単一の合成Curliオペロンを作成して付着細菌を工学

要約

分泌装置とcurli繊維構造モノマーの両方をコードする合成オペロンの設計について説明する。これらのアミロイドと接着ポリマーの過剰産生の付着の測定可能なゲインを許可 E大腸菌のシャーシ ¹。アドヒアランスを可視化し、定量化するための簡単​​な方法を説明しています。

要約

ここで説明する方法は、 大腸菌を再設計することで構成されています強いと金属overinducibleプロモーターの制御下にcurli遺伝子の最小数を組み立てることにより、細菌の付着の結果として生じるゲインを可視化し、定量化における大腸菌の付着特性。この方法では、適切な工学的合成生物学の抽象化と標準化の原則、BBa_K540000 Biobrick（ベスト新Biobrick機器、エンジニアリング、IGEM 2011）の結果を適用します。

最初のステップは、金属に反応して、したがって、野生型株の付着力を高めることにcurli過剰生産に専念して合成オペロンのデザインで構成されています。オリジナルcurliオペロン転写および翻訳シグナルを最適化し、curliの"自然な"規制を逃れるためにin silicoで変更されました。このアプローチでは、成功を収めてcurli生産の私達の現在の理解度をテストすることができました。 Moreoverは、単純な金属調節プロモーターに内因性の複雑なプロモーター（10以上の転写調節因子が同定される）スイッチングによりcurli規制を簡素化すると制御への付着が非常に容易になります。

第二段階は、単純なメソッドの実装によって付着力の定性的および定量的評価が含まれています。これらの方法にかかわらず、バイオフィルム形成に関与する生物学的構造の付着細菌の広い範囲に適用されます。 24ウェルポリスチレンプレートで付着試験は、クリスタルバイオレット染色後の細菌バイオフィルムの迅速な予備可視化を提供します。この定性検査は、アドヒアランスの割合の定量化によって先鋭化することができます。このような方法は非常にシンプルでありながら優れた再現性と再現性の両方で以前に^1に記載^のよう^に唯一のクリスタルバイオレット染色よりも正確です。蛍光またはレーザーのconfによりスライドガラス上のGFPタグ細菌の可視化OCAL顕微鏡は、現象を直接観察することにより、24ウェルプレート試験で得られた結果を強化することができます。

概要

非生物的サポートに細菌付着はバイオレメディエーション、生体触媒または微生物燃料電池に大きな役割を果たしている。バイオレメディエーションプロセスは、有機物を分解する微生物の能力を使用したり、金属分布（固定、揮発）、または分化を修正することができます。これらの有益な活動は、水生·陸生生態系ではなく、産業や家庭排水の汚染水を処理するために開発された人工システムで観察されています。微生物の活動の強度や品質はもちろんのこと、微生物のライフスタイル（フリーフローティングまたはバイオフィルム中に埋め込まれている）で、物理化学的要因に依存する。バイオフィルム形成は、多様なメカニズムによって殺生物剤に抵抗性を促進する代謝に関連付けられています。この現象は、したがって、ほとんどのバイオレメディエーションプロセスに奨励される。また、バイオフィルム形成を制御するためのエンジニアリング大腸菌細胞が正常に適用されているバイオチップ^2-3全細胞センサーを固定。

金属の高濃度の微生物の適応は、そのような細胞外マトリックス成分への吸着、細胞内に金属を集中することができる排出ポンプまたは特定のキャリアの活性化などの多様なメカニズムを介して行われます。ラグーらによって説明されているように遺伝子工学を介してこれらの細菌の活動を後押しすることは、特に弱い量で毒性の高い金属の場合には、実験室規模での金属汚染を効率的かつ安価な治療を可能にします2008年^4。細菌の修復は、このケースでは、イオン交換樹脂を用いた古典的な化学プロセスに比べて競争力のあるコスト削減方法を表しています。著者らは、Eを説明大腸菌シャーシは遺伝のマルチコピープラスミド許可過剰生産と排出ポンプをコードする遺伝子rcnAをノックアウトすることで、次に変換によってコバルト取り込みおよび保持第一のために設計コバルトの選択的取り込みとトランスポーターはこのような歪みは、放射性廃液を治療するために、イオン交換樹脂への効率的な代替として表示されますが、重要な未解決の問題は、プロセス⁴の終わりに汚染された菌の回復です。私たちの仕事の目的は、ガラスやプラスチックなどの非生物的支持に固執することができるカスタム設計された菌株を設計することであった。

