Ovariektomie und 17β-Estradiol Ersatz bei Ratten und Mäusen: Die bildliche Darstellung

Zusammenfassung

Ovarektomie und anschließender Austausch von 17β-Östradiol durch Silastic Kapseln und perorale Nutella sind bei Ratten und Mäusen nachgewiesen.

Zusammenfassung

Östrogene sind eine Familie von weiblichen Sexualhormone mit einem außergewöhnlich breiten Spektrum von Effekten. Bei Ratten und Mäusen in Östrogen Forschung dienen sie allgemein ovariektomiert, um die rasch proliferierender Hormonproduktion abgetragen und ersetzt das 17β-Östradiol exogen. Es gibt jedoch keinen Konsens darüber, wie das Hormon verabreicht werden sollte, um physiologische Serumkonzentration zu erhalten. Dies ist entscheidend, da die 17β-Estradiol Niveau / Verwaltung Methode zutiefst beeinflusst die experimentellen Ergebnisse ^1-3. Wir haben in einer Reihe von Studien charakterisiert die verschiedenen Modi des 17β-Estradiol Verwaltung stellte fest, dass subkutane Silastic Kapseln und pro-Nuss-Creme oral Nutella überlegen kommerziell erhältlichen Slow-Release-Pellets (hergestellt von der Firma Innovative Research of America) sind und tägliche Injektionen in Bezug auf die Herstellung physiologischer Serum-Konzentrationen von 17β-Östradiol ^4-6. Unter den advantages der Mutter-Sahne-Methode, die zuvor für Buprenorphin Verwaltung ⁷ verwendet wurde, dh wenn für die Verabreichung von Estrogen verwendet es peroralen Hormonersatztherapie ähnelt und ist nicht-invasiv. Die subkutane Silastic Kapseln sind bequem und produzieren die stabilsten Serumkonzentrationen. Dieses Video Artikel enthält Schritt-für-Schritt-Demonstrationen von Ovariektomie und 17β-Estradiol Hormonersatz durch Silastic Kapseln und perorale Nutella bei Ratten und Mäusen, von einer Diskussion über wichtige Aspekte der Verwaltung gemacht wurden.

Protokoll

1. Ovariektomie über die Dorsal-Route

1. Das Tier zu betäuben, zum Beispiel unter Verwendung von 1,5% Isofluran (4% bei Induktion) in einem Sauerstoff / Lachgas 30% / 70%-Mischung. Platzieren Sie das Tier in Bauchlage auf einer Heizplatte mit einem rektalen Thermometer. Es ist wichtig, um eine dünne Schicht der Isolierung zwischen dem Tier und der Platte haben, und das Thermometer Feedback-System hält den Körper Temperatur innerhalb von 37 ± 0,5 ° C Tragen Sie das Gel zum Schutz der Augen und zu verwalten, 5 mg Rimadyl / kg Körpergewicht in Kochsalzlösung subkutan auf der lateralen Seite den Hals des Tieres für die postoperative Schmerzbehandlung verdünnt.
2. Shave a 4 * 4 cm (3 * 3 cm für Mäuse) Bereich cephally aus dem Beckenkamm. Waschen Sie gründlich den rasierten Bereich mit zum Beispiel vor dem Abdecken Jodopax das Tier mit einem 4 * 4 cm Öffnung Chirurgie Blatt.
3. Machen Sie eine 2-3 cm Medianschnitt und unverblümt sezieren die Haut von der darunter liegenden Faszie. Eines cm lateral der Mittellinie, einen weiteren Einschnitt through die Faszie. Unverblümt seitlich sezieren unter dieser Faszie als oberflächlich wie möglich bis zum Erreichen der Bauchhöhle.
4. Mit einer Pinzette greifen die Fettgewebe, die den Eierstock umgibt in der Bauchhöhle und ziehen Sie sie vorsichtig heraus. Identifizieren Sie den Eierstock und die Gebärmutter ligieren Hörner und Gefäße 0,5-1 cm proximal von dieser Struktur. Schneiden Sie den Eierstock und ligierten Fettgewebe und setzen Sie den restlichen Gewebe zurück in die Bauchhöhle. Machen Sie einen anderen Schnitt in der kontralateralen Faszie und den Vorgang wiederholen.
5. Schließen Sie die Wunden, vorzugsweise unter Verwendung eines monofilen Naht, und lassen Sie das Tier aus der Narkose erwachen. Legen Sie das Tier in einer beheizten Käfig (25-27 ° C) während mindestens 2 Stunden nach der Operation. Die Tiere sollten einzeln in den ersten Tagen nach der Operation untergebracht werden. Es ist entscheidend, dass der Käfig regelmäßig gereinigt wird / während der Erholungsphase ersetzt. Vierundzwanzig Stunden nach der Operation, den Tieren subkutan injizieren mit einer weiteren 5 mg Rimadyl / kg Körpergewicht, verdünnt inKochsalzlösung.

