Инженерные Приверженец бактерии путем создания единого синтетического Curli Operon

Резюме

Дизайн синтетических кодирования оперона как секреторный аппарат и структурные мономеры curli волокон описаны. Перепроизводство этих амилоиды и приверженцем полимеров позволяет измеримые усиления приверженности E. палочки Шасси ¹. Легкий путь, чтобы визуализировать и количественно соблюдение объясняется.

Аннотация

Метод, описанный здесь состоит в реорганизации E. палочки соблюдение свойств сборки минимальное число генов curli под контролем сильных и металлом overinducible промоутер, и в визуализации и количественной оценки результате усиления бактериальной адгезии. Этот метод применяется соответствующих инженерных принципов абстракции и стандартизации синтетической биологии, и в результате BBa_K540000 Biobrick (Best новое устройство Biobrick, инженерии, ИГЕМ 2011).

Первый шаг состоит в разработке синтетических оперона посвящена перепроизводства curli в ответ на металл, и, следовательно, в повышении приверженности способности штамма дикого типа. Оригинальный curli оперона была изменена в кремнии с целью оптимизации транскрипции и трансляции сигналов и избежать "естественный" регулирование curli. Такой подход позволил проверить с успехом наших сегодняшних представлений о производстве curli. Moreoveг, упрощение регулирования curli путем переключения эндогенный промотор комплекса (более 10 транскрипционных регуляторов определены) к простой металл-регулируемого промотора делает соблюдение гораздо легче контролировать.

Второй этап включает в себя качественную и количественную оценку соблюдения способностей путем внедрения простых методов. Эти методы применимы для широкого спектра приверженцем бактерий независимо от биологических структур, вовлеченных в формирование биопленок. Соблюдение испытания в 24-луночные планшеты из полистирола обеспечивает быструю предварительную визуализацию бактериальной биопленки после окрашивания кристаллическим фиолетовым. Этот качественный тест может быть заточена под количественная доля приверженности. Такой метод очень прост, но более точный, чем только кристалл фиолетового окрашивания, как описано ранее ¹ с обеих хорошую повторяемость и воспроизводимость. Визуализация GFP с метками бактерии на предметных стеклах с помощью флуоресцентной или лазерного конфOCAL микроскопия позволяет усилить результаты, полученные с 24-луночный планшет теста путем непосредственного наблюдения этого явления.

Введение

Бактериальные присоединение к абиотическим поддержка играет важную роль в клетках биоремедиации, биокатализа или микробных топлива. Биологическая очистка процессы используют потенциал микроорганизмов разрушать органические вещества, или изменить распределение металла (иммобилизация, испарение) или видообразования. Эти полезной деятельности наблюдается в водных и наземных экосистем, но и в искусственных системах, разработанных для лечения загрязненных вод промышленных и бытовых отходов. Интенсивность и качество микробную активность зависит от физико-химических факторов, но и от образа жизни микроорганизмов (свободно плавающий или встроенный в биопленку). Образование биопленки связано с метаболизмом содействие устойчивости к биоцидов разнообразными механизмами. Это явление, следовательно, необходимо поощрять в большинстве процессов биоремедиации. Кроме того, инженерные клетки кишечной палочки контролировать образование биопленки была успешно применена дляиммобилизации целых клеток датчиков на биочипов ^2-3.

Адаптация микроорганизмов к высокой концентрации металлов происходит посредством различных механизмов, таких как адсорбция компонентов внеклеточного матрикса, активация оттока насоса или конкретных носителей в состоянии сконцентрироваться металла в клетке. Повышение этих бактериальных деятельности путем генной инженерии позволяет эффективно и дешево обработки металла загрязнения в лабораторном масштабе, особенно в случае высоко токсичных металлов в слабом количестве, как описано Raghu и соавт. 2008 ^4. Бактериальное восстановление в данном случае представляет конкурентоспособной и экономия метода по сравнению с классическими химическими процессами использованием ионообменных смол. Авторы описали E. палочки шасси генной инженерии для кобальта поглощения и удержания сначала выбив истечения насоса гена, кодирующего RCNA, а затем путем преобразования с несколькими копии плазмиды позволяет перепроизводстватранспортер с льготным поглощение кобальта. Такая деформация выступает в качестве эффективной альтернативы ионообменных смол для лечения радиоактивных стоков, но ключевым нерешенным вопросом является восстановление загрязненных бактериями в конце процесса ^4. Целью нашей работы было, следовательно, инженер специально разработанных деформации в состоянии придерживаться абиотических опор, таких как стекло или пластик.

Среди всего множества адгезины и приверженцем фимбрий, определенных в Грам-бактерии, мы решили разработать систему, позволяющую curli производства. Curli тонкие (2-5 нм в диаметре) и очень агрегатного амилоидные волокна, которые выступают из E. палочка и сальмонелла поверхности, как некристаллических и нерастворимых матрицы ^5-7. Curli также принимают участие в колонизации абиотических поверхностях и развития биопленок ^8. Curli было недавно показано связывать ионы ртути ^9. Амилоиды действительно как известно, обладают высокойсродство ионов металлов, таких как Cu ^{2 +,} Zn ^{2 +} и Fe ^{3 + 10.} Это свойство может дальнейшему совершенствованию дезактивации металла загрязненных сточных вод. РГС кластер отвечает за производство волокон curli и составили из двух разных направлениях транскрипции оперона (рис. 1). CsgB, csgA и csgC гены составляют смысл оперона, кодирующего двух curli подразделений, CsgA и CsgB. CsgC, кажется, участвует в окислительно-восстановительной деятельности в рамках системы биогенеза curli и повлиять на CsgG пор поведение ^11. Тем не менее, отсутствие csgC в большинстве curli бактерий, продуцирующих указывает, что соответствующий белок обеспечивает только вторичное уровень контроля над биогенеза curli. Для упрощения системы, мы были выбраны, чтобы работать с минимальным количеством генов.

CsgDEFG operonencodes белков, необходимых в регулировании и транспортировкииз CsgA и CsgB к поверхности клетки. CsgD является транскрипционный активатор csgBAC оперона и играет ключевую роль в управлении образования биопленки, контролируя производство curli фимбрий и другие компоненты биопленки, такие как целлюлоза ¹² и путем ингибирования жгутик производства ^13. CsgE, CsgF и CsgG представляют собой curli конкретных секреторный аппарат в наружной мембраны, через которую основных субъединицы белка curli CsgA выделяется в виде растворимого белка. Полимеризации CsgA зависит в естественных условиях на мембраносвязанных белков зародышей CsgB (обзор в ^14). Комплекс регуляторных путей с участием нескольких двухкомпонентных систем было показано, что контроль curli экспрессии гена ^15-16. Эти сложные правила позволяют бактерии образуют биопленки толстой через производство curli в ответ на экологические реплики, но трудно контролировать для промышленного применения. Для облегчения восстановления встретилисьаль-фаршированные бактерий во время производственного процесса, бактