Sostituzione ovariectomia e 17β-estradiolo in ratti e topi: A dimostrazione visiva

Riepilogo

Ovariectomia e la sostituzione successiva di 17β-estradiolo per mezzo di capsule silastic e Nutella per via orale sono dimostrate in ratti e topi.

Abstract

Gli estrogeni sono una famiglia di ormoni sessuali femminili, con una gamma eccezionalmente ampia di effetti. Quando i ratti e topi sono utilizzati nella ricerca estrogeni sono comunemente ovariectomizzati al fine di asportare la produzione di ormoni a ciclo rapido, che sostituisce il 17β-estradiolo esogena. Vi è, tuttavia, la mancanza di consenso per quanto riguarda come l'ormone deve essere somministrato per ottenere fisiologiche concentrazioni sieriche. Questo è fondamentale in quanto il livello di 17β-estradiolo / amministrazione metodo influenza profondamente i risultati sperimentali ^1-3. Abbiamo in una serie di studi hanno caratterizzato i diversi modi di 17β-estradiolo amministrazione, scoprendo che sottocutanei silastic capsule per via orale e per-nut-crema Nutella sono superiori al disponibili in commercio a lento rilascio pellets (prodotto dalla società di ricerca innovativa d'America) e iniezioni giornaliere in termini di produzione di fisiologiche concentrazioni sieriche di 17β-estradiolo ^4-6. Tra le advantages del dado-crema metodo, che precedentemente è stato usato per la somministrazione di buprenorfina ^7, che quando è utilizzato per somministrazione di estrogeni assomiglia perorale terapia di sostituzione ormonale e non è invasivo. Le capsule silastic sottocutaneo sono convenienti e producono più stabili le concentrazioni sieriche. In questo articolo video contiene step-by-step dimostrazioni di ovariectomia e 17β-estradiolo sostituzione ormonale da capsule silastic e Nutella per via orale in ratti e topi, seguiti da una riflessione su aspetti importanti delle procedure amministrative.

Protocollo

1. Ovariectomia attraverso la via dorsale

1. Anestetizzare la animale, ad esempio utilizzando 1,5% isoflurano (4% per l'induzione) in ossigeno / ossido nitroso 30% / miscela di 70%. Posizionare l'animale in posizione prona su una piastra riscaldante collegata ad un termometro rettale. È importante avere un sottile strato di isolamento tra l'animale e la piastra, e che il feed-back termometro mantiene la temperatura corporea entro 37 ± 0,5 ° C. Applicare il gel per la protezione degli occhi e Rimadyl somministrare 5 mg / kg di peso corporeo, diluito in soluzione salina per via sottocutanea nella regione laterale del collo dell'animale per alleviare il dolore post-operatorio.
2. Radere un 4 * 4 cm (3 * 3 cm per topi) area cephally dalla cresta iliaca. Lavarsi accuratamente rasata con per Jodopax esempio, prima di coprire l'animale con un 4 4 * foglio di intervento chirurgico di apertura cm.
3. Eseguire un'incisione 2-3 cm linea mediana e senza mezzi termini sezionare la cute dalla fascia sottostante. Uno cm lateralmente alla linea mediana, fare un altro thro incisioneugh la fascia. Schiettamente sezionare lateralmente sotto questa fascia superficialmente quanto possibile fino a raggiungere la cavità addominale.
4. Con una pinzetta, afferrare il tessuto adiposo che circonda l'ovaio nella cavità addominale ed estrarla delicatamente. Identificare l'ovaio e legare le corna uterine e dei vasi 0,5-1 cm prossimalmente di questa struttura. Tagliare il ovaie e tessuto adiposo ligato e rimettere il restante tessuto nella cavità addominale. Fai un'altra incisione nella fascia controlaterale e ripetere la procedura.
5. Chiudere le ferite, preferibilmente utilizzando una sutura monofilamento, e lasciare che l'animale sveglia dall'anestesia. Posizionare l'animale in una gabbia riscaldata (25-27 ° C) per almeno 2 ore dopo l'intervento. Gli animali devono essere alloggiati separatamente i primi giorni dopo l'intervento. E 'fondamentale che la gabbia è frequentemente pulite / sostituite durante la fase di recupero. Ventiquattro ore dopo l'intervento, gli animali iniettare per via sottocutanea con un altro Rimadyl 5 mg / kg di peso corporeo, diluito insalina.