2. Subkutane Verabreichung von 17β-Östradiol durch Silastic Kapseln

1. Gründlich mischen Sie die gewünschte Menge an 17β-Estradiol in Sesamöl. Für physiologischen Konzentrationen bei Ratten und Mäusen, empfehlen wir, 180 ug / ml und 18-36 pg / ml. Placebo-Kapseln sind mit reinem Sesamöl gefüllt.
2. Schneiden Sie 3 cm (2 cm für Mäuse) Längen von Silasticschlauch und 5 mm (3 mm für Mäuse) Längen von Holz-Tupfer zum Einstecken. Mit einer Pinzette, quetschen ein Holzpflock in die Silastic Kapsel vor dem Einspritzen des Öls 17β-estradiol/sesame Lösung, um die gesamte Länge zu füllen. Vorsichtig verschließen Sie die Silastic Kapsel in das offene Ende mit einem anderen Holz-Stecker (die Stecker sollen dauerhaft in der Kapsel). Inkubieren Sie die Kapseln in der verbleibenden 17β-Estradiol-Lösung über Nacht vor der Implantation.
3. Die Implantation der Kapsel kann während der Narkose bei Ovarektomie bei Ratten verwendet, durchgeführt werden. Für miCE ist jedoch eine 14-tägige Erholungsphase nach Ovariektomie dringend empfohlen, um das Risiko der Kapsel durch die hervorstehenden empfindliche Haut zu minimieren.
4. Nach der chirurgischen Zubereitungen im Sinne der 1.1, oder nach dem Schließen der Ovariektomie Einschnitt, rasieren und waschen ein 2 * 2 cm-Bereich auf der Dorsalseite den Hals des Tieres. Machen Sie eine 1 cm Inzision und unverblümt sezieren eine subkutane Tasche caudolaterally, mit viel Platz für die Kapsel. Wischen die Silastik Kapsel (dass bis zu diesem Zeitpunkt, in dem in 17β-Estradiol-Lösung inkubiert) und leicht zu installieren durch den Einschnitt, die anschließend durch eine Naht geschlossen. Es ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die Kapsel-Stämme die Haut so wenig wie möglich, besonders in der Gegend in der Nähe der Wunde. Von der Herstellung von Kapseln zur Implantation ist es wichtig, dass eine Verunreinigung vermieden wird.

3. Perorale Verabreichung von 17β-Estradiol über die Mutter-Creme Nutella

1. Gründlich aufzulösen 17β-Estradiol in Sesamöl, und dann mischen das Sesamöl mit dem Nutella. Wir empfehlen, dass jeder täglich Abschnitt 28 pg 17β-Estradiol, 5 ul Sesamöl und 1 g Nutella pro Kilogramm Körpergewicht für Ratten und 1,12 pg 17β-Östradiol, 0,312 ul Sesamöl und 60 mg Nutella für jedes 30-g-Maus enthält. Placebo-Creme Nuss ist identisch mit Ausnahme der ohne 17β-Estradiol vorbereitet.
2. Trainieren Sie die Tiere frei von Hormonen Nuss-Creme für fünf Tage vor dem Experiment zu essen. Die ersten drei Tage der Ausbildung sollten die Ratten in Gruppen optimal trainiert werden (ca. 0,5 g Nutella auf 2-5 Tiere), in ihre Käfige. Auf der vierten und fünften Tag der Ausbildung werden die Tiere in getrennten Käfigen, bevor ihm der tägliche Portion an die experimentelle Situation ähneln setzen.
3. Während des Experiments werden die Tiere in getrennten Käfigen für jeden Anlass Fütterung setzen, wonach die Nutella Teil auf kleinen Keramikfliesen serviert wird. Wenn Training ist wie oben, o durchgeführt wordenur Erfahrung ist, dass mehr als 95% von Ratten und Mäusen die Nuss-Creme zu akzeptieren, und einmal vollständig gewöhnt, konsumieren die meisten Tiere es innerhalb von Sekunden.

4. Repräsentative Ergebnisse

Physiologischer Kochsalzlösung 17β-Östradiol-Konzentrationen, die die aktuellen Methoden zielen darauf ab, zu reproduzieren, sind ca. 5-140 pg / mL für Ratten und 5-35 pg / ml für Mäuse ^4,6. Die subkutane Silastic Kapseln nach den Anweisungen oben, wenn bis 300 g weiblichen Sprague-Dawley Ratten verabreicht, produzieren nur langsam abklingende 17β-Estradiol-Serumkonzentrationen von etwa 40 pg / ml Tag 2 bis 10 pg / ml Tag 35. Doch unmittelbar nach der Applikation kann ein Peak-Serumkonzentration um 1000 pg / ml erwartet werden, fallen an den physiologischen Bereich innerhalb von 8 Stunden (Abbildung 1A) ^4,5. Die Kapseln für Silastic oben beschriebenen Mäusen mit 36 ​​ug 17β-estradiol/mL, wenn sie 25 g weibliche C57BL / 6 Mäusen verabreicht, machen Serum konzentrations, die sich langsam von etwa 90 pg / ml Tag 2 bis 25 pg / ml an Tag 35 zu verringern. Dies wird wahrscheinlich durch eine ähnliche Peak vorausgeht, wie in den Ratten gefunden wurde, obwohl dies wurde nicht untersucht (Abbildung 1B) ^6.