アドヘシンおよびグラム細菌で同定付着線毛の全体のセットの中で、我々はcurli生産を可能にするシステムを設計することを選んだ。 Curliは大腸菌から突出薄い（2-5 nmの直径）と高凝集アミロイド繊維である非結晶性と不溶性マトリックス^5月7日として大腸菌やサルモネラ表面。 Curliも無生物表面とバイオフィルム⁸の開発の植民地化に関与している。 Curliは最近水銀イオン^9を結合することが示された。アミロイドは確かに高い有することが知られている例えば、Cu ^{2 +、Zn 2 +}及びFe ^{3 +の10}のような金属イオンに対する親和性。このプロパティには、さらに金属汚染排水の除染が向上する場合があります。 CSGクラスタはcurli繊維の製造を担当し、2発散転写オペロン（ 図1）で構成されている。 csgB、csgAとcsgC遺伝子は 2 curliサブユニット、CsgAとCsgBをコード化して、センスオペロンを構成している。 CsgCはcurli生合成システム内レドックス活性に関与しているように見えるとCsgG孔¹¹動作に影響^を与える。しかし、curli生産菌の大部分におけるcsgCの不在は、対応するタンパク質がcurli生合成を制御するための唯一のsecundaryレベルを提供することを示しています。システムを簡素化するために、私たちは、遺伝子の最小数で動作するように選択されています。

csgDEFGは規制と輸送に不可欠なタンパク質をoperonencodesCsgAとCsgBの細胞表面へ。 CsgDはcsgBACオペロンの転写活性化因子であるとcurli線毛、セルロース¹²など他のバイオ成分の産生を制御することによって阻害すると鞭毛生産¹³によるバイオフィルム形成の制御において重要な役割を果たしています。 CsgE、CsgFとCsgGは主要curliサブユニット蛋白質CsgAが可溶性タンパク質として分泌され、それを通して外膜におけるcurli固有分泌装置を構成する。 CsgAの重合が膜結合核タンパク質^CsgB（14件中）のin vivoで依存しています。いくつかの2成分系を含む複雑な調節経路がcurli遺伝子発現^{15から16を}制御することが示されている。これらの複雑な規制は、細菌が環境手がかりに応答curliの産生を介して厚いバイオフィルムを形成することができますが、産業用アプリケーション向けに、制御するのは困難です。 Metの回復を容易にするために工業プロセス中のアル·ぬいぐるみ細菌、固体支持体への細菌の固定は確かに明確に定義されたパラメータ（s）によって制御される必要がある。 curliの付着特性は、それらのアミロイド性質¹⁷にリンクされており、バイオレメディエーションプロセスを改善するために使用することができますが、単純かつ容易に制御されたデバイスを作成する必要があります。

これらの7つの遺伝子¹⁸の中でも、curli合成（csgBとcsgAは繊維モノマーをコードする）と輸出（csgE csgFとcsgG、curli分泌複合体をコードする）のための5絶対に必要な遺伝子のセットが合成オペロンを構築するために選択した。 curliの"自然な"規制を逃れるために、強力かつコバルトoverinducibleプロモーターの制御（ 図2）の下で、これらの5 CSG ​​遺伝子を含む合成オペロンを設計し、合成した。 curliコード領域のステップ·バイ·ステップの分析と機能合成するための設計手順断定的なオペロンが記載されている。ポリスチレンやガラスへの細菌付着を可視化し、定量化するための二つの方法が説明されています。