2. La somministrazione sottocutanea di 17β-estradiolo attraverso capsule silastic

1. Mescolare la quantità desiderata di 17β-estradiolo in olio di sesamo. Per le concentrazioni fisiologiche in ratti e topi, si consiglia di 180 mcg / ml e 18-36 mg / mL, rispettivamente. Capsule di placebo sono riempiti con olio di sesamo puro.
2. Tagliare 3 cm (2 cm per topi) la lunghezza dei tubi silastic e 5 mm (3 mm per i topi) lunghezze di bastoncini di legno per collegare applicatori. Utilizzando pinze, stringere un tappo di legno nella capsula silastic prima di iniettare la soluzione 17β-estradiol/sesame olio per riempire l'intera lunghezza. Delicatamente tappare la capsula silastic alla fine aperta con un altro tappo di legno (i tappi sono tenuti a restare permanentemente nella capsula). Incubare le capsule restanti 17β-estradiolo soluzione durante la notte prima dell'impianto.
3. L'impianto della capsula può essere eseguita durante l'anestesia utilizzato a ovariectomia nei ratti. Per mice, tuttavia, un periodo di 14 giorni di recupero dopo ovariectomia Si raccomanda di minimizzare il rischio della capsula sporgente attraverso la pelle fragile.
4. Dopo i preparativi chirurgici come in 1.1, o dopo la chiusura l'incisione ovariectomia, barba e lavare a * 2 2 zona centimetri sulla parte dorsale del collo dell'animale. Eseguire un'incisione 1 cm e senza mezzi termini sezionare una tasca sottocutanea caudolaterally, con ampio spazio per la capsula. Pulire la capsula silastic (che fino a questo punto temporale è stato incubato nella 17β-estradiolo soluzione) e delicatamente installare attraverso l'incisione, che viene successivamente chiusa da una sutura. È fondamentale per assicurarsi che i ceppi capsula la pelle il meno possibile, in particolare nella zona vicino alla ferita. Da produzione di capsule per l'impianto, è importante che sia evitata la contaminazione.

3. Somministrazione orale di 17β-estradiolo tramite il Nut-crema Nutella

1. Accuratamente sciogliere 17β-estradiolo in olio di sesamo, e poi mescolare l'olio di sesamo con la Nutella. Si raccomanda che ogni porzione giornaliera contiene 28 mcg 17β-estradiolo, 5 olio di sesamo e 1 pl Nutella g per chilogrammo di peso corporeo per i ratti e 1,12 mcg 17β-estradiolo, 0,312 olio di sesamo e 60 microlitri Nutella mg per ogni 30 g mouse. Placebo nut-crema è preparata in modo identico, tranne senza il 17β-estradiolo.
2. Formare gli animali a mangiare senza ormoni nut-crema per cinque giorni precedenti l'esperimento. I primi tre giorni di formazione, i topi devono essere formati in modo ottimale in gruppi (circa 0,5 g di Nutella 2-5 animali), nelle loro gabbie a casa. Nei giorni in quarta e quinta della formazione, gli animali vengono messi in gabbie separate prima di ricevere la quota giornaliera per assomigliare alla situazione sperimentale.
3. Durante l'esperimento, gli animali vengono messi in gabbie separate per ogni occasione alimentazione, dopo che la porzione Nutella viene servita su piccole piastrelle ceramiche. Se la formazione è stata effettuata come sopra, our esperienza è che oltre il 95% dei ratti e topi accettare il dado-crema, e una volta completamente abituato, la maggior parte degli animali che consumano in pochi secondi.

4. Risultati rappresentativi

Fisiologici siero concentrazioni di 17β-estradiolo, che i metodi attuali mirano a riprodurre, sono circa 5-140 pg / mL per topi e 5-35 pg / mL per i topi ^4,6. Le capsule sottocutanee silastic secondo le istruzioni di cui sopra, se somministrato a 300 g femmina Sprague-Dawley, producono lentamente diminuendo le concentrazioni sieriche 17β-estradiolo di circa 40 pg / mL giorno 2 al 10 pg / mL giorno 35. Tuttavia, subito dopo la somministrazione, un picco di concentrazione sierica circa 1000 pg / mL può prevedere, cadendo per l'intervallo fisiologico entro 8 ore (Figura 1A) ^4,5. Le capsule silastic per topi descritti in precedenza con 36 pg 17β-estradiol/mL, quando somministrato a 25 g femmina C57BL / 6 topi, rendono siero concentrations che lentamente diminuire da circa 90 pg / ml 2 giorni a 25 pg / mL 35 giorni. Questo è probabilmente preceduta da un picco simile è stata trovata nei ratti, anche se questo non è stato studiato (figura 1B) ^6.

