Engineering adhärenten Bakterien durch Schaffung eines einheitlichen Synthetic Curli Operon

Zusammenfassung

Das Design eines synthetischen Operon kodiert sowohl den sekretorischen Apparat und den strukturellen Monomere Curli Fasern beschrieben. Überproduktion dieser Amyloide und Anhänger Polymere ermöglicht einen messbaren Gewinn der Einhaltung der E. coli Chassis ¹. Einfache Möglichkeiten zur Visualisierung und Quantifizierung Einhaltung erläutert.

Zusammenfassung

Die hier beschriebene Methode besteht in der Neugestaltung E. coli Hafteigenschaften durch Zusammensetzen der Mindestanzahl von Curli Gene unter der Kontrolle eines starken und Metall-overinducible Promotor und bei der Visualisierung und Quantifizierung der erhaltenen Verstärkung der bakteriellen Adhärenz. Diese Methode gilt entsprechende technische Prinzipien der Abstraktion und Standardisierung der synthetischen Biologie, und die Ergebnisse in der BBa_K540000 BioBrick (Best neuen BioBrick Gerät entwickelt, iGEM 2011).

Der erste Schritt besteht in der Konstruktion des synthetischen Operon gewidmeten Curli Überproduktion in Reaktion auf Metall, und daher bei der Erhöhung der Adhärenz Fähigkeiten des Wildtypstamms. Die ursprüngliche curli Operon wurde in silico modifiziert, um Transkription und Translation-Signale zu optimieren und die Flucht der "natürliche" Regulierung der curli. Dieser Ansatz erlaubt es, mit Erfolg testen unser gegenwärtiges Verständnis von curli Produktion. Moreover, Vereinfachung des Curli Regulierung durch Schalten des endogenen Komplexes Promotor (mehr als 10 transkriptionellen Regulatoren identifiziert) zu einem einfachen Metall-regulierten Promotor macht Adhärenz viel einfacher zu steuern.

Der zweite Schritt beinhaltet qualitative und quantitative Bewertung der Einhaltung Fähigkeiten durch Umsetzung von einfachen Methoden. Diese Verfahren sind für eine große Palette von anhaftenden Bakterien unabhängig von biologischen Strukturen im Biofilm-Bildung beteiligt. Adherence Test im 24-well Polystyrol-Platten bietet eine schnelle vorläufige Visualisierung des bakteriellen Biofilms nach Kristallviolettfärbung. Dieser qualitative Test kann durch die Quantifizierung der Prozentsatz der Einhaltung geschärft werden. Ein solches Verfahren ist sehr einfach, aber genauer als nur Kristallviolettfärbung wie vorher ¹ mit sowohl einer guten Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit beschrieben. Visualisierung von GFP-markierten Bakterien auf Glasträger durch Fluoreszenz-oder Laser-confocal Mikroskopie ermöglicht, um die Ergebnisse mit dem 24-Well-Platte-Test durch direkte Beobachtung des Phänomens erhalten stärken.

Einleitung

Bakterielle Adhärenz gegenüber abiotischen Unterstützung spielt eine wichtige Rolle in Bioremediation, Biokatalyse oder mikrobielle Brennstoffzellen. Bioremediation Prozesse verwenden, die Kapazitäten von Mikroorganismen an organischen Substanzen zersetzen, oder um die Metallverteilung (Immobilisierung, Verflüchtigung) oder Speziation ändern. Diese positiven Aktivitäten sind in aquatischen und terrestrischen Ökosysteme beobachtet, sondern auch in den künstlichen Systeme entwickelt, um verschmutztes Wasser von Industrie-und Hausmüll zu behandeln. Die Intensität und die Qualität der mikrobiellen Aktivität auf die physikalisch-chemische Faktoren abhängen, sondern auch von der Lebensweise der Mikroorganismen (frei schwebenden oder eingebettet in Biofilm). Die Biofilmbildung ist mit einem Stoffwechsel fördern Resistenz gegen Biozide durch diverse Mechanismen verbunden. Dieses Phänomen wird daher in den meisten Prozessen Bioremediation gefördert werden. Außerdem hat Engineering Escherichia coli-Zellen, um die Biofilmbildung steuern erfolgreich angewendetimmobilisieren whole-cell-Sensoren auf Biochips ^2-3.