プロトコル

1。 CurliオペロンのBiobrickのデザインと合成

1. 遺伝子構成を決定し、curli遺伝子の内因性の転写および翻訳シグナルをローカライズします。これらの情報は、RegulonDB ^aまたは^bとEcoGene専門データベースに収集され、適切な出版物を注意深く読むことによって完了します。データ管理とインシリコ preanalysis ではクローンマネージャーソフトウェア^Cで行われた。
2. 適切なコーディング配列を選択します。 curli合成（csgBとcsgAエンコード繊維モノマー）とエクスポート（csgE csgFとcsgG、curlin分泌複合体をコードする）のための5つの絶対に必要な遺伝子のセットが合成オペロンを構築するために選択した。 FASTAフォーマットでデータ·ベースから選ばれた配列を抽出。
   csgGFEクラスタは、 大腸菌におけるアンチセンスであるとして大腸菌のゲノムは、その逆相補のcounterpにこのシーケンスを変換するクローンManagerツール操作を使用してアート>プロセスの分子>分子を反転します。関数"ライゲート"（クローン>結紮）を使用してcsgBA背後csgEFGシーケンスを貼り付けます。
3. 適当なプロモーターを追加します。プロモーターP RCN、curliの制御下にある5つの選択curli遺伝子を配置することにより、コバルトとニッケルの存在下で過剰生産されると予測されています。 RCN軌跡は、NiおよびCo解毒（rcnA）及びその同族メタロレギュレータ（rcnR）を担当する排出ポンプをコードしている。 RcnRは、NiおよびCo ¹⁹に対応してrcnA、独自の遺伝子の発現を制御します。 rcnR CDS を含むRCNシーケンスは 、全体RCN遺伝子間領域プラスrcnAの41第一ヌクレオチドはcsgBAEFGキメラシーケンスのplacedinフロント（ 図1、構造全体の配列は、補足データとして提供される）であった。
4. 転写を最適化信号。完璧なリボソーム結合部位（または完璧RBS = AAGGAGGTATATA）がcsgBA DNA配列の最初のATGの前に追加されました。第二完璧RBSはcsgEFG配列の前に追加されました。 csgBとcsgFとcsgG遺伝子に対する内因RBSは保存されていた。
5. IGEM基準に適合するように、デバイスを EcoRIの制限部位、PstIで （接頭辞） および Spe I および Xba I（接尾辞）を含む、標準BioBrick接頭辞と接尾辞により隣接されなければならない。装置^Dのそれぞれの端に対応する配列を貼り付けます。
6. 任意のEcoRI、PstIで、SPE Iおよびデバイス内のXBA I認識部位を排除する。さらに組立工程を容易にするために、BioBrickパーツ自体はこれらの制限部位のいずれかを含めることはできません。デバイスのin silico制限分析でcsgA配列において、1 PstIでサイト、rcnR配列において、1 PstI部位を明らかにしたcsgE遺伝子と1 EcoRI部位。これらのサイトは、それぞれの位置80（MUT1）、1340（Mut2）とデバイス·シーケンスの1830（Mut3）（補足データ）に置かれ、サイレント突然変異によって次のように変更されました。
   CGTCTGで変更CTGCAG MUT1 PstI部位
   CAGCAGで変更Mut2 PstI部位CTGCAG
   GAATTで変更Mut3 EcoRI部位のGAATTC
7. クローンManagerソフトウェア（動作>プロセスの分子>翻訳分子）を使用して翻訳シミュレーションを通して実行されます。野生型curliタンパク質や合成オペロンにコードされるタンパク質の間の完全な相同性を確認するために配列アラインメントプログラムBLASTを使用しています。
8. 合成オペロンを命ずることができる。商用遺伝子合成サービスは世界中で数多くのメーカーから提供されています、私たちのパートナーはGenecust（ルクセンブルク）であった。人工オペロン（3165 bp）の4μgの数週間後に受信したpUC57（pIG2）に挿入した。

2。ポリスチレンに付着細菌を可視化し、定量化

1. M63最少培地（グルコース0.2％）2mlを24ウェルポリスチレンプレートの各ウェルを記入し、一晩培養した培養液の106細胞を用いて各ウェルに接種。振とうせずに18から48時間30℃でバクテリアを育てています。各列（4ウェル）はモダリティを表す。必要なときに適切なコバルトの量（25〜100 mM）および抗生物質（アンピシリン^{100μg.L-1）を}追加^します 。 24ウェルプレートの3最初の行は3回の繰り返しを平均化することにより、付着細菌を定量化するために使用され、残された最後の行は、バイオフィルムを可視化するために使用されています。
2. 24ウェルプレートの3最初の行の場合 ：各ウェルについて、浮遊細胞を含む上清を回収する。
3. 慎重に1 M63 mlのプール2.2で得られた初期上清で1mlの洗浄）で各ウェルを洗浄してください。このプールは、水泳細胞（= S）と呼ばれています。
4. 1ミリリットルoのバイオフィルムを回復こすると上下にピペッティングによるF M63（A = B）。ボルテックス15秒。各モダリティに対応順守率を与えるために600nm以下（OD 600）での光学密度から表面接続およ​​び水泳の細菌の数を見積もります。
5. アドヒアランスの割合は、以下の式を用いて算出しています：BX100 /（3xS A + B）。
6. 唯一 、24ウェルプレートの最後の行の ：浮遊細胞を破棄します。
7. M63プレートの底に開発したバイオフィルムの1ミリリットルで洗浄すること。
8. 80℃で1時間のオープンプレートを乾燥℃に
9. よく表面付着細菌を可視化するために、水との広範な洗浄に続いて、それぞれの中で2分間20％クリスタルバイオレットの100μlを添加する。
   三つの独立したアッセイ（プレート）は、再現性を確保するために実行する必要があります。

