Ingeniería bacterias adherentes mediante la creación de un único operón sintético curli

Resumen

El diseño de un operón que codifica sintético tanto el aparato secretor y los monómeros estructurales de fibras curli se describe. La sobreproducción de estos amiloides y polímeros adherentes permite una ganancia apreciable de adhesión de la E. coli Chasis ¹. Una manera fácil de visualizar y cuantificar la adherencia se explican.

Resumen

El método descrito aquí consiste en el rediseño de E. propiedades de adherencia coli mediante el ensamblaje de un número mínimo de genes curli bajo el control de un promotor fuerte y metal overinducible-, y en la visualización y cuantificación de la ganancia resultante de la adherencia bacteriana. Este método aplica los principios adecuados de ingeniería de la abstracción y la normalización de la biología sintética, y los resultados de la BioBrick BBa_K540000 (Mejor dispositivo BioBrick nuevo, creado, iGEM 2011).

El primer paso consiste en el diseño del operón sintético dedicado a la sobreproducción curli en respuesta a metal, y por lo tanto, en el aumento de las capacidades de adherencia de la cepa de tipo salvaje. El original operón curli fue modificada in silico con el fin de optimizar las señales de transcripción y traducción y escapar de la "natural" la regulación de curli. Este enfoque permitió poner a prueba con éxito nuestra comprensión actual de la producción curli. Moreover, simplificar la regulación curli cambiando el promotor endógeno complejo (más de 10 reguladores transcripcionales identificados) a un simple metal-regulado promotor hace que la adherencia mucho más fácil de controlar.

El segundo paso incluye la evaluación cualitativa y cuantitativa de las capacidades de adherencia por aplicación de métodos simples. Estos métodos son aplicables a una amplia gama de bacterias adherentes independientemente de las estructuras biológicas que participan en la formación de biopelículas. La adhesión de ensayo en placas de poliestireno de 24 pocillos proporciona una rápida visualización preliminar del biofilm bacteriano después de la tinción de cristal violeta. Esta prueba cualitativa puede ser intensificada por la cuantificación del porcentaje de adherencia. Tal método es muy simple, pero más precisa que la tinción con violeta de cristal como se describió anteriormente ¹ tanto con una buena repetibilidad y reproducibilidad. Visualización de las bacterias buenas prácticas agrarias de etiquetado sobre portaobjetos de vidrio por fluorescencia o conf lásermicroscopía vecinal permite reforzar los resultados obtenidos con la prueba de la placa 24-bien por observación directa del fenómeno.

Introducción

La adherencia bacteriana al apoyo abiótico juega un papel importante en las celdas de combustible de biorremediación, biocatálisis o microbiana. Procesos de biorremediación utilizar las capacidades de los microorganismos para degradar las sustancias orgánicas, o para modificar la distribución de metal (inmovilización, volatilización) o especiación. Estas actividades beneficiosos se observan en los ecosistemas acuáticos y terrestres, sino también en los sistemas artificiales desarrollados para tratar el agua contaminada de los residuos industriales y domésticos. La intensidad y la calidad de la de la actividad microbiana dependerá de factores físico-químicas, sino también en el estilo de vida de los microorganismos (libre flotación o incrustados en biofilm). La formación de biopelículas se asocia con un metabolismo de promover la resistencia a los biocidas por diversos mecanismos. Este fenómeno lo tanto, se recomienda en la mayoría de procesos de biorremediación. Además, la ingeniería células de Escherichia coli para controlar la formación de biopelículas se ha aplicado con éxito ainmovilizar células enteras sensores de biochips ^2-3.