Adaption von Mikroorganismen zu hohe Konzentration an Metallen erfolgt über verschiedene Mechanismen, wie Adsorption an Komponenten der extrazellulären Matrix, die Aktivierung von Effluxpumpe oder spezifische Träger, die das Metall in die Zelle zu konzentrieren. Die Förderung dieser bakteriellen Aktivitäten über Gentechnik ermöglicht eine effiziente und billige Behandlung von Metall-Verschmutzung im Labormaßstab, insbesondere im Falle hoch giftiger Metalle in schwachen Menge von Raghu et al. 2008 ^4. Bakterielle Sanierung stellt in diesem Fall eine wettbewerbsfähige und kostensparende Methode im Vergleich zu den klassischen chemischen Prozessen unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen. Die Autoren beschreiben eine E. coli genetisch Chassis für Kobalt Aufnahme und Retention zuerst durch Ausschlagen der Effluxpumpe kodierenden Gen RCNA und dann durch Transformation mit einem Plasmid mit mehreren Kopien ermöglicht eine Überproduktion von entworfenTransporter mit bevorzugte Aufnahme für Cobalt. solcher Stamm erscheint als Alternative zu Ionenaustauscherharzen zu behandeln radioaktives Abwasser, sondern ein Schlüssel ungelöstes Problem ist die Rückgewinnung von kontaminierten Bakterien am Ende des Prozesses ^4. Das Ziel unserer Arbeit war es daher, Ingenieur eine speziell angefertigte Belastung in der Lage, gegenüber abiotischen Trägern wie Glas oder Kunststoff haften.

Unter der Gesamtheit der Adhäsine und Anhänger Fimbrien in Gram-Bakterien identifiziert, entschieden wir uns für ein System, curli Produktion zu entwerfen. Curli sind dünn (2-5 nm Durchmesser) und hoch aggregativen Amyloidfasern, die ragen aus dem E. coli und Salmonella Oberfläche als eine nicht-kristalline als auch unlösliche Matrix ^5-7. Curli sind auch in der Besiedlung des abiotischen Oberflächen und die Entwicklung von Biofilmen ⁸ beteiligt. Curli wurden kürzlich gezeigt, binden Quecksilber-Ionen ^9. Amyloide sind in der Tat bekannt, besitzen eine hoheAffinität für Metallionen wie Cu ^{2 +,} Zn ^{2 +} und Fe ^{3 + 10.} Diese Eigenschaft könnte die weitere Verbesserung der Dekontamination von Metall verunreinigte Abwässer. Die CSG-Cluster ist verantwortlich für die Produktion von curli Fasern und besteht aus zwei divergent transkribierte Operons (Abbildung 1), gebildet. Die CSGB, CsgA und CSGC Gene bilden die Sinne Operon codiert die beiden curli Untereinheiten, CsgA und CSGB. CSGC scheint zu sein, beteiligt Redox-Aktivität innerhalb der curli Biogenese und zu beeinflussen CsgG Poren Verhalten ^11. Allerdings zeigt die Abwesenheit von CSGC in der Mehrzahl der Curli produzierenden Bakterien, dass das entsprechende Protein nur einen sekundären Maß an Kontrolle über die Curli Biogenese bereitstellt. Um das System zu vereinfachen, haben wir ausgewählt, um mit einer minimalen Anzahl von Genen zu arbeiten.

Die csgDEFG operonencodes Proteine ​​essentiell bei der Regulierung und Transportvon CsgA und CSGB zur Zelloberfläche. CsgD ist ein Transkriptionsaktivator der csgBAC Operon und spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Biofilmbildung durch Steuern der Erzeugung von Fimbrien Curli und andere Komponenten, wie Biofilm Cellulose ¹² und durch die Hemmung der Produktion Flagellum ^13. CsgE, CSGF und CsgG darstellen Curli-spezifischer sekretorischer Vorrichtung in der äußeren Membran, durch die der großen Untereinheit-Protein Curli CsgA als lösliches Protein sezerniert wird. Die Polymerisation von CsgA hängt in vivo an der membrangebundenen Proteins CSGB Nukleator (besprochen in ^14). Komplexen Regulationsmechanismen, die mehrere Zweikomponentensysteme erwiesen sich Curli Genexpression ^15-16 steuern. Diese komplexen Vorschriften erlauben Bakterien dicke Biofilme über die curli Produktion als Reaktion auf Umweltreize zu bilden, sind aber schwer zu für industrielle Anwendungen zu steuern. Um die Erholung der met erleichternal-gestopft Bakterien während eines industriellen Prozesses, bakterielle Fixierung auf einem festen Träger in der Tat muss von gut definierten Parameter (n) gesteuert werden. Die adhärenten Eigenschaften Curli sind, ihre Natur Amyloid ¹⁷ verbunden und könnten zur Bioremediation Prozesse zu verbessern, sondern ein einfacher und leicht zu kontrollierenden Gerät geschaffen werden.