3。顕微鏡によるガラス上の付着細菌を可視化

1. 蛍光シャーシを入手してください。 E. constitutivel 大腸菌 SCC1 ^電子株yは親株MG1655 ²⁰から観察可能な違いは、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するプラスミドベアリング合成curliオペロンに適したホストです。
2. S23の株を取得したプラスミドpIG2（=合成curliオペロンはプラスミドpUC57 の EcoRI / PST I部位に挿入）でSCC1を変換します。対照菌株のS24 ^21を取得するコントロールプラスミド（pUC18に）でSCC1を変換します。
3. S23のと制御の一晩前培養（S24）、30日時点での株°M63グルコースを添加した培地（0.2％）とアンピシリン^{（100μg.L-1）}のCを栽培しています。
4. 前培養液100μlを持つペトリ皿内の同じ培地15mlに植菌する。コバルト（ すなわち 25μM）の適切な濃度を追加し、コバルトなしのネガティブコントロールを忘れてはいけません。各ペトリ皿の3角型のガラスカバースリップをご紹介します。振盪せずに30℃で一晩インキュベートする。
5. あちこちにカバースリップを削除シャーレと慎重にドレインメートル。すべての細菌の残留物を拭き取ることにより70℃のエタノールを含浸させた小さな綿のもので、下面を丁寧に清掃してください。共焦点顕微鏡観察のために、カバースリップのさらなる定着を可能にするために数ミリ上で両方の上端部を清掃してください。
6. 付着細菌を蛍光顕微鏡下で直接可視化したが、すぐに、しかし慎重にサンプルの乾燥を避けることができます。
7. 共焦点顕微鏡観察のために、表向きに配置バイオフィルムで覆われて上面にスライドガラス上にカバースリップを預ける。バイオフィルムは、その後、ワニスをガラススライドに固定されている大規模なカバーガラスで覆われている。バイオフィルムは今下面にすることができるようになるという設定を反転します。
8. 共焦点レーザー顕微鏡下でセットアップを置きます。右Axioplan2 LSM510（Zeiss）を共焦点レーザー顕微鏡はPlatimプラットフォームf ^で使用されていました。
9. 設定。エキサイト488nmでGFPおよび範囲内細菌の蛍光を収集する500から600 nmの 。共焦点レーザー走査型モードで画像を取得するために40倍油浸対物レンズを使用しています。 1μm以下のステップを使用して、増殖培地で固体表面からインターフェイスにバイオフィルムの全体的な三次元構造をスキャンします。
10. IMARISソフトウェア（ビットプレン、チューリッヒ、スイス）と3次元投影を行う。統計的縦断面に沿って平均z値の分析によりバイオフィルムの厚さを決定します。別の場所で説明されているように²²バイオフィルムbiovolumesの定量化は、共焦点のzスタックから抽出することができる。

RegulonDBは、転写ユニット、プロモーターとそのシグマ型、遺伝子およびそれらのリボソーム結合部位、ターミネーター、特定の転写調節因子の結合部位、ならびに規制フレーズを自分たちの組織にオペロンの組織とその分解についてのメカニズムに関する情報を提供しています。ら= "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp

^B EcoGeneデータベースは、 大腸菌についての最新情報が含まれて大腸菌 K-12ゲノムおよび広範な遺伝子を含む書誌プロテオーム配列。主要EcoGeneフォーカスが翻訳開始部位の再評価されています。 http://ecogene.org/

^C http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm

^dの http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix

チュンチャウセー、ナンヤン工科大学、シンガポールの^{電子ギフト} 。

^F Platim顕微鏡プラットフォームUMS3444バイオサイエンスジェルラン-リヨンシュッ。

結果

EのシーケンスをCSG野生型の in silico In アノテーション転写および翻訳シグナルの最適化に関連する大腸菌 K12は、 図3（補足データでフルシーケンス）に示すように、単一の合成curliオペロンP RCN-CSGを設計することができました。プロトコル2とプロトコル3 curli生産に伴うアドヒアランスを可視化し、定量化するために使用された。各ウェル...

ディスカッション

重要なステップ

この合成生物学のアプローチの中で最も重要なステップは、遺伝子の設計です。合成遺伝子の設計は、効率的なシステムの生産を確保するために細心でなければならない。核廃液のバイオ除菌：その分泌系に関与するタンパク質をコードファイバモノマー及び3つの遺伝子をコードする2つの遺伝子は、新規アプリケーションのための新しい機能的なユニット?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
pIG2			合成P RCNを含む3165 bpのEcoRI / PstIフラグメントを持つpUC57（pMB1 ORI、2710 bp）の- csgBAEFGオペロン;アンプR
pUC18を			アンプR、（pMB1 ORI、2686 bp）を多コピープラスミド
S23			SSC1（= GFPタグMG1655は、CCセーの贈り物）/ pIG2
S24			SSC1/pUC18
のCoCl 2	シグマ		0,1 Mのストック溶液は、室温で維持
M63			29
24ウェルプレート	ヌンク	55429	ポリスチレン24ウェルプレート