Ovariectomía y 17β-estradiol reemplazo en ratas y ratones: una demostración visual

Resumen

Ovariectomía y la consiguiente sustitución de 17β-estradiol por medio de cápsulas de Silastic y Nutella por vía oral se ha demostrado en ratas y ratones.

Resumen

Los estrógenos son una familia de hormonas sexuales femeninas con un espectro excepcionalmente amplia de efectos. Cuando las ratas y los ratones son utilizados en la investigación de los estrógenos que son comúnmente ovariectomizadas con el fin de realizar la ablación de la producción de hormonas de ciclo rápido, en sustitución de la exógena 17β-estradiol. Hay, sin embargo, la falta de consenso respecto a cómo la hormona debe ser administrado para obtener las concentraciones fisiológicas de suero. Esto es crucial ya que el nivel de 17β-estradiol / método de administración influye profundamente en los resultados experimentales ^1-3. Tenemos en una serie de estudios que se caracterizan los diferentes modos de administración de 17β-estradiol, encontrando que subcutáneos cápsulas de silastic y por vía oral Nutella nuez de crema son superiores a las disponibles en el mercado pastillas de liberación lenta (producido por la compañía Research innovador de América) y inyecciones diarias en términos de producción fisiológicas las concentraciones séricas de 17β-estradiol ^6.4. Entre los advantages del método tuerca-crema, que previamente ha sido utilizado para la buprenorfina administración ^7, es que cuando se utiliza para la administración de estrógenos que se asemeja a la terapia de sustitución hormonal por vía oral y no es invasivo. Las cápsulas subcutáneas silastic son convenientes y producir las concentraciones séricas más estables. Este artículo video contiene paso a paso las demostraciones de la ovariectomía y 17β-estradiol reemplazo de la hormona por las cápsulas de silastic y Nutella por vía oral en ratas y ratones, seguidos por una discusión de aspectos importantes de los procedimientos de gestión.

Protocolo

1. Ovariectomía a través de la Ruta del dorsal

1. Se anestesia el animal, por ejemplo, utilizando 1,5% de isoflurano (4% para la inducción) en un oxígeno / óxido nitroso 30% / 70% mezcla. Colocar el animal en posición boca abajo en una placa de calefacción conectado a un termómetro rectal. Es importante tener una fina capa de aislamiento entre el animal y la placa, y que el termómetro de realimentación del sistema mantiene la temperatura corporal dentro de 37 ± 0,5 ° C. Aplique el gel para proteger los ojos y administrar 5 mg Rimadyl / kg de peso diluido en solución salina por vía subcutánea en la cara lateral del cuello del animal para el alivio del dolor postoperatorio.
2. Afeitado un 4 * 4 cm (3 * 3 cm para los ratones) cephally zona de la cresta ilíaca. Es necesario lavar completamente el área afeitada con la Jodopax ejemplo, antes de cubrir el animal con una hoja de 4 * 4 cm de la cirugía de la apertura.
3. Haga una incisión de 2-3 cm de la línea media y sin rodeos disección de la piel de la fascia subyacente. Uno cm lateral de la línea media, hacer otra incisión through la fascia. Francamente disecar lateralmente bajo esta fascia como superficialmente como sea posible hasta llegar a la cavidad abdominal.
4. Usando las pinzas, agarra el tejido adiposo que rodea el ovario en la cavidad abdominal y tire suavemente hacia afuera. Identificar el ovario y ligar las trompas de Falopio y los vasos 0.5-1 cm proximal de esta estructura. Cortar el ovario y el tejido adiposo ligado y poner la parte posterior del tejido restante en la cavidad abdominal. Hacer otra incisión en la fascia contralateral y repita el procedimiento.
5. Cerrar las heridas, de preferencia utilizando una sutura monofilamento, y dejar que el animal despierta de la anestesia. Colocar el animal en una jaula calentada (25-27 ° C) durante al menos 2 horas después de la cirugía. Los animales deben ser alojados por separado los primeros días del postoperatorio. Es fundamental que la jaula se limpiarán con frecuencia / sustituido durante la fase de recuperación. Veinticuatro horas después de la cirugía, los animales se inyectan por vía subcutánea con otro 5 mg Rimadyl / kg de peso corporal diluido ensolución salina.

