Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Resumo

Um fluorescência In situ Hibridação método (FISH) foi desenvolvido para detectar visualmente virais RNA genómico usando microscopia de fluorescência. Uma sonda é feita com especificidade para o RNA viral que pode então ser identificados usando uma combinação de hibridação e técnicas de imunofluorescência. Esta técnica oferece a vantagem de identificar a localização do RNA viral ou DNA no estado estacionário, fornecendo informações sobre o controle de eventos intracelulares tráfico de vírus.

Resumo

Os vírus que infectam células provocam alterações específicas para as funções celulares normais que servem para desviar a energia e recursos para a replicação viral. Muitos aspectos da função da célula hospedeira são comandados por vírus, geralmente por a expressão de produtos de genes virais que proteínas do hospedeiro recrutam celulares e máquinas. Além disso, os vírus engenheiro organelas de membrana específicos ou de marcas sobre a vesículas celulares e proteínas de motor para alvejar regiões da célula (durante a infecção de novo, vírus cooptar proteínas motor molecular para alvejar o núcleo, mais tarde, durante a montagem do vírus, eles irão sequestrar celular máquinas que ajudarão na montagem de vírus). Menos é entendido sobre a forma como os vírus, em particular aqueles com genoma de RNA, coordenar o tráfico intracelular de proteínas e componentes de ARN e como eles atingir a montagem de partículas infecciosas em loci específicos na célula. O estudo de localização de RNA começou em trabalhos anteriores. Desenvolver menor EM eucarióticasbryos e células neuronais, desde a informação biológica importante, e também ressaltou a importância da localização RNA na programação de cascatas de expressão gênica. O estudo em outros organismos e sistemas celulares rendeu informações importantes semelhante. Vírus são parasitas obrigatórios e devem utilizar suas células hospedeiras para replicar. Assim, é crítico para compreender como os vírus de RNA dirigir genomas seu RNA a partir do núcleo, através do poro nuclear, através do citoplasma e em que um dos seus destinos finais, em partículas progenitura do vírus ^1.

FISH serve como uma ferramenta útil para identificar mudanças de estado estacionário localização do RNA viral. Quando combinado com imunofluorescência (IF) análise ^22, FISH / IF co-análises irá fornecer informações sobre a co-localização de proteínas com o RNA viral ^3. Esta análise, portanto, fornece um bom ponto de partida para testar a RNA-proteína interações, bioquímica ou outro biofísicotestes de ^4,5, já que co-localização, por si só não é evidência suficiente para ter a certeza de uma interação. Ao estudar a localização de RNA viral utilizando um método como este, abundante informação foi obtida em ambos os virais e celulares eventos tráfico de RNA ^6. Por exemplo, o HIV-1 produz RNA no núcleo de células infectadas mas o RNA é apenas traduzida no citoplasma. Quando uma proteína viral chave está ausente (Ap) ^7, FISH do RNA viral revelou que o bloco para a replicação virai é devido à retenção de HIV-1 RNA genómico no núcleo ^8.

Aqui, apresentamos o método de análise visual de virais RNA genômica in situ. O método faz uso de uma sonda de RNA etiquetado. Esta sonda foi projetada para ser complementar ao RNA genômico viral. Durante a síntese in vitro do RNA antisense da sonda, o ribonucleótido que é modificado com digoxigenina (DIG) está incluído em um in vitro transcription reacção. Uma vez que a sonda tem hibridado com o mRNA alvo nas células, as etapas subsequentes de anticorpos de rotulagem (Figura 1) irá revelar a localização do mRNA, bem como proteínas de interesse ao realizar FISH / IF.

Protocolo

1. Preparação da Sonda

1. Digest ug 1 do vector de transcrição in vitro, pKS (+) pol 236nt ⁹ com Kpn1 enzima a 37 ° C durante 1 hora e executar o produto de ADN linearizado num gel de agarose. O fragmento deve ser de aproximadamente 2500 pb.
2. Cortar o fragmento fora do gel e purificar usando o Micro Roche Eluir Kit Gel Extraction (todos os reagentes utilizados estão listados na Tabela 1). Realizar a eluição final em 30 ul de tampão de eluição. Executar 5 uL do produto sobre um gel de agarose para verificar a purificação.
3. Misturar uma reacção de transcrição in vitro (ver receita abaixo) utilizando o Roche DIG RNA rotulagem kit e incubar a 37 ° C durante 2 horas.

