Ingénierie bactéries adhérentes en créant un simple synthétique Curli Operon

Résumé

La conception d'un encodage opéron synthétique à la fois l'appareil sécrétoire et les monomères de fibres structurelles curli est décrite. Surproduction de ces amyloïdes et les polymères adhérentes permet un gain mesurable de l'adhésion de l' E. coli Châssis ¹. Une façon simple de visualiser et de quantifier l'adhérence sont expliqués.

Résumé

La méthode décrite ici consiste à redessiner E. coli propriétés d'adhérence par assemblage au nombre minimum de gènes curli sous le contrôle d'un promoteur fort et un métal overinducible, et à visualiser et de quantifier le gain résultant de l'adhésion bactérienne. Cette méthode s'applique principes d'ingénierie appropriées de l'abstraction et de la normalisation de la biologie synthétique, et les résultats de la BioBrick BBa_K540000 (Meilleur appareil BioBrick nouvelle, d'ingénierie, iGEM 2011).

La première étape consiste en la conception de l'opéron de synthèse consacré à la surproduction curli en réponse à métal, et donc à augmenter les capacités d'adhérence de la souche de type sauvage. L'original a été modifié curli opéron in silico afin d'optimiser signaux de transcription et de traduction et d'échapper à la régulation «naturelle» des curli. Cette approche a permis de tester avec succès notre compréhension actuelle de la production curli. Moreover, simplifier la réglementation curli en commutant le promoteur endogène complexe (plus de 10 régulateurs transcriptionnels identifié) à un simple métal réglementé promoteur rend l'adhésion beaucoup plus facile à contrôler.

La deuxième étape comprend l'évaluation qualitative et quantitative des capacités d'adhérence par la mise en œuvre de méthodes simples. Ces méthodes sont applicables à un large éventail de bactéries adhérentes indépendamment des structures biologiques impliqués dans la formation de biofilm. Test d'adhérence à des plaques de polystyrène de 24 puits fournit une visualisation rapide préliminaire du biofilm bactérien après coloration au cristal violet. Ce test qualitatif peut être aiguisé par la quantification du pourcentage d'adhérence. Une telle méthode est très simple mais plus précis que coloration au violet de cristal que comme décrit précédemment ¹ avec une bonne répétabilité et de reproductibilité. Visualisation des bactéries GFP-marqués sur des lames de verre par fluorescence ou conf lasermicroscopie ocal permet de renforcer les résultats obtenus avec le test de la plaque de 24 puits par l'observation directe du phénomène.

Introduction

L'adhérence des bactéries à l'appui abiotiques jouent un rôle majeur dans les piles à combustible bioremédiation, biocatalyse ou microbienne. Procédés de bioremédiation utiliser les capacités des micro-organismes pour dégrader les substances organiques, ou de modifier la distribution des métaux (immobilisation, volatilisation) ou spéciation. Ces activités bénéfiques sont observés dans les écosystèmes aquatiques et terrestres, mais aussi dans les systèmes artificiels développés pour traiter l'eau polluée de déchets industriels et domestiques. L'intensité et de la qualité de l'activité microbienne dépend de facteurs physico-chimiques, mais aussi sur le mode de vie des micro-organismes (flottement libre ou encastré dans biofilm). La formation d'un biofilm est associée à une résistance à promouvoir le métabolisme des biocides par des mécanismes divers. Ce phénomène va donc être encouragée dans la plupart des processus de bioremédiation. En outre, les cellules d'Escherichia coli ingénierie pour contrôler la formation du biofilm a été appliquée avec succès àimmobiliser la cellule entière capteurs sur les biopuces ^2-3.