2. La administración subcutánea de 17β-estradiol a través de cápsulas de Silastic

1. Mezcle la cantidad deseada de 17β-estradiol en aceite de sésamo. Para las concentraciones fisiológicas en ratas y ratones, se recomienda 180 mg / ml y 18-36 mcg / ml, respectivamente. Placebo cápsulas se llenan con aceite de sésamo puro.
2. Corte 3 cm (2 cm para ratones) la longitud de los tubos de silastic y 5 mm (3 mm para los ratones) longitudes de palos de madera para conectar aplicadores. El uso de pinzas, apretar un tapón de madera en la cápsula de silastic antes de inyectar la solución de aceite 17β-estradiol/sesame para llenar toda la longitud. Suavemente la tapa de la cápsula de silastic en el extremo abierto con otro tapón de madera (los tapones se supone que debe permanecer permanentemente en la cápsula). Incubar las cápsulas en el restante 17β-estradiol solución durante la noche antes de la implantación.
3. La implantación de la cápsula se puede realizar durante la anestesia que se utiliza en ovariectomía en ratas. Para mice, sin embargo, un período de recuperación 14-días después de la ovariectomía se recomienda para minimizar el riesgo de la cápsula que sobresale a través de la piel frágil.
4. Después de las preparaciones quirúrgicas como en 1.1, o después de cerrar la incisión ovariectomía, afeitarse y lavarse un área de 2 * 2 cm en la cara dorsal del cuello del animal. Haga una incisión de 1 cm y sin rodeos la disección de un bolsillo subcutáneo caudolaterally, con amplio espacio para la cápsula. Limpiar la cápsula de silastic (que hasta este punto de tiempo ha sido incubadas en la solución 17β-estradiol) y suavemente instalar a través de la incisión, que posteriormente se cierra por una sutura. Es crucial para asegurarse de que las cepas de la cápsula de la piel tan poco como sea posible, particularmente en el área cercana a la herida. Desde la producción de cápsulas a la implantación, es importante que se evita la contaminación.

3. La administración oral de 17β-estradiol a través de la tuerca de la crema Nutella

1. Se disuelven completamente 17β-estradiol en aceite de sésamo, y luego mezclar el aceite de sésamo con la Nutella. Se recomienda que cada porción diaria contiene 28 mg 17β-estradiol, 5 l de aceite de sésamo y 1 g de Nutella por kilogramo de peso corporal para las ratas y 1,12 mg 17β-estradiol, 0.312 l de aceite de sésamo y 60 mg de Nutella para cada ratón de 30 g. Placebo nueces crema se prepara de forma idéntica, salvo sin el 17β-estradiol.
2. Capacitar a los animales para comer libre de hormonas de nuez de crema durante cinco días antes del experimento. Los primeros tres días de entrenamiento, las ratas de forma óptima, debe estar capacitado en grupos (aproximadamente 0,5 g de Nutella 2-5 animales), en sus propias jaulas. En los días cuarto y quinto de la formación, los animales se colocan en jaulas separadas antes de recibir la porción diaria para asemejarse a la situación experimental.
3. Durante el experimento, los animales se colocan en jaulas separadas para cada ocasión de alimentación, después de lo cual la porción de Nutella se sirve en pequeñas baldosas de cerámica. Si la formación se ha realizado el anterior, oexperiencia ur es que más del 95% de las ratas y ratones aceptar la tuerca de crema, y ​​una vez completamente habituados, la mayoría de los animales que consumen en cuestión de segundos.

4. Los resultados representativos

Suero fisiológico 17β-estradiol concentraciones, que los métodos actuales apuntan a reproducir, es de aproximadamente 5 a 140 pg / ml para las ratas y 5-35 pg / ml para los ratones ^4,6. Las cápsulas subcutáneas silastic de acuerdo con las instrucciones anteriores, cuando se administra a 300 g hembra Sprague-Dawley, producir disminuyendo lentamente 17β-estradiol concentraciones de suero de alrededor de 40 pg / ml el día 2 a 10 pg / ml el día 35. Sin embargo, inmediatamente después de la administración, un pico de concentración en suero alrededor de 1000 pg / ml se puede esperar, cayendo al rango fisiológico dentro de las 8 horas (Figura 1A) ^4,5. Las cápsulas de silastic para los ratones descritos anteriormente con 17β-estradiol/mL mg de 36 años, cuando se administró a 25 mujeres C57BL g / 6 ratones, hacer que el suero concentradoentrations que poco a poco disminuyen de aproximadamente 90 pg / mL día 2 a 25 pg / mL día 35. Esto es, probablemente, precedido por un pico similar como se encontró en las ratas, aunque esto no ha sido investigado (Figura 1B) ^6.

