייבש את הצד תא coverslips על נייר Whatman. יש להקפיד לכסות את coverslips כדי להימנע מחשיפה לאור הלבנה.
7. לאחר שכל הנוזל מתאדה, הר coverslips על שקופיות טריים באמצעות 8 ImmunoMount μl (Thermo Scientific, Inc). לטפוח בעדינות את coverslip לחסל את כל בועות האוויר.
8. החל לק לקצות coverslip לאבטח אותו במקומו.
9. ויזואליזציה של רנ"א וחלבונים על ידי שיטות מיקרוסקופיה הוא גם קריטי להצלחה של טכניקה זו. הגדרות מיקרוסקופ המשמש יכול לעזור או להפריע להדמיה כך מפתחהגדרות מיקרוסקופ להיות נכונה ולהיות עקבית ממדגם אחד למשנהו בניסוי נתון. הגדרות מפורטות עבור מיקרוסקופיה, אופטיקה ושילובים נוגדנים ראה הפניות ^1,10.

5. נציג תוצאות

דוגמה מכתים RNA נגיפי ניתן לראות באיור 2. RNA ויראלי של HIV-1 הוא ראה בכל הציטופלסמה המוצג diffusely על פי רוב, אם כי punctae cytoplasmic קטנה אינן נדירות. הספציפיות ניתן לראות על ידי השוואת תאים חיוביים לתאים הסמוכים המוצגים לא פלואורסצנטי. כפי שהוזכר במבוא, HIV-1, כי אין את החלבון הרגולטורי Rev מייצרת RNA אשר נשמרת הגרעין: זה יכול להיות דמיינו כאות בהיר בגרעין, וחוסר האות הקרינה RNA בציטופלסמה. ביטוי יתר של חלבונים תאיים הוא גם מסוגל להסיט את ההפצה של HIV-1 RNA ויראלי. באיור 2 חזק, ביטוי יתר של חלבונים המעורבים בסחר שלפוחית ​​endosomal (למשל, Rab7-אינטראקציה lysosomal חלבון (RILP) ¹¹ או N-סופני RILP נמחק (RILPN) ^11, חלבונים שמפריעים בתפקוד המוטורי dynein [למשל p50/dynamitin ^{1, 12],} להפריע לוקליזציה היציב הרגיל של ה-RNA הגנומי ויראלי כפי שנקבע על ידי ניתוחים דגים ביטוי RILP מוביל לוקליזציה מחדש של RNA הגנומי ויראליים ארגון microtubule מרכז (MTOC) ^13;. RILPN מפזר מאוחר endosomes בתוך הציטופלסמה בשל חוסר היכולת לאגד p150 ^דבוקה של המנוע מורכב dynein ¹⁴ וחוסם p50/dynamitin למקטע גדול של dynein המנוע משחרר מאוחר endosomes אלא גם גנטי נגיפי RNA HIV-1 חלבונים מבניים בפריפריה התא ¹ (איור 2). מניפולציה של לוקליזציה היציב של RNA הגנומי ויראלי, תורם המפתח מידבק שלחלקיקי נגיף, יהיה המפתח להתפתחות עתידית של הרפוי. בידינו, רנ"א נגיפי מופיע בתא כבר 3 שעות שלאחר transfection וזיהום ¹⁰ והופך ניתן לצפות בקלות על ידי טכניקה זו על ידי דג 12 שעות.

באיור 1. תרשים זרימה של פרוטוקול של דגים / אם שיתוף ניתוחים. תאים גדלים על coverslips ולאחר מכן קבוע עם paraformaldehyde. טיפולים של גליצין ו-טריטון X מבוצעות לפני התאים משמשים גם עבור דגים / אם או מאוחסנים אתנול 70% לאחסון. תאים מיובשים לאחסון הם rehydrated ב 1X DPBS (DEPC שטופלו PBS) לפני שהמשיכו בדרכם אל דג / אם. תאים מטופלים עם DNase אני והשאירו למשך הלילה כדי להכליא עם החללית. לאחר ההכלאה הושלמה, התאים נשטפים עם לפוראמיד, כמו גם עם SSPE, וכמה האחרונים 1x DPBS לשטוף. פתרון חסימת מוחל על התאים, ואחריו הדגירה עםנוגדנים ראשוניים. לאחר הכביסה, נוגדנים משניים מוחלים. שתי שוטף האחרונים 1x DPBS להשלים את ההליך מכתים שם על coverslips הם מיובשים רכוב על שקופיות הדמיה.