Von diesen 7 Gene ^18, einen Satz von 5 absolut Gene für Curli Synthese (CSGB und CsgA Codierung Faser Monomere) und Ausfuhr (csgE CSGF und csgG, Codieren des Curli Sekretion Komplex) benötigt wurden ausgewählt, um die synthetischen Operon konstruieren. Um das "natürliche" Regulierung der curli, ein synthetisches Operon aus diesen 5 csg Gene unter der Kontrolle eines starken und Kobalt-overinducible Promotor (Abbildung 2) wurde entworfen und synthetisiert entkommen. Der Schritt-für-Schritt-Analyse des Curli kodierende Region und die Konstruktionsverfahren für eine funktionelle synthetische Operons beschrieben. Zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung bakterielle Adhärenz an Polystyrol und Glas werden erläutert.

Protokoll

Ein. BioBrick Design und Synthese des Curli Operon

1. Bestimmung der genetischen Organisation und lokalisieren die endogenen transkriptionale und translationale Signale der Curli Gene. Diese Informationen werden in spezialisierten Datenbanken wie RegulonDB ^a oder ^b EcoGene gesammelt und ergänzt durch eine sorgfältige Lektüre einschlägiger Publikationen. Datenmanagement und in silico Voranalyse wurden mit Clone Manager-Software ^c durchgeführt.
2. Wählen Sie die relevanten kodierenden Sequenzen. Ein Satz von fünf Genen für zwingend erforderlich Curli Synthese (CSGB und CsgA Codierung Faser Monomere) und Ausfuhr (csgE CSGF und csgG, Codieren des Curlin Sekretion Komplex) wurden ausgewählt, um die synthetischen Operon konstruieren. Entpacken Sie die ausgewählten Sequenzen aus der Datenbank in FASTA-Format.
   Da der Cluster ist csgGFE Antisense in E. coli-Genom, wandeln diese Sequenz in ihrer reversen Komplement counterpart mit den Clone Manager-Tools Operations> Prozess-Molekül> Invert Molekül. Fügen Sie den csgEFG Reihenfolge hinter csgBA über die Funktion "Ligieren" (Clone> Ligieren).
3. Fügen Sie den entsprechenden Promotor. Durch Platzieren der fünf ausgewählten Curli Gene unter Kontrolle des Promotors P rcn werden Curli vorhergesagt in Gegenwart von Kobalt und Nickel über-hergestellt werden. Der RCN-Locus kodiert für ein Effluxpumpe für Ni und Co Entgiftung (RCNA) und seinen zugehörigen Metallo-Regler (RCNR). RCNR steuert die Expression RCNA und eigener Gens als Reaktion auf Ni und Co ^19. Der RCN-Sequenz, umfassend RCNR CDS, war die ganze rcn Zwischengenregion plus die 41 ersten Nukleotiden RCNA placedin vor dem csgBAEFG chimärische Sequenz (Abbildung 1, die Sequenz des gesamten Konstrukts als ergänzende Daten zur Verfügung gestellt).
4. Optimieren Sie die transkriptionelleSignale. Eine perfekte Ribosomenbindungsstelle (RBS = oder perfekte AAGGAGGTATATA) wurde vor der ersten ATG des csgBA DNA-Sequenz hinzugefügt. Eine zweite perfekte RBS wurde vor dem csgEFG Sequenz hinzugefügt. Endogene RBS für die CSGB und CSGF und csgG Gene wurden konserviert.
5. Um iGEM Standards passen, muss das Gerät mit einem Standard BioBrick Präfix und Suffix flankiert werden, die Restriktionsschnittstellen für EcoRI, Pst I (Präfix) und Spe I und Xba I (Suffix). Einfügen der entsprechenden Sequenzen an jedem Ende der Vorrichtung ^d.
6. Eliminieren jedes EcoRI, PstI, SpeI und XbaI-Erkennungsstelle in dem Gerät. Zur weiteren Montage zu erleichtern, kann der BioBrick Teil selbst enthalten keine dieser Restriktionsstellen. In silico Restriktionsanalyse des Gerätes ergab ein Pst I-Stelle in der CsgA Sequenz, ein Pst I-Stelle in der RCNR Folgeund eine Eco RI-Stelle in der csgE Gens. Diese Seiten sind jeweils in Position 80 (Mut1), 1340 (MUT2) und 1830 (MUT3) der Vorrichtung Sequenz (Ergänzungsdaten) befindet und wurden wie folgt durch stille Mutationen verändert.
   Mut1 Pst I-Stelle CTGCAG in CGTCTG verändert
   MUT2 Pst I-Stelle CTGCAG in CAGCAG verändert
   MUT3 Eco RI Website GAATTC in GAATT verändert
7. Run durch die Übersetzung Simulation mit dem Clone-Manager-Software (Operation> Process Moleküle> Translate Moleküle). Verwenden der Sequenz-Alignment-Programm BLAST, um die perfekte Homologie zwischen dem Wildtyp Curli Protein und den Proteinen, die von dem synthetischen Operon kodiert verifizieren.
8. Bestellen Sie die synthetischen Operon. Kommerzielle Gensynthese Dienstleistungen sind von zahlreichen Unternehmen weltweit zur Verfügung, war unsere Partner GeneCust (Luxemburg). 4 ug des künstlichen Operons (3165 bp) wurden einige Wochen später und erhielt eingefügt in pUC57 (pig2).