El método Nutella peroral con las dosificaciones se ha descrito anteriormente, cuando se administra a 300 g hembra Sprague-Dawley, hace que los niveles fisiológicos de 17β-estradiol con las fluctuaciones diarias entre 10-70 pg / ml (Figura 2A) ^4. Para ratones utilizando la dosis anterior, los niveles diarios fluctúan entre aproximadamente 20 y 120 pg / ml ⁶ (Figura 2B).

. rong> Figura 1 se presentan los gráficos estilizados 17β-estradiol concentraciones en ratas (A, n = 10 en los puntos de tiempo hasta 24 h, n = 15 en los puntos de tiempo posteriores) ^4,5 y los ratones (B, n = 10) ⁶ después de la implantación de cápsulas. Las cápsulas de silastic producir un pico corto inicial de las concentraciones séricas de hasta 1000 pg / ml, pero la disminución en cuestión de horas a niveles inferiores a 100 pg / ml. Para las próximas semanas 4-5, las cápsulas de rendimiento estable, aunque cada vez menor, las concentraciones séricas. Las áreas sombreadas corresponden a fisiológicos 17β-estradiol concentraciones séricas en ratas hembra intactas y ratones, respectivamente. A pesar de que visualmente no se muestra en los gráficos, hay variabilidad interindividual en las concentraciones de 17β-estradiol, lo que hace coeficientes de variación desde 27 hasta 183% en las ratas y de 28 a 115% en los ratones con el método de la cápsula de silastic (media muy baja concentraciones a menudo generan altos coeficientes de variación).

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Figura 2 gráficos estilizados presentan 17β-estradiol concentraciones en ratas (A, n = 15). ⁴ y ratones (B, n = 10) ^6, como consecuencia de la administración de hormonas diaria en Nutella. El método Nutella peroral hace picos diarios, sin embargo, con mucho, no tan alta como producido por vía subcutánea o métodos intravenosos. Esto imita la farmacocinética de la terapia humana sustitución hormonal, y el tratamiento por vía oral puede proceder durante tanto tiempo como sea necesario, incluso si el ejemplo anterior sólo presentan un período inicial de 96 horas. Las áreas sombreadas corresponden a fisiológicos 17β-estradiol concentraciones séricas en ratas hembra intactas y ratones, respectivamente. Aunque no se demostró visualmente en los gráficos, hay variabilidad interindividual en las concentraciones de 17β-estradiol, lo que hace coeficientes de variación desde 40 hasta 132% en las ratas y de 13 a 219% en los ratones con el método de Nutella (concentraciones medias muy bajas a menudo generan altacoeficientes de variación).

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Discusión

Los modos de administración presentados anteriormente tienen en estudios anteriores demostró ser superior a comerciales gránulos de liberación lenta y las inyecciones en términos de producir fisiológicas concentraciones séricas de 17β-estradiol. Mientras gránulos de liberación lenta, producen picos séricos muy elevados y prolongados de concentración, las inyecciones causar fluctuaciones extremas, la hormona del día y requieren un manejo estresante repetida de los animales de ^4-6. La importancia d...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Rimadyl, 50 mg / ml	Pfizer	462986	La analgesia postoperatoria después de la ovariectomía.
Lubrithal gel para los ojos	Laboratorios LEO Pharma		Protección de los ojos durante la cirugía.
Jodopax veterinario	Pharmaxim		Cirugía desinfección.
Sutura de Vicryl 4-0	Johnson & Johnson		Sutura de la herida y la ligadura de ovario.
17β-estradiol,> 98%	Sigma	E8875-1G	En aceite de ajonjolí para las cápsulas de silastic y Nutella.
Aceite de sésamo	Sigma	S3547-1L	Disolución de la 17β-estradiol.
Tubos de Silastic, ID / OD: 1.575/3.175 mm	Dow Corning	508-008	La producción de cápsulas de silastic.
Aplicador de madera	Selefatrade	12-0783	La nivelación de las cápsulas de silastic.
Nutella	Ferrero		Medio para la vía oral 17β-estradiol.