איור 2. התוצאות מייצגות באמצעות דגים / אם שיתוף ניתוחים.) HIV-1 הוא transfected לתאי הלה ובמקרים מסוימים עם מבנים שגורמים ביטוי יתר של חלבונים תאיים (RILP, p50/Dynamitin ו RILPΔN (מחיקה אמינו מסוף מוטציה)) . דגים / אם שיתוף ניתוחים בוצעה: RNA מזוהה עם ירוק או G3BP או LAMP1 (אדום) כדי לבדל. ב) HIV-1 מתבטא הלה שנאסף בנקודות זמן שונות. נגיפי RNA הוא ביטוי במעקב בירוק ואילו חלבון הסלולר, hnRNP A1, מוכתם באדום. ברים הם בגודל 10 מיקרומטר. תמונות שונה מ ¹ הפניות (איורים נבחרים מתוך לוח; RILP, p50/Dynamitin, ו RILP deltaN)ו ¹⁷ (לוח ב ').

Discussion

דגים / אם שיתוף ניתוח היא שיטה אמינה לחזות רנ"א נגיפי בתאים אשר עכשיו שוכללה ^9,15,16. במשך מספר שנים, פיתחנו שיטה מעודנת של מכתים עבור RNA. טכניקה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של סוגי תאים בתנאי בדיקה ספציפית היעד RNA ^17. על ידי תיוג בדיקה עם DIG, אנו מסוגלים לדמיין את הרנ"א על ​​ידי צביעה פשוטה. כאשר מכתים עבור רנ"א וחלבונים אחרים משולבים, דגים / אם שיתוף ניתוחים להיות כלי רב עוצמה לבחון מבנים סלולריים חלבון / RNA לוקליזציה.

הספציפיות של זיהוי RNA הוא גבוה למדי. זו באה לידי ביטוי באיור 2. בחלק מן היצירה המקורית שהתמקדה לוקליזציה נגיפי RNA הגנומי, דגים קבע כי חוסר Rev לכודים רנ"א נגיפי בגרעין ^18. מאז זה, המידע החדש בשפע על לוקליזציה נגיפי RNA הגנומי שהושג באמצעות techniquדואר שמתואר כאן. על ידי חלבונים overexpressing סלולריים, אוכלוסיות והן ספציפיות לא הכל של רנ"א נגיפי ניתן לכפות בתרגום לאזורים שונים של התא. Overexpression RILP, אשר דומה פנוטיפ להשיג כאשר hnRNP A2 תיגמר ידי siRNA ב-HIV-1-להביע תאים ^13, גורם RNA כדי לצבור בעליל על MTOC. RNA הגנומי ויראלי יכול להיות דחף לפריפריה התא על ידי השבתת חלבון מינוס סוף המנוע, dynein: overexpression מציאה p50/Dynamitin או של כבדות dynein ¹ תוצאות שרשרת שחרורו של RNA הגנומי ויראלי מתחומי תאיים לפריפריה נייד ( איור 2). מוטציה של RILP, RILPΔN, אשר לא נקשר מנוע dynein, מתפזר endosomes (מסומן על ידי LAMP1) לתוך הציטופלסמה, כי הם כבר לא פעיל מקומי בדומיינים juxtanuclear. תוצאות אלו מצביעות על הרעיון של האוכלוסייה פלסטיק של HIV-1 RNA הגנומי ובעיקר, כי בריכות שונות של הגנום-1-HIVRNA להתקיים עם התפקידים המזוהים לפעמים במחזור השכפול הנגיפי. מושגים אלה אותם כבר זיהו את החלבון המקודד על ידי ה-mRNA זה, איסור פרסום ^19.

יש מגבלות על השימושים של דגים / אם שיתוף ניתוחים הקשורים הבחירה נוגדנים וזמינות. אופטימיזציה של השילוב הטוב ביותר של נוגדנים ראשוניים ומשניים, וריכוזים שלהם, ייקח זמן לבצע אופטימיזציה (ראה לוח 1 & 2). נוגדנים עשוי היברידיים או מיוצר על ידי חברות גדולות יכולות להיות ריכוזי המשתנות בכל מקום בין 01:02 ל 1:2000, אבל כדי להיות בטוח בצע את ההנחיות המסופקות על ידי היצרן לקבלת התוצאות הטובות ביותר. מארח בו את הנוגדן מיוצר צריך גם לקחת בחשבון. כבשים ערבוב עם נוגדנים עזים כמו כן, יש להימנע נוגדנים ראשוניים ומשניים כמו זה תוצאות השילוב ברקע גבוהה בשל בין המינים הכרה (מידע לא מוצג). ל-Alexa פלואוריד secondaנוגדנים ר"י, ריכוז ניתן להשתמש ב 1:500 על נוגדנים כמעט לכל קבוצה. החיסרון השני דגים / אם שיתוף ניתוחים כמתואר בדוח זה היא שהוא מתאר את RNA במיקום שלה בבית היציב, לאחר התאים תוקנו ו permeabilized באמצעות paraformaldehyde וחומרי ניקוי (איור 1).

עם זאת, RNA הדמיה בתאים חיים הושגה באמצעות מגוון רחב של אמצעי ^20-22, בעיקר באמצעות וריאציות של נגיפי RNA כי הגנום מתויגים על ידי חלבוני ניאון כגון ה-GFP. עם זאת, אמצעים נוספים כדי לזהות לוקליזציה RNA בתאים חיים ממשיכים פני השטח. אלה שיטות חדשות לערב את RNA תיוג באמצעות ²³ תרד, SNAP ²⁴ או MTRIP ^2. טכניקות אלו סובלים גם כמה חסרונות, כולל הדרישה permeabilize תאים לפני הוספת מצעים או מחצית חייבים להיות מהונדסים לתייג את ה-mRNA, כדי לזהות את ה-mRNA באמצעות מיקרוסקופ. אכן, אדוה גדולntage של ניתוחים דגים המפורטים בדוח זה נעוצה בעובדה כי RNA הוא יליד ללא שינוי שמוביל את התוצאות הרלוונטיות ביותר מבחינה פיזיולוגית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
18mm coverslips	VWR	48380 046
16% paraformaldehyde	JT בייקר	S898-07	כדי להפוך את 4%: להמיס 20 גר 'ב 1XDPBS 500 מ"ל ב 60 ° C עם 5 טיפות NaOH. pH 7.2 כדי חום וחנות ב -20 ° C. אין לעבור על 70 מעלות צלזיוס!
Triton-X	OmniPur	9400
מיקרו Elute ג'ל ערכת חילוץ	רוש	D6294-02
DIG-RNA Labelling Mix	רוש	11277073910
תמלול T7-RNA פולימראז	Invitrogen	18033-019
ספין עמודות מהירים	רוש	11814427001
אני DNase	Invitrogen	18047-019
1X DPBS	Gibco	14190-250
לפוראמיד	EMD	FX0420-8
tRNA	Invitrogen	15401-021
RNase OUT	Invitrogen	10777-019
נוגדן Enhancer פלורסנט הגדר עבור איתור DIG # 4 (פתרון חסימת)	רוש	1768506
Alexa פלואוריד נוגדנים משניים	Invitrogen	ר 'טבלה 2
ההכלאה תנור	Boekel מדעentific	דגם 24100
Microslides	VWR	48300-047
Immunomount	Thermoscientific	9990402

מינים של נוגדנים נגד DIG (דילול, החברה מס 'קטלוגי)	צבעים	Alexa פלואוריד משמש (1:500)
עכבר (1:500, Sigma, B7405)	ירוק	Alexa פלואוריד 488 חמור נגד העכבר (Invitrogen, A21202)
	אדום	Alexa פלואוריד 594 חמור נגד העכבר (Invitrogen, A21203)
	כחול	Alexa פלואוריד 647 חמור נגד העכבר (Invitrogen, A31571)
כבשה (1:200, רוש, 11376623)	ירוק	Alexa פלואוריד 488 חמור נגד כבשים (Invitrogen, A11015)
	אדום	Alexa פלואוריד 594 חמור נגד כבשים (Invitrogen, A11016)
	כחול	Alexa פלואוריד 647 חמור נגד כבשים (Invitrogen, A21448)