2. Visualisieren und quantifizieren adhärenten Bakterien auf Polystyrol

1. Füllen Sie jede Vertiefung einer 24-well Polystyrol Platte mit 2 ml M63 Minimalmedium (Glucose 0,2%) und impfen jede Vertiefung mit 106 Zellen einer Übernachtkultur. Bakterien wachsen bei 30 ° C für 18 bis 48 Stunden ohne Schütteln. Jede Säule (4 Wells) eine Modalität. Hinzufügen die richtige Menge an Cobalt (25 bis 100 mM) und Antibiotikum (Ampicillin 100 μg.L ^-1), wenn nötig. Die drei ersten Zeilen der 24-Well-Platte verwendet werden, um die adhärenten Bakterien durch Mittelung der 3 Wiederholungen zu quantifizieren, wird die letzte Reihe links verwendet werden, um den Biofilm zu visualisieren.
2. Für die ersten 3 Zeilen der 24-Well-Platte: für jeden gut erholen Der Überstand mit den planktonischen Zellen.
3. Spülen Sie jede Vertiefung mit 1 ml der M63 und Pool die 1 ml Waschpuffer mit dem ersten Überstand in 2,2) erhalten. Dieser Pool wird als Schwimmen Zellen (= S) bezeichnet.
4. Recover den Biofilm in 1 ml of M63 durch Schaben und Auf-und Abpipettieren (= B). Vortex 15 sec. Schätzung der Anzahl der oberflächengebundenen und Schwimmen Bakterien aus der optischen Dichte bei 600 nm (OD600), um die Haftung Prozentsatz entsprechend jeder Modalität zu ergeben.
5. Der Prozentsatz der Adhärenz wird unter Verwendung der Formel berechnet wird: BX100 / (3xS + B).
6. Nur für die letzte Zeile der 24-Well-Platte: verwerfen planktonischen Zellen.
7. Spülen mit 1 ml M63 der Biofilm, der auf der Unterseite der Platte entwickelt hatte.
8. Trocknen des offenen Platte für 1 h bei 80 ° C.
9. Je 100 ul 20% Kristallviolett für 2 min in jeder Vertiefung durch extensive Waschungen mit Wasser, um die oberflächengebundenen Bakterien visualisieren.
   Drei unabhängige Assays (Platten) müssen durchgeführt werden, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