Adaptation des micro-organismes à forte concentration de métaux se fait par des mécanismes divers tels que l'adsorption sur les composants de la matrice extracellulaire, l'activation de la pompe d'efflux ou supports spécifiques capables de concentrer le métal dans la cellule. Stimuler ces activités bactériennes par génie génétique permet un traitement efficace et pas cher de pollution par les métaux à l'échelle du laboratoire, en particulier dans le cas des métaux hautement toxiques en faible quantité, comme décrit par Raghu et al. 2008 ^4. Assainissement bactérienne représente dans ce cas une méthode économie compétitive et rentable par rapport aux procédés chimiques classiques utilisant des résines échangeuses d'ions. Les auteurs ont décrit un E. châssis coli génétiquement modifié pour l'absorption et la rétention de cobalt par KO première pompe d'efflux du gène codant RCNA, puis par transformation avec un plasmide multicopie surproduction permettant detransporteur avec captation préférentielle pour le cobalt. Une telle souche apparaît comme une alternative efficace aux résines échangeuses d'ions pour le traitement des effluents radioactifs, mais une question essentielle non résolue est la récupération de bactéries contaminés à la fin de la procédure ^4. L'objectif de notre travail était donc de concevoir une souche conçu sur mesure pour coller sur des supports abiotiques tels que le verre ou le plastique.

Parmi l'ensemble des adhésines et des fimbriae adhérent identifiés dans bactéries Gram-, nous avons choisi de concevoir un système permettant la production de curli. Curli sont des fibres amyloïdes minces (2-5 nm de diamètre) et très agrégative qui font saillie à partir de la E. coli et Salmonella surface sous forme de matrice non cristalline insoluble et ^5-7. Curli sont également impliqués dans la colonisation des surfaces abiotiques et le développement de biofilms ^8. Curli ont été récemment montré à lier les ions de mercure ^9. Amyloïdes sont en effet connus pour posséder une grandeaffinité pour les ions de métaux tels que le Cu ^{2 +,} Zn ^{2 +} et Fe ^{3 + 10.} Cette propriété pourrait améliorer encore la décontamination des effluents pollués métalliques. Le cluster csg est responsable de la production de fibres curli et est constitué de deux opérons divergente transcrites (Figure 1). Le CSGB, csgA et les gènes SCSC constituent l'opéron sens, codant pour les deux sous-unités curli, l'ACPS et CSGB. SCSC semble être impliqué dans une activité redox dans le système de la biogenèse des curli et d'affecter le comportement des pores CsgG ^11. Cependant, l'absence d'SCSC dans la majorité des bactéries productrices de curli indique que la protéine correspondante fournit seulement un niveau secundary de contrôle de la biogenèse des curli. Pour simplifier le système, nous avons choisi de travailler avec le nombre minimal de gènes.

Le csgDEFG operonencodes protéines essentielles dans la régulation et le transportde l'ACPS et CSGB à la surface cellulaire. CsgD est un activateur de la transcription de l'opéron csgBAC et joue un rôle clé dans le contrôle de la formation de biofilms en contrôlant la production de fimbriae curli et les composants du biofilm d'autres telles que la cellulose ¹² et en inhibant la production flagelle ^13. CSGE, CsgF et CsgG constituer un appareil de sécrétion curli spécifique dans la membrane externe à travers lequel la sous-unité protéique majeur curli ACPS est sécrétée comme une protéine soluble. La polymérisation de l'ACPS dépend in vivo sur la CSGB membranaire des protéines de nucléation (revue dans ^14). Voies de régulation complexes impliquant plusieurs systèmes à deux composants ont été montré pour contrôler l'expression du gène curli ^15-16. Ces règlements complexes permettent aux bactéries de former des biofilms épais via la production curli en réponse à des signaux environnementaux, mais sont difficiles à contrôler pour les applications industrielles. Afin de faciliter la reprise de l'a rencontréal-farcies bactéries au cours d'un processus industriel, la fixation des bactéries sur un support solide doit en effet être contrôlé par le paramètre bien défini (s). Les propriétés adhérentes de curli sont liés à leur ¹⁷ nature amyloïde et pourrait être utilisé pour améliorer les processus de bioremédiation, mais un dispositif simple et facile à contrôler doit être créé.