La adaptación de los microorganismos a alta concentración de metales se produce a través de diversos mecanismos tales como la adsorción a los componentes de la matriz extracelular, la activación de la bomba de eflujo o portadores específicos capaces de concentrar el metal en la célula. Impulsar estas actividades bacterianas a través de la ingeniería genética permite el tratamiento eficaz y barato de contaminación por metales a escala de laboratorio, especialmente en el caso de metales altamente tóxicos en cantidad débil tal como se describe por Raghu et al. 2008 ^4. Remediación bacteriana representa en este caso un método de ahorro competitivo y rentable en comparación con los procesos químicos clásicos utilizando resinas de intercambio iónico. Los autores describen una E. chasis coli genéticamente modificada para la captación y retención de cobalto primero por la anulación de la bomba de eflujo gen que codifica RCNA, y luego por la transformación con un exceso de producción de múltiples copias de plásmido que permite unatransportador con una captación preferencial para el cobalto. Tal cepa aparece como una alternativa eficaz a resinas de intercambio iónico para el tratamiento de efluentes radiactivos, pero un problema no resuelto es la clave de recuperación de bacterias contaminadas al final del proceso ^4. El objetivo de nuestro trabajo fue por lo tanto, para diseñar una cepa de diseño personalizado capaz de pegarse a soportes abióticos tales como vidrio o plástico.

Entre el conjunto de adhesinas y fimbrias adherentes identificado en bacterias Gram-, se optó por diseñar un sistema que permita la producción curli. Curli son fibras amiloides delgadas (2-5 nm de diámetro) y agregación altamente que sobresalen de la E. coli y Salmonella como ^5-7 superficie de una matriz no cristalina e insoluble. Curli también están involucrados en la colonización de superficies abióticas y el desarrollo de biopelículas ^8. Curli se demostró recientemente que unirse a los iones de mercurio ^9. Los amiloides son de hecho se sabe que poseen altoafinidad por los iones de metales tales como Cu ^{2 +,} Zn ^{2 +} y Fe ^{3 + 10.} Esta propiedad podría mejorar aún más la descontaminación de metales de efluentes contaminados. El clúster csg es responsable de la producción de fibras de curli y está constituido de dos operones divergentemente transcritos (Figura 1). El CSGB, csgA y genes CSGC constituyen el operón de sentido, que codifican las dos subunidades curli, csgA y CSGB. CSGC parece estar involucrado en la actividad redox en el sistema de biogénesis curli y afectar al comportamiento CsgG poro ^11. Sin embargo, la ausencia de CSGC en la mayoría de las bacterias productoras de curli indica que la proteína correspondiente proporciona sólo un nivel secundario de control sobre la biogénesis curli. Para simplificar el sistema, que han sido elegidos para trabajar con el mínimo número de genes.

El csgDEFG operonencodes proteínas esenciales en la regulación y transportede csgA y CSGB a la superficie celular. CsgD es un activador transcripcional del operón csgBAC y desempeña un papel clave en el control de la formación de biopelículas mediante el control de la producción de fimbrias curli y otros componentes de la biopelícula como la celulosa y ¹² por inhibición de la producción flagelo ^13. CSGE, CSGF y CsgG constituyen un aparato secretor curli-específico en la membrana externa a través de la cual la mayor curli subunidad de la proteína csgA se secreta como una proteína soluble. La polimerización de csgA es dependiente in vivo en la membrana CSGB nucleador proteína (revisado en ^14). Complejas vías reguladoras que involucran varios sistemas de dos componentes se han demostrado para controlar la expresión de genes curli ^15-16. Estas complejas regulaciones permiten que las bacterias forman biofilms gruesas a través de la producción curli en respuesta a señales ambientales, pero son difíciles de controlar para aplicaciones industriales. Para facilitar la recuperación de la metal-rellenas bacterias durante un proceso industrial, la fijación de bacterias a un soporte sólido de hecho tiene que ser controlada por el parámetro bien definido (s). Las propiedades de adherencia de curli están vinculados a su naturaleza amiloide ¹⁷ y se podría utilizar para mejorar los procesos de biorremediación, pero un dispositivo más simple y controlado fácilmente tiene que ser creado.