In vitro reacção de transcrição:

Linearizado de DNA	23 ul
1X DIG RNA rotulagem mix (Roche)	4 ul
1X Tratampão nscription	8 ul
20U RNase OUT	1 ml
80U polimerase de ARN T7	4 ul
Total	40 uL

4. Adicionar 228 U de DNase I e incubar a 37 ° C durante 15 min.
5. Parar a reacção por adição de EDTA pH 8,0 para uma concentração final de 20 mM.
6. Purifica-se a reacção utilizando as colunas rotação rápida da Roche, tal como especificado pelo fabricante.
7. Purifica-se o sonda por precipitação com 1/10 volume de DEPC-tratada pH NaOAc 3M 5,2 e 2,5 volumes de etanol gelado a 95%. Misturar e incubar à temperatura de -80 ° C durante 30 min a durante a noite.
8. Centrifugar a sonda durante 15 min a 4 ° C a 15.000 x g.
9. Remover o sobrenadante e lava-se o sedimento em etanol gelado a 70%. Centrifugar novamente durante 5 min a 4 ° C a 15.000 x g.
10. Remover o sobrenadante e secar o sedimento. Ressuspender o sedimento em 50 uL wAter (DNase / RNase livre), contendo 10 U Invitrogen RNase OUT.
11. Estimar a concentração de sonda por espectrofotometria (RNA medida a 260 nm), e diluir até uma concentração de 5 ng / uL. Armazenar em alíquotas a -20 ° C para utilização de curto prazo, ou -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Recomenda-se para realizar comparações de ensaio, inter assim conservar um aliquota para isso.

2. Fixação das células

1. É importante inicialmente para as células de sementes aderentes para não tratadas, lamínulas estéreis para a confluência final após a colheita é de aproximadamente 70-80%. Para as células não aderentes, crescem como normal e quando estiver pronto para recolher, incubar-los com lamelas que foram tratados com 0,01% w / v de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, Inc.) durante 1 hora. Para um 12-bem placa de poliestireno típico de cultura de tecidos (3,8 cm ^2), 150,000 (por exemplo, células HeLa) são plaqueadas a 24 horas antes da transfecção. As células não aderentes podem ser infectados ou transfectadas, como de costume e deixou-se adaqui para deslizamentos de vidro de cobertura antes da fixação ^3.
2. Descartar os meios de comunicação e lavar as células com solução salina tamponada com fosfato 1X preparada em água duplamente destilada (DPBS) durante 1 min. Dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.)-tratada 1X PBS podem também ser utilizados, no entanto PBS não tratado não pode, pois pode conter enzimas RNase.
3. Descartar o PBS e adicionar paraformaldeído a 4%, o suficiente para cobrir as células completamente. Incubar durante 15-20 min.
4. Descartar o paraformaldeyhyde e lavar as células com 1x DPBS durante 1 min.
5. Descartar o DPBS e adicionar 0,1 M de glicina (dissolvido em 1X DPBS). Incubar durante 10 min.
6. Descartar o glicina e lavar as células com 1x DPBS durante 1 min.
7. Descartar o DPBS e adicionar 0,2% de Triton-X (dissolvido em 1X DPBS). Incubar durante 5-10 min. Se coloração para proteínas de envelope de nucléolos ou nuclear, permeabilizar com Triton X-100 para não mais do que 5 min ou a localização da proteína irá tornar-se difusa.
8. Descartar o Triton X-100 e lavar uma vez em1X DPBS durante 1 min.
9. Para armazenamento a longo prazo, substituir PBS com etanol a 70% e armazenar a 4 ° C durante até quatro meses. Alternativamente, lave mais uma vez com 1X DPBS e prossiga para FISH.

3. Hibridização fluorescente in situ (FISH)

1. Se as lamelas foram armazenados em etanol, substituir o etanol com 1x DPBS e permitir que as células para re-hidratar durante 30 min. Reidratação pode ser feito durante a noite se as lamelas são armazenadas a 4 ° C.
2. Lave as lamelas com 1x DPBS durante 1 min.
3. Prepare slides para incubar as lamelas em diante, tendo o cuidado de limpar e classificá-los bem.
4. Para uma lamela 18mm, adicionar 50 ul de solução de DNase (25 unidades / lamela, comercialmente disponíveis) para o slide. Adicionar a lamela, sendo certo colocá-lo lado das células para baixo, e incubá-lo durante 15 min à temperatura ambiente.
5. Lave as lamelas com 1x DPBS durante 1 min.
6. Adicionar 50 ul mistura de hibridação (ver receita abaixo) por lamela emum deslizante e incubar o lado das células para baixo para a lamela 16-18 h, a 42 ° C. A incubação deve ser realizada em um tabuleiro contendo uma formamida a 50%, 2X SSPE mistura (12,5 ml de formamida desionizada, 2,5 ml de 20X SSPE, 10 ml de água).