Parmi ces 7 gènes ^18, un ensemble de 5 gènes absolument nécessaire pour la synthèse des curli (CSGB et des monomères de l'ACPS en fibre de codage) et à l'exportation (CSGE csgF et csgG, codant pour le complexe sécrétion curli) ont été sélectionnés pour construire l'opéron synthétique. Pour échapper à la régulation «naturelle» des curli, un opéron synthétique comprenant ces 5 gènes CSG sous le contrôle d'un promoteur fort et le cobalt-overinducible (figure 2) a été conçu et synthétisé. L'analyse pas-à-pas de la région codant pour curli et la procédure de conception pour un fonctionnement synthétique opéron sont décrits. Deux méthodes permettent de visualiser et de quantifier l'adhérence bactérienne au polystyrène et le verre sont expliqués.

Protocole

1. Conception et synthèse BioBrick de l'opéron Curli

1. Déterminer l'organisation génétique et de localiser les signaux de transcription et de traduction endogènes des gènes curli. Ces informations sont rassemblées dans des bases de données spécialisées telles que RegulonDB ^un ou ECOGENE ^b et complétée par une lecture attentive des publications pertinentes. Gestion des données et de pré-analyse in silico ont été réalisées avec le logiciel Clone directeur ^c.
2. Sélectionnez les séquences codantes pertinents. Un ensemble de cinq gènes absolument nécessaires pour la synthèse des curli (CSGB et des monomères de l'ACPS en fibre de codage) et à l'exportation (CSGE csgF et csgG, codant pour le complexe sécrétion Curlin) ont été sélectionnés pour construire l'opéron synthétique. Extraire les séquences choisies à partir de la base de données au format FASTA.
   Comme le cluster csgGFE est antisens dans E. génome coli, convertir cette séquence dans son counterp complément inversetechnique en utilisant les outils Operations Manager Clone molécule> Processus> Inverser la molécule. Coller la séquence csgEFG derrière csgBA en utilisant la fonction "Ligate" (Clone> Ligate).
3. Ajouter le promoteur approprié. En plaçant les cinq gènes sélectionnés curli sous le contrôle du promoteur P rcn, curli sont prévus pour être trop produit en présence de cobalt et de nickel. Le locus rcn code pour une pompe à efflux responsables de désintoxication Ni et Co (ARCM) et son apparenté métallo-régulateur (RMRC). RMRC contrôle l'expression de son gène et RCNA propre en réponse à Ni et Co ^19. La séquence comprenant rcn CDS RMRC, la région intergénique rcn ensemble ainsi que les 41 premiers nucléotides de RCNA était avant placedin de la séquence csgBAEFG chimérique (Figure 1, la séquence de toute la construction est prévu en tant que données supplémentaires).
4. Optimiser la transcriptionsignaux. Une parfaite du site de fixation des ribosomes (RBS ou parfait = AAGGAGGTATATA) a été ajouté en face du premier ATG de la séquence d'ADN csgBA. Un deuxième RBS parfaite a été ajouté à l'avant de la séquence csgEFG. RBS endogène pour la CSGB et les gènes csgF et csgG ont été conservés.
5. Pour adapter les normes iGEM, l'appareil doit être encadré par un préfixe standard BioBrick et le suffixe, contenant des sites de restriction pour EcoRI, Pst I (préfixe) et Spe I et Xba I (suffixe). Coller les séquences correspondant à chaque extrémité de l'appareil ^d.
6. Éliminer toute Eco RI, Pst I, Spe I et le site Xba reconnaissance I dans l'appareil. Pour faciliter le processus de montage ultérieur, la partie BioBrick lui-même ne peut contenir aucun de ces sites de restriction. Dans l'analyse de restriction in silico de l'appareil a révélé un site Pst I dans la séquence csgA, un site Pst I dans la séquence RMRCet un site Eco RI dans le gène CSGE. Ces sites sont situés respectivement en position 80 (Mut1), 1340 (Mut2) et 1830 (mut3) de la séquence des unités (données supplémentaires) et ont été modifiés par suite des mutations silencieuses.
   Mut1 site Pst I CTGCAG changé dans CGTCTG
   Mut2 site Pst I CTGCAG changé dans CAGCAG
   Mut3 GAATTC site Eco RI changé dans GAATT
7. Courir à travers la simulation traduction en utilisant le logiciel de gestion Clone (> Fonctionnement molécules processus> Traduire molécules). Utiliser le programme BLAST séquence d'alignement pour vérifier l'homologie parfaite entre la protéine de type sauvage curli et les protéines codées par l'opéron de synthèse.
8. Commandez le opéron synthétique. Les services commerciaux de synthèse de gènes sont disponibles à partir de nombreuses sociétés à travers le monde, notre partenaire a été GeneCust (Luxembourg). 4 pg de l'opéron artificiel (3165 pb) ont été reçus quelques semaines plus tard et inséré dans pUC57 (pIG2).