Entre estos 7 genes ^18, un conjunto de 5 absolutamente necesario genes para la síntesis de curli (CSGB y csgA monómeros de fibra de codificación) y exportación (CSGE CSGF y csgG, que codifica el complejo de la secreción de curli) fueron seleccionados para construir el operón sintético. Para escapar de la "natural" regulación de curli, un operón sintético que comprende estos genes CSG 5 bajo el control de un promotor fuerte y cobalto overinducible-(Figura 2) fue diseñado y sintetizado. El análisis paso a paso de la región de codificación de curli y el procedimiento de diseño de un funcional SYNtético operón se describen. Dos métodos para visualizar y cuantificar la adherencia bacteriana al poliestireno cristal y se explican.

Protocolo

1. BioBrick Diseño y Síntesis de la Operon curli

1. Determinar la organización genética y localizar las señales endógenas transcripción y la traducción de los genes curli. Estas informaciones están reunidos en bases de datos especializadas, tales como RegulonDB ^una o ECOGENE ^b y terminado por una lectura cuidadosa de las publicaciones pertinentes. Gestión de datos y en preanalítica silico se realizaron con el software Clone ^c Manager.
2. Seleccione las secuencias de codificación pertinentes. Un conjunto de cinco genes absolutamente necesario para la síntesis de curli (CSGB y csgA monómeros de fibra de codificación) y exportación (CSGE CSGF y csgG, que codifica el complejo de la secreción de Curlin) fueron seleccionados para construir el operón sintético. Extraer las secuencias elegidas de la base de datos en formato FASTA.
   A medida que el clúster csgGFE es antisentido en E. coli genoma, convertir esta secuencia en su counterp complemento inversoarte mediante el uso de las herramientas de Operations Manager Clon> molécula Proceso> Invertir molécula. Pegue la secuencia csgEFG detrás csgBA mediante el uso de la función "Lígate" (Clone> Lígate).
3. Añadir el promotor adecuado. Mediante la colocación de los cinco genes seleccionados curli bajo el control del promotor P RCN, curli se prevé que se produce en exceso en presencia de cobalto y níquel. El locus rcn codifica una bomba de eflujo responsable de la desintoxicación Ni y Co (RCNA) y sus afines regulador metalo-(rcnR). RcnR controla la expresión de RCNA y su propio gen en respuesta a Ni y Co ^19. La secuencia de RCN comprende CDS rcnR, la región intergénica RCN conjunto más los 41 primeros nucleótidos de RCNA era placedin frente de la secuencia de csgBAEFG quimérico (Figura 1, la secuencia de la construcción entera se proporciona como datos suplementarios).
4. Optimizar la transcripciónseñales. Un perfecto sitio de unión al ribosoma (RBS o perfecto = AAGGAGGTATATA) se añadió en frente de la primera ATG de la secuencia de ADN csgBA. Un segundo RBS perfecto se añadió en frente de la secuencia csgEFG. Endógeno RBS para la CSGB y genes CSGF csgG y se conservaron.
5. Para adaptarse a las normas iGEM, el dispositivo debe estar flanqueado por una norma BioBrick prefijo y sufijo, que contiene sitios de restricción para Eco RI, Pst I (prefijo) y Spe I y Xba I (sufijo). Pega las secuencias correspondientes en cada extremo del dispositivo ^d.
6. Eliminar cualquier Eco RI, Pst I, Spe I y Xba I en el sitio de reconocimiento del dispositivo. Para facilitar el proceso de montaje adicional, la parte BioBrick sí mismo no puede contener ninguno de estos sitios de restricción. En el análisis de restricción silico del dispositivo reveló un sitio Pst I en la secuencia csgA, un sitio Pst I en la secuencia rcnRy un sitio Eco RI en el gen CSGE. Estos sitios están situados respectivamente en la posición 80 (Mut1), 1340 (Mut2) y 1830 (MUT3) de la secuencia de dispositivos (de datos) y se modificaron de la siguiente manera por mutaciones silenciosas.
   Mut1 Pst I sitio CTGCAG cambiado en CGTCTG
   Mut2 Pst I sitio CTGCAG cambiado en CAGCAG
   Mut3 Eco RI GAATTC sitio cambiado en GAATT
7. Ejecutar a través de la simulación de traducción utilizando el software Clone Manager (Funcionamiento> moléculas de procesos> Traducir moléculas). Utilice la secuencia de alineación BLAST programa para comprobar la homología perfecta entre la proteína de tipo salvaje curli y las proteínas codificadas por el operón sintético.
8. Pide el operón sintético. Los servicios comerciales de síntesis de genes están disponibles en numerosas compañías a nivel mundial, nuestro compañero estaba Genecust (Luxemburgo). 4 g del operón artificial (3165 bp) se recibió semanas más tarde y se insertó en pUC57 (pIG2).

2. Visualizar y cuantificar bacterias adheridas en poliestireno

1. Llenar cada pocillo de una placa de poliestireno de 24 pocillos con 2 ml de medio mínimo M63 (glucosa 0,2%) e inocular cada pocillo con 106 células de un cultivo durante la noche. Crecer las bacterias a 30 º C durante 18 a 48 horas sin agitación. Cada columna (4 pocillos) representa una modalidad. Añadir la cantidad apropiada de cobalto (25 a 100 mM) y antibióticos (ampicilina 100 μg.L ^-1) cuando sea necesario. Las 3 primeras filas de la placa de 24-así se utilizan para cuantificar las bacterias adherentes por el promedio de las 3 repeticiones, la última fila de la izquierda se utiliza para visualizar la biopelícula.
2. Para las 3 primeras filas de la placa de 24-así: para cada pocillo, recuperar el sobrenadante que contiene las células planctónicas.
3. Enjuagar cuidadosamente cada pocillo con 1 ml de M63 y la piscina de lavado de 1 ml con el sobrenadante inicial obtenida en 2,2). Esta agrupación se denominan células de natación (= S).
4. Recuperar el biofilm en 1 ml of M63 raspando y pipetear hacia arriba y hacia abajo (= B). Vortex 15 sec. Estimar el número de bacterias adheridas en la superficie o natación desde la densidad óptica a 600 nm (DO600) para dar el porcentaje de adherencia correspondiente a cada modalidad.
5. El porcentaje de adhesión se calcula utilizando la fórmula: BX100 / (3xs + B).
6. Sólo para la última fila de la placa de 24 pocillos: descartar las células planctónicas.
7. Enjuague con 1 ml de M63 el biofilm que se había desarrollado en la parte inferior de la placa.
8. Secar la placa abierta durante 1 hora a 80 ° C.
9. Añadir 100 ml de cristal violeta al 20% durante 2 min en cada pocillo seguido de lavados extensivos con agua para visualizar las bacterias adheridas en la superficie.
   Tres ensayos independientes (placas) tienen que ser realizadas para asegurar la reproducibilidad.