Il metodo Nutella via orale con i dosaggi sopra descritto, quando somministrato a 300 g femmina Sprague-Dawley, rende livelli fisiologici di 17β-estradiolo con fluttuazioni giornaliere comprese tra 10-70 pg / ml (Figura 2A) ^4. Per topi usando il dosaggio sopra, i livelli giornalieri oscillano tra circa 20 e 120 pg / mL (Figura 2B) ^6.

Rong.> Figura 1 grafici stilizzati che presentano concentrazioni di 17β-estradiolo nel ratto (A; n = 10 punti in-time fino a 24 h, n = 15 in un momento successivo i punti) ^4,5 e topi (B, n = 10) ⁶ capsula dopo l'impianto. Le capsule silastic producono un breve picco iniziale di concentrazioni sieriche fino a 1000 pg / mL, ma calo in poche ore a livelli inferiori a 100 pg / mL. Per le prossime settimane 4-5, le capsule resa stabile, anche se in costante diminuzione, le concentrazioni sieriche. Le aree ombreggiate corrispondono a concentrazioni sieriche fisiologiche 17β-estradiolo in intatti femmine di ratto e nel topo, rispettivamente. Anche se non visivamente dimostrato nei grafici, non vi è variabilità inter-individuale nelle concentrazioni di 17β-estradiolo, rendendo coefficienti di variazione 27-183% nei ratti e dal 28 al 115% nei topi con il metodo della capsula silastic (media molto bassa concentrazioni spesso generano elevati coefficienti di variazione).

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Figura 2 grafici stilizzati presentano 17β-estradiolo concentrazioni nei ratti (A, n = 15). ⁴ e topi (B, n = 10) ⁶ a seguito di somministrazione giornaliera di ormone Nutella. Il metodo Nutella perorale rende picchi giornalieri, ma non di gran lunga più alto prodotto da sottocutanea o endovenosa metodi. Questo imita la farmacocinetica della terapia ormonale sostitutiva umana, e il trattamento per via orale può procedere per il tempo necessario, anche se l'esempio precedente solo presentare un primo 96 ore. Le aree ombreggiate corrispondono a concentrazioni sieriche fisiologiche 17β-estradiolo in intatti femmine di ratto e nel topo, rispettivamente. Anche se non visivamente dimostrato nei grafici, non vi è variabilità inter-individuale nelle concentrazioni di 17β-estradiolo, rendendo coefficienti di variazione 40-132% nei ratti e dal 13 al 219% nei topi con il metodo della Nutella (concentrazioni medie molto basse spesso generano altacoefficienti di variazione).

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Discussione

Le modalità di somministrazione sopra riportati in studi precedenti hanno dimostrato superiore al commerciali a lento rilascio pellets e le iniezioni in termini di produzione di fisiologiche concentrazioni sieriche di 17β-estradiolo. Mentre il pellets a lento rilascio producono molto elevati e prolungati picchi di concentrazione sierica, le iniezioni causano estreme, fluttuazioni ormonali giornaliere e richiedono ripetute stressante la gestione degli animali ^4-6. L'importanza di scegliere le modalità d...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Rimadyl, 50 mg / mL	Pfizer	462986	Analgesia postoperatoria dopo ovariectomia.
Lubrithal eye gel	Leo Laboratories		Protezione degli occhi durante l'intervento chirurgico.
Jodopax veterinario	Pharmaxim		Chirurgia disinfezione.
Vicryl filo di sutura 4-0	Johnson & Johnson		Ferita di sutura e legatura dell'ovaio.
17β-estradiolo,> 98%	Sigma	E8875-1G	In olio di sesamo per le capsule silastic e Nutella.
Olio di sesamo	Sigma	S3547-1L	Dissolvere il 17β-estradiolo.
Tubazione di silastic, ID / OD: 1.575/3.175 millimetri	Dow Corning	508-008	Produzione di capsule silastic.
Applicatore bastone di legno	Selefatrade	12-0783	Riduzione delle capsule silastic.
Nutella	Ferrero		Media per via orale 17β-estradiolo.