2. Visualiser et de quantifier les bactéries adhérentes sur polystyrène

1. Remplir chaque puits d'une plaque de polystyrène de 24 puits avec 2 ml de milieu minimum M63 (0,2% de glucose) et inoculer chaque puits avec 106 cellules d'une culture de la nuit. Croître les bactéries à 30 ° C pendant 18 à 48 heures sans agitation. Chaque colonne (4 puits) représente une modalité. Ajouter la quantité voulue de cobalt (25 à 100 mM) et un antibiotique (ampicilline 100 μg.L ^-1) en cas de besoin. Les 3 premières rangées de la plaque de 24 puits sont utilisés pour quantifier les bactéries adhérentes faisant la moyenne des 3 répétitions, la dernière ligne gauche est utilisé pour visualiser le biofilm.
2. Pour les 3 premières rangées de la plaque de 24 puits: pour chaque puits, récupérer le surnageant contenant les cellules planctoniques.
3. Rincer soigneusement chaque puits avec 1 ml de M63 et de la piscine de lavage avec 1 ml du surnageant initial obtenu en 2.2). Cette catégorie est appelé en tant que cellules de natation (= S).
4. Récupérer le biofilm dans 1 ml of M63 par grattage et aspiration et refoulement (= B). Vortex 15 sec. Estimer le nombre de bactéries en surface jointes et la natation à partir de la densité optique à 600 nm (DO600) pour donner le pourcentage adhésion correspondant à chaque modalité.
5. Le pourcentage d'adhérence est calculée en utilisant la formule: BX100 / (3XS + B).
6. Seulement pour la dernière rangée de la plaque de 24 puits: jeter les cellules planctoniques.
7. Rinçage avec 1 ml de M63 le biofilm qui s'est développé sur la partie inférieure de la plaque.
8. Sécher la plaque ouverte pendant 1 heure à 80 ° C.
9. Ajouter 100 ul de violet cristal 20% pendant 2 min dans chaque puits suivi par des lavages importants avec de l'eau afin de visualiser les bactéries de surface inscrits.
   Trois essais indépendants (plaques) doivent être effectués pour s'assurer de la reproductibilité.