Die perorale Nutella Verfahren mit den Dosen oben beschrieben, wenn sie 300 g weibliche Sprague-Dawley-Ratten verabreicht, macht physiologischen Konzentrationen von 17β-Östradiol mit täglichen Schwankungen zwischen 10-70 pg / ml (2A) ^4. Bei Mäusen unter Verwendung des oben Dosierung, schwanken die täglichen Ebenen zwischen etwa 20 und 120 pg / ml (2B) ^6.

. rong> 1 stilisierte Darstellung Graphen 17β-Östradiol-Konzentrationen in Ratten (A, n = 10 in Zeitpunkten bis zu 24 h, n = 15 in späteren Zeitpunkten) ^4,5 und Mäusen (B, n = 10) ⁶ nach der Implantation Kapsel. Die Silastic Kapseln produzieren einen kurzen anfänglichen Spitzenwert von Serum-Konzentrationen von bis zu 1000 pg / ml, aber Rückgang innerhalb von Stunden auf Werte unter 100 pg / ml. Für die kommenden 4-5 Wochen liefern die Kapseln stabil, obwohl stetig ab, Serum-Konzentrationen. Die schraffierten Flächen auf physiologische 17β-Estradiol-Serumkonzentrationen in intakten weiblichen Ratten und Mäusen jeweils entsprechen. Obwohl nicht visuell in den Diagrammen gezeigt haben, dass die interindividuelle Variabilität in den 17β-Östradiol-Konzentrationen, wodurch Variationskoeffizienten von 27 bis 183% bei Ratten und von 28 bis 115% bei Mäusen mit dem Silicongummi Kapselverfahrens (sehr niedrige mittlere Konzentrationen erzeugen oft hohe Variationskoeffizienten).

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2 stilisierte Darstellung Graphen 17β-Östradiol-Konzentrationen in Ratten (A, n = 15). ⁴ und Mäusen (B, n = 10) ⁶ als Folge der täglichen Verabreichung von Hormonen in Nutella. Die perorale Nutella Verfahren macht Tagesspitzen jedoch bei weitem nicht so hoch wie durch subkutane oder intravenöse Verfahren hergestellt. Dies ahmt die Pharmakokinetik von menschlichen Hormonersatztherapie und die perorale Behandlung kann für so lange wie nötig gehen, selbst wenn das obige Beispiel nur einen anfänglichen 96 Stunden vor. Die schraffierten Flächen auf physiologische 17β-Estradiol-Serumkonzentrationen in intakten weiblichen Ratten und Mäusen jeweils entsprechen. Obwohl nicht visuell in den Diagrammen gezeigt haben, dass die interindividuelle Variabilität in den 17β-Östradiol-Konzentrationen, wodurch Variationskoeffizienten von 40 bis 132% bei Ratten und von 13 bis 219% bei Mäusen mit dem Nutella Verfahren (sehr niedrigen mittleren Konzentrationen erzeugen oft hoheVariationskoeffizienten).

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Diskussion

Die Verwaltungs-Modi oben haben in früheren Studien präsentiert sich als überlegen erwiesen an gewerbliche Slow-Release-Tabletten und Injektionen in Bezug auf die Herstellung physiologischer Serum-Konzentrationen von 17β-Estradiol. Während die Slow-Release-Pellets sehr hohe und anhaltende Konzentration im Serum Spitzen produzieren, verursachen die extremen Injektionen, täglich Hormonschwankungen und erfordert wiederholte stressigen Umgang mit den Tieren ^6.4. Die Bedeutung der Wahl geeigneter Verabreichu...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Rimadyl, 50 mg / ml	Pfizer	462986	Postoperative Analgesie nach Ovarektomie.
Lubrithal Augengel	Leo Laboratories		Augenschutz während der Operation.
Jodopax Tierarzt	Pharmaxim		Chirurgie Desinfektion.
4-0 Vicryl Naht	Johnson & Johnson		Wundnaht und Eierstock-Ligation.
17β-Estradiol,> 98%	Sigma	E8875-1G	In Sesamöl für Silastic Kapseln und Nutella.
Sesamöl	Sigma	S3547-1L	Das Auflösen der 17β-Estradiol.
Silasticschlauch, ID / OD: 1.575/3.175 mm	Dow Corning	508-008	Produktion von Silastic Kapseln.
Holzstäbchen	Selefatrade	12-0783	Capping von Silastic Kapseln.
Nutella	Ferrero		Mittel für die perorale 17β-Estradiol.