Mistura de hibridação (para uma lamela, 50 ul):

Quantidade de ações	Material de (a uma concentração final)
25 uL	Formamida, 50% (desionizada; qualquer fonte)
5 ul (de 10 mg / ml)	tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc)
5 ul (de 20X)	SSPE, 2X
5 ul (de 50X)	Denharts, 5X
0,125 ul (de 5 unidades)	RNase OUT
5 ul (25 ng de 5 ng / uL)	Probe
5 ul	H 2 O DEPC, para fazer a finalvolume de 50 ul

7. Incubar lado das células para baixo lamelas em formamida a 50 uL de 50% (diluído em 1X DPBS) durante 15 min a 42 ° C.
8. Lave as lamelas duas vezes em 2X SSPE, incubando-as lado das células para baixo em 50 uL 2X SSPE (20X SSPE diluído em 1X DPBS) durante 5 min cada, a 42 ° C.
9. Lave as lamelas em 1X DPBS durante 1 min.

4. Técnica de imunofluorescência

1. Bloquear as lamelas, colocando-as lado célula para baixo em 50 uL 1X Roche solução de bloqueio (solução Roche 10X de bloqueio diluído em 1X DPBS) durante 30 min.
2. Incubar o lado das células para baixo em lamelas 50 solução de anticorpo primário ul durante 1 hora a 37 ° C. Anti-DIG anticorpo deve ser diluído de acordo com a direcção do fabricante em 1X solução de bloqueio. Se outros anticorpos estão a ser utilizados para corar as proteínas, eles podem ser adicionados na concentração correcta desde que todos os anticorpos utilizados são derivados de especificação hospedeiro diferentes.
3. Lave as lamelas durante 10 min em 1X DPBS.
4. Incubar o lado das células para baixo em lamelas 50 solução de anticorpo secundário ul durante 1 hora a 37 ° C. Alexa Fluor anticorpos conjugados (Invitrogen) pode ser usado para gerar uma gama de cores e são utilizados em 1:500 em solução de bloqueio, 1X DPBS 1X.
5. Lave as lamelas duas vezes durante 10 min cada um em DPBS 1X.
6. Seque o lado da célula lamelas em papel Whatman. Certifique-se de cobrir as lamelas para evitar a exposição à luz e ao branqueamento.
7. Uma vez que todo o líquido é evaporado, montar as lamelas em lâminas de fresco utilizando 8 ImmunoMount ul (Thermo Scientific, Inc.). Bata levemente para baixo a lamela para eliminar as bolhas de ar.
8. Aplique unha polonês para as bordas da lamínula para fixá-lo no lugar.
9. A visualização de RNA e proteínas por técnicas de microscopia também é crítica para o sucesso desta técnica. Definições sobre o microscópio usado pode ajudar ou atrapalhar a visualização por isso é fundamental que oconfigurações do microscópio estar configurada corretamente e ser consistente de uma amostra para outra em um determinado experimento. Para configurações detalhadas de microscopia, óptica e combinações de anticorpos, por favor consulte as referências ^1,10.

5. Os resultados representativos

Um exemplo de coloração do RNA viral pode ser visto na Figura 2. O RNA viral para o HIV-1 é visto ao longo do citoplasma exibido difusamente para a maior parte, embora punctae citoplasmática pequena não são incomuns. A especificidade pode ser visto comparando as células positivas para as células vizinhas que exibem nenhuma fluorescência. Como mencionado na introdução, o HIV-1 que não tem a proteína Rev de regulamentação produz RNA que é retido no núcleo: este pode ser visualizado como um sinal brilhante no núcleo, e uma falta de RNA sinal de fluorescência no citoplasma. A sobreexpressão de proteínas celulares é também capaz de transferir a distribuição dos ARN HIV-1 virais. Na Figura 2 forte, a sobre-expressão de proteínas envolvidas no tráfico de vesícula endossomal (por exemplo, Rab7-interagindo lisossomal proteína (RILP) ¹¹ ou no terminal-N RILP eliminado (RILPN) ^11, e as proteínas que interferem com a função motora dineína [por exemplo p50/dynamitin ^{1, 12],} interferir com a localização de estado estacionário normal dos ARN genómico virais, tal como determinado por análises de FISH expressão RILP leva a re-localização dos ARN genómico virais para a organização dos microtúbulos centro (MTOC) ^13;. RILPN dispersa tarde endossomas dentro do citoplasma, devido à incapacidade de se ligar a p150 ^colada do motor dineína complexo ¹⁴ e bloqueia p50/dynamitin a grande subunidade de dineína motor e versões tarde endossomas, mas também a viral genómico RNA e de HIV-1 proteínas estruturais para a periferia da célula ¹ (Figura 2). A manipulação da localização de estado estacionário do RNA genómico virais, um dos principais contribuintes para a infecciosidade dopartículas do vírus, seria a chave para o eventual desenvolvimento de terapêuticas. Nas nossas mãos, o RNA virai aparece na célula tão cedo quanto 3 horas após a transfecção e infecção ¹⁰ e torna-se facilmente observáveis ​​por esta técnica FISH por 12 horas.