3. Visualisez les bactéries adhérentes sur le verre par microscopie

1. Obtenir un châssis fluorescent. L'E. souche ^E. coli SCC1 qui constitutively exprime la protéine fluorescente verte (GFP), sans différence notable de la souche MG1655 ²⁰ est un hôte approprié pour la synthèse du plasmide portant l'opéron curli.
2. Transformer SCC1 avec le plasmide pIG2 (= opéron synthétique curli inséré à l'Eco RI / Pst I du plasmide site de pUC57) pour obtenir la souche S23. Transformer SCC1 avec un plasmide contrôle (pUC18) pour obtenir la souche témoin S24 ^21.
3. Cultivez précultures nuit du S23 et du contrôle (S24) des souches à 30 ° C en moyenne M63 supplémenté avec du glucose (0,2%) et de l'ampicilline (100 μg.L ^-1).
4. Inoculer 15 ml du même milieu en boîtes de Pétri avec 100 ul de la pré-cultures. Ajouter à la concentration appropriée de cobalt (soit 25 uM) et n'oubliez pas le contrôle négatif sans cobalt. Introduire 3 lamelle de verre rectangulaire dans chaque boîte de Pétri. Incuber une nuit à 30 ° C sans agitation.
5. Enlever les lamelles vientm la boîte de Pétri et soigneusement égoutter. Nettoyer soigneusement la face inférieure d'une étoffe de coton imprégné de petite éthanol à 70 ° par essuyer tout résidu bactérien. Pour l'observation confocale, nettoyer les deux extrémités supérieures sur quelques millimètres pour permettre la fixation supplémentaire de la lamelle.
6. Bactéries adhérentes peuvent être visualisés directement, mais rapidement sous microscope à fluorescence, mais soigneusement éviter le séchage de l'échantillon.
7. Pour l'observation confocale, déposer la lamelle sur une lame de verre avec la face supérieure recouverte par le film biologique placé face vers le haut. Le biofilm est ensuite recouvert d'une lamelle couvre-objet plus grand, qui est fixé sur la lame de verre avec vernis. Inverser la configuration pour que le biofilm sera désormais sur la face inférieure.
8. Placez la configuration sous le microscope laser confocal. Un droit Axioplan2 LSM510 (Zeiss) microscope confocal au laser a été utilisé à la plate-forme de ^f Platim.
9. Définition. GFP exciter à 488 nm, et de recueillir la fluorescence bactérienne dans la plage de 500 à 600 nm . Utilisez 40x objectif à immersion d'huile d'acquisition d'images à balayage laser confocal Mode. Balayer l'ensemble des structures tridimensionnelles des biofilms de la surface du solide à l'interface avec le milieu de croissance, à l'aide d'une étape consistant à 1 um.
10. Effectuer projections tridimensionnelles avec Imaris logiciel (Bitplane, Zürich, Suisse). Déterminer l'épaisseur du biofilm par l'analyse de la valeur moyenne z le long de sections longitudinales statistiques. Quantification des biovolumes biofilm peut être extraite de confocale z-piles comme décrit par ailleurs ^22.

^un RegulonDB fournit des informations sur l'organisation mécanique opéron et leur décomposition en unités de transcription, des promoteurs et leur type sigma, des gènes et de leurs sites de liaison ribosomale, des terminateurs, des sites de liaison spécifiques de régulateurs transcriptionnels, ainsi que leur organisation en phrases réglementaires.et = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp

^b La base de données contient des informations actualisées ECOGENE sur le E. coli K-12 du génome et du protéome des séquences de gènes, y compris des bibliographies étendues. Une attention ECOGENE majeur a été la réévaluation des sites d'initiation de la traduction. http://ecogene.org/

^c http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm

^d http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix

cadeau de Chun Chau ^e Sze, Nan Yang Technical University, Singapour.

^f Platim microscopique plate-forme UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

Résultats

Annotation in silico de la séquence de type sauvage de csg E. coli K12 associée à l'optimisation des signaux de transcription et de traduction a permis de concevoir la seule synthétique curli opéron P rcn-CSG représenté sur la figure 3 (séquence complète de données supplémentaires). Protocole n ° 2 et le protocole 3 ont été utilisés pour visualiser et quantifier l'adhérence associée à la production curli. Utilisation coloration au cristal vio...

Discussion

Les étapes critiques

L'étape la plus critique dans cette approche de la biologie synthétique est la conception gène. Conception gène synthétique doit être méticuleux pour assurer une production efficace du système. Deux gènes codant pour les monomères de fibres et de trois gènes codant pour des protéines impliquées dans leur système de sécrétion ont été assemblés avec un promoteur fort et inductible métal pour créer une nouvelle unité fonctionnelle pour une nouvelle a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
pIG2			pUC57 (pMB1 ori, 2710 pb) avec un 3165 pb EcoRI / PstI contenant la synthèse P rcn - csgBAEFG opéron; Ampr
pUC18			Plasmide multicopie (pMB1 ori, 2686 pb), Ampr
S23			SSC1 (= GFP-étiqueté MG1655, don de CC Sze) / pIG2
S24			SSC1/pUC18
CoCl 2	Sigma		0,1 M solution de conservées à la température ambiante
M63			29
Plaque de 24 puits	Nunc	55429	Polystyrène plaques à 24 puits