3. Visualice las bacterias adheridas sobre el vidrio por Microscopía

1. Obtener un chasis fluorescente. La E. coli SCC1 ^e cepa que constitutively expresa la proteína verde fluorescente (GFP), sin diferencia observable a partir de la cepa madre MG1655 ²⁰ es un huésped adecuado para el plásmido que lleva el operón sintético curli.
2. SCC1 transformar con el plásmido pIG2 (= operón sintético curli insertado en el fragmento Eco RI / Pst I sitio del plásmido pUC57) para obtener la cepa S23. Transformar SCC1 con un plásmido control (pUC18) para obtener la cepa de control S24 ^21.
3. Crecer precultivos de la noche a la mañana S23 y del control (S24) de las cepas a 30 º C en M63 suplementado con glucosa (0,2%) y ampicilina (100 μg.L ^-1).
4. Inocular 15 ml del mismo medio en placas de Petri con 100 l de los precultivos. Añadir la concentración adecuada de cobalto (es decir, 25 mM) y no se olvide el control negativo sin cobalto. Introducir 3 cubreobjetos de vidrio rectangular en cada placa de Petri. Incubar durante una noche a 30 ° C sin agitación.
5. Quite el cubreobjetos de aquí para allám la placa de Petri y cuidadosamente drenarlo. Limpie cuidadosamente la cara inferior con un pequeño algodón impregnado cosas con etanol 70 ° frotando cada residuo bacteriano. Para la observación confocal, limpiar ambos extremos superiores en unos pocos milímetros para permitir la fijación adicional de la cubreobjetos.
6. Bacterias adherentes pueden ser visualizados directamente pero rápidamente bajo microscopio de fluorescencia, pero cuidadosamente evitar el secado de la muestra.
7. Para la observación confocal, depositar el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio con la cara superior cubierta por la biopelícula coloca boca arriba. La biopelícula se cubre con un cubreobjetos más grande, que está fijado a la placa de vidrio con el barniz. Invertir la configuración de modo que el biofilm estará ahora en la cara inferior.
8. Coloque la configuración en el microscopio láser confocal. Un derecho Axioplan2 LSM510 (Zeiss) microscopio láser confocal se utilizó en la plataforma Platim ^f.
9. Configuración. Excite GFP a 488 nm, y recoger la fluorescencia de bacterias en el intervalo de 500 a 600 nm . Utilice objetivo de 40x de inmersión en aceite para la adquisición de imágenes en modo de escaneo láser confocal. Analizar los generales estructuras tridimensionales de las biopelículas de la superficie sólida a la interfaz con el medio de crecimiento, utilizando un paso de 1 m.
10. Realizar proyecciones tridimensionales con Imaris software (Bitplane, Zürich, Suiza). Determine el espesor de la biopelícula por el análisis de la media del valor z a lo largo de secciones longitudinales estadísticos. Cuantificación de biovolumes biopelícula puede ser extraído de confocal z-pilas tal como se describe en otra parte ^22.

^un RegulonDB proporciona información mecanicista sobre operón organización y su descomposición en unidades de transcripción, promotores y su tipo sigma, los genes y sus sitios de unión al ribosoma, terminadores, sitios de unión específicos de reguladores transcripcionales, así como su organización en frases reguladoras.et = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp

^b La base de datos Ecogene contiene información actualizada acerca de la E. coli K-12 del genoma y proteoma secuencias de genes, incluyendo bibliografías extensas. Un enfoque Ecogene importante ha sido la re-evaluación de los sitios de inicio de traducción. http://ecogene.org/

^c http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm

^d http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix

^e Regalo de Chun Chau Sze, Nan Yang Universidad Técnica de Singapur.

^f Platim microscópico plataforma UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

Resultados

En silico anotación de la secuencia de tipo salvaje de E. csg coli K12 asociada con la optimización de las señales de transcripción y de la traducción ha permitido diseñar el único operón sintético curli P RCN-csg muestra en la Figura 3 (secuencia completa en los datos suplementarios). Protocolo 2 y 3 protocolo se utiliza para visualizar y cuantificar la adherencia asociada con la producción de curli. Uso de la tinción de cristal violeta en placas de poliestireno de...

Discusión

Los pasos críticos

El paso más crítico en este enfoque de la biología sintética es el diseño de genes. Diseño gen sintético tiene que ser meticuloso para asegurar una producción eficiente del sistema. Dos genes que codifican los monómeros de fibras y tres genes que codifican proteínas implicadas en su sistema de secreción han sido ensamblados con un promotor fuerte y metal-inducible para crear una nueva unidad funcional para una aplicación novedosa: la bio-descontaminación de eflu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
pIG2			pUC57 (ori pMB1, 2710 pb) con un 3165 pb EcoRI / PstI que contiene el fragmento sintético RCN P - csgBAEFG operón; Amp r
pUC18			Plásmido multicopia (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr
S23			SSC1 (= GFP-etiquetados MG1655, regalo de CC Sze) / pIG2
S24			SSC1/pUC18
CoCl 2	Sigma		0,1 M solución de mantenerse a temperatura ambiente
M63			29
24-así placa	Nunc	55429	Poliestireno de 24 pocillos