Figura 1. Fluxograma do protocolo para FISH / IF co-análises. As células são cultivadas em lamínulas e, em seguida, fixadas com paraformaldeído. Tratamentos de glicina e Triton-X são realizadas antes de as células são utilizadas para FISH / IF ou armazenada em etanol a 70% para o armazenamento. Células desidratadas para armazenamento são reidratados em 1X DPBS (DEPC-tratada PBS) antes de continuar a FISH / SE. As células são tratadas com DNase I e deixada durante a noite para hibridar com a sonda. Uma vez que a hibridação é completa, as células são lavadas com formamida, bem como com SSPE, e uma final 1X DPBS enxaguar. Solução de bloqueio é aplicado às células, seguido de incubação comos anticorpos primários. Após a lavagem, os anticorpos secundários são aplicadas. Duas lavagens finais em 1X DPBS completar o procedimento de coloração onde sobre as lamelas são secas e montadas em lâminas para imagiologia.

Figura 2. Os resultados representativos utilizando FISH / se o co-análises. A) HIV-1 é transfectado em células HeLa e em alguns casos com construções que causam a sobre-expressão de proteínas celulares (RILP, p50/Dynamitin e RILPΔN (uma deleção amino-terminal mutante)) . FISH / IF co-análise foi realizada: o RNA é identificado na cor verde com qualquer G3BP ou LAMP1 (vermelho) para diferenciar. B) HIV-1 é expresso em células HeLa e recolhido em pontos de tempo diferentes. Expressão do RNA viral é monitorado no verde, enquanto a proteína celular, hnRNP A1, está manchada de vermelho. Barras de tamanho são 10 mM. Imagens modificados a partir de referências ¹ (Figuras selecionados a partir do painel A; RILP, p50/Dynamitin e deltaN RILP)e ¹⁷ (painel B).

Discussão

FISH / IF co-análise é um método confiável para visualizar o RNA viral em células que já foi refinada ^9,15,16. Ao longo de vários anos, foi desenvolvido um método refinado de coloração para o RNA. Esta técnica pode ser usado em uma grande variedade de tipos de células, desde a sonda é específico para o RNA alvo ^17. Ao classificar a sonda com DIG, somos capazes de visualizar as RNA por coloração simples. Quando a coloração para RNA e outras proteínas são combinados, FISH / IF co-análises se tornar uma ferramenta poderosa para observar as estruturas celulares e proteína / RNA localização.

A especificidade da detecção de RNA é bastante elevada. Isto é ilustrado na Figura 2. Em alguns do trabalho original, centrado na localização genômica viral RNA, FISH estabelecido que a falta de Rev preso RNA viral no núcleo ^18. Uma vez que este, a nova informação abundante na localização viral genómico RNA foi obtido usando o technique descritos aqui. Por proteínas superexpressando celulares, as populações-e específicos não todo-do RNA viral pode ser forçado para localizar a diferentes regiões da célula. RILP superexpressão, que se assemelha ao fenótipo obtido quando hnRNP A2 está esgotada por siRNA em HIV-1-expressando células ^13, faz com que o RNA para visivelmente acumular no MTOC. O RNA genômico viral pode ser empurrada para a periferia da célula, desativando a proteína do motor menos-end, dineína: superexpressão p50/Dynamitin ou knockdown dos pesados ​​cadeia dineína ¹ resulta na liberação de vírus RNA genômico de domínios intracelulares para a periferia celular ( A Figura 2). Um mutante de RILP, RILPΔN, que já não se liga o motor dineína, dispersa endossomas (marcado por LAMP1) para o citoplasma, porque eles não são mais ativamente localizados em domínios juxtanuclear. Estes resultados indicam a noção de uma população de plástico de HIV-1 RNA genómico e, em particular, que os pools diferentes de HIV-1 genómicoRNA existir com papéis, por vezes, identificáveis ​​no ciclo de replicação virai. Estas mesmas noções já foram identificados para a proteína codificada por este ARNm, Gag ^19.

Existem limitações para os usos de FISH / IF co-análises que estão relacionados à escolha de anticorpos e disponibilidade. A otimização da melhor combinação de anticorpos primários e secundários, e suas concentrações, vai levar tempo para otimizar (ver Tabela 1 e 2). Os anticorpos produzidos a partir de hibridomas ou produzidos por grandes empresas podem ter concentrações que variam em qualquer lugar de 1:2 a 1:2000, mas não se esqueça de seguir as orientações fornecidas pelo fabricante para obter melhores resultados. O hospedeiro no qual o anticorpo é produzido também deve ser tomado em consideração. Ovelhas mistura com anticorpos de cabra também deve ser evitado em anticorpos primário e secundário como esta combinação resulta em fundo elevado, devido ao reconhecimento de espécies cruzadas (dados não mostrados). Para Alexa-Fluor secondaanticorpos ry, a concentração pode ser usado em 1:500 para quase qualquer anticorpo no conjunto. O outro inconveniente para FISH / se o co-análises como descrito neste relatório é que capta o RNA no seu local no estado estacionário, após as células foram fixadas e permeabilizadas usando paraformaldeído e detergente (Figura 1).

No entanto, o RNA de imagem em células vivas foi conseguida através de uma variedade de meios ^20-22, na maioria utilizando variações dos genomas virais de ARN que são marcados por proteínas fluorescentes, tais como GFP. No entanto, os meios adicionais para identificar a localização de RNA em células vivas continuar a superfície. Estes novos métodos envolvem o RNA de marcação por meio de espinafre ^23, SNAP ^24, ou MTRIP ^2. Estas técnicas também sofrem de algumas desvantagens, incluindo o requisito para permeabilizar as células antes de adicionar substratos ou que uma porção deve ser concebida para marcar o mRNA a fim detectar o mRNA por microscopia. Com efeito, a maior advantage de análises de FISH descritas neste relatório reside no facto de que o RNA nativa é inalterado levando a os resultados mais fisiologicamente relevantes.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Lamínulas 18mm	VWR	48380 046
16% de paraformaldeído	JT Baker	S898-07	Para fazer com que 4%: Dissolver 20 g em 1XDPBS 500mL a 60 ° C com 5 gotas de NaOH. pH para 7,2 fora do calor e armazenar a -20 ° C. Não exceda os 70 ° C!
Triton-X	OmniPur	9400
Micro Eluir Kit Gel Extraction	Roche	D6294-02
DIG RNA Rotulagem Mix	Roche	11277073910
Transcrição T7 RNA Polimerase	Invitrogen	18033-019
Rápidos Colunas de Spin	Roche	11814427001
DNase I	Invitrogen	18047-019
DPBS 1X	Gibco	14190-250
Formamida	EMD	FX0420-8
tRNA	Invitrogen	15401-021
RNase OUT	Invitrogen	10777-019
Fluorescent Antibody Enhancer Conjunto para Detecção DIG # 4 (solução de bloqueio)	Roche	1768506
Alexa Fluor anticorpos secundários	Invitrogen	Consulte a Tabela 2
Forno de hibridação	Boekel Scicientífico	Modelo 24100
Microslides	VWR	48300-047
Immunomount	Thermoscientific	9990402

Espécie de anti-DIG anticorpo (diluição; empresa número de catálogo)	Cores	Alexa Fluor utilizado (1:500)
Rato (1:500; Sigma, B7405)	verde	Alexa Fluor 488 burro anti-rato (Invitrogen, A21202)
	vermelho	Alexa Fluor 594 burro anti-rato (Invitrogen, A21203)
	azul	Alexa Fluor 647 burro anti-rato (Invitrogen, A31571)
Sheep (1:200; Roche, 11376623)	verde	Alexa Fluor 488 burro anti-ovelha (Invitrogen, A11015)
	vermelho	Alexa Fluor 594 burro anti-ovelha (Invitrogen, A11016)
	azul	Alexa Fluor 647 burro anti-ovelha (Invitrogen, A21448)