3. Visualisieren adhärenten Bakterien auf Glas durch Mikroskopie

1. Holen Sie sich einen fluoreszierenden Chassis. Die E. coli-Stamm, der SCC1 ^e constitutively drückt grün fluoreszierendes Protein (GFP) mit keiner beobachtbaren Unterschied gegenüber der Elternstammes MG1655 ²⁰ ist ein geeigneter Wirt für das Plasmid tragenden das synthetische Curli Operons.
2. Transformieren SCC1 mit dem pig2 Plasmid (= synthetischer Curli Operon am EcoRI / Pst I-Stelle des pUC57-Plasmid eingefügt), um die Dehnung S23 erhalten. Transformieren SCC1 mit einer Steuerung Plasmid (pUC18) zum Erhalt der Kontrolle Stamm S24 ^21.
3. Über Nacht wachsen Vorkulturen des S23 und der Kontrolle (S24) Stämme bei 30 ° C in M63-Medium mit Glucose (0,2%) und Ampicillin (100 μg.L ^-1).
4. Beimpft 15 ml des gleichen Mediums in Petrischalen mit 100 ul der Vorkulturen. Fügen Sie den entsprechenden Konzentration von Kobalt (dh 25 uM) und vergessen Sie nicht die negative Kontrolle ohne Kobalt. Führen Sie 3 rechteckige Deckglas in jeder Petrischale. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C ohne Schütteln.
5. Entfernen Sie das Deckglas from die Petrischale und sorgfältig abtropfen lassen. Säubern Sie die untere Fläche mit einem kleinen Baumwoll Zeug mit 70 ° Ethanol durch Abwischen jede bakterielle Rückstände imprägniert. Für konfokale Beobachtung, reinigen beide oberen Enden von einigen wenigen Millimetern bis weitere Fixierung des Deckplättchens ermöglichen.
6. Adhärenten Bakterien können direkt visualisiert werden aber schnell unter dem Fluoreszenzmikroskop, aber sorgfältig vermieden Trocknen der Probe.
7. Für die konfokale Beobachtung, hinterlegen das Deckglas auf einem Objektträger aus Glas mit der Oberseite durch den Biofilm platziert Gesicht bedeckt. Der Biofilm wird dann mit einer größeren Deckglas, das auf dem Glasobjektträger fixiert mit Lack bedeckt ist. Kehren Sie die Setup, so dass der Biofilm wird nun auf der unteren Fläche sein.
8. Legen Sie die Setup unter dem konfokalen Laser-Mikroskop. Ein Recht Axioplan2 LSM510 (Zeiss) konfokalen Laser-Mikroskop wurde am Platim Plattform ^f verwendet.
9. Einstellung. Excite GFP bei 488 nm, und sammelt das bakterielle Fluoreszenz im Bereich von 500 bis 600 nm . Verwenden 40x Ölimmersionsobjektiv zum Importieren von Bildern in der Laser Scanning konfokalen Modus. Tasten die gesamte dreidimensionale Strukturen der Biofilme von der festen Oberfläche zu der Grenzfläche mit dem Wachstumsmedium, wobei ein Schritt von 1 um.
10. Führen dreidimensionale Projektionen mit Imaris Software (Bitplane, Zürich, Schweiz). Bestimmen Biofilmdicke durch die Analyse der durchschnittlichen statistischen Wert entlang z Längsabschnitte. Quantifizierung von Biofilm Biovolumina aus konfokalen z-Stapel entnommen werden, wie an anderer Stelle beschrieben ^22.

^ein RegulonDB liefert mechanistische Informationen über Operon Organisation und ihre Zerlegung in Transkriptionseinheiten, Promotoren und deren Sigma-Typs, Gene und ihre Ribosomenbindungsstellen, Terminatoren, spezifische Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren, sowie ihre Organisation in regulatorischen Phrasen.et = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp

^b Die EcoGene Datenbank enthält aktuelle Informationen über die E. coli K-12 Genom-und Proteom-Sequenzen, einschließlich der umfangreichen Gen-Bibliographien. Ein wesentlicher EcoGene Fokus war die Neubewertung der Translationsstart Seiten. http://ecogene.org/

^c http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm

^d http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix

^e Gift of Chun Chau Sze, Nan Yang Technischen Universität Singapur.

^f Platim mikroskopische Plattform UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

Ergebnisse

In silico Annotation des Wildtyp csg Sequenz von E. coli K12 mit der Optimierung der Transkription und Translation Signale zugeordnet erlaubt hat zu entwerfen das einzige synthetische curli Operon P rcn-csg in Abbildung 3 (ganze Folge in ergänzende Daten) angezeigt. Protokoll 2 und Protokoll 3 wurden verwendet, um visualisieren und quantifizieren Haftung mit curli Produktion verbunden. Mit Kristallviolettfärbung auf 24-Well Polystyrol-Platten (protocole 2) Biofilmbi...

Diskussion

Kritische Schritte

Der wichtigste Schritt in diese synthetischen Biologie Ansatz ist das Gen-Design. Synthetisches Gen-Design hat akribisch zu sein, um ein effizientes System Produktion zu gewährleisten. Die Biodekontamination kerntechnischer Abstrom: zwei Gene, die die Faser und drei Monomeren Proteine ​​kodierenden Genen in ihrer Sekretionssystem beteiligt waren mit einem starken und Metall-induzierbaren Promotor, eine neue Funktionseinheit für eine neuartige Anwendung erstellen zusamme...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
pig2			pUC57 (pMB1 ori, 2710 bp) mit einem 3165 bp EcoRI / PstI-Fragment, welches die synthetische P rcn - csgBAEFG Operon; Amp r
pUC18			Multicopy Plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Amp r
S23			SSC1 (= GFP-markierten MG1655, ein Geschenk von CC Sze) / pig2
S24			SSC1/pUC18
CoCl 2	Sigma		0,1 M Stammlösung bei Raumtemperatur gehalten
M63			29
24-Well-Platte	Nunc	55429	Polystyrol 24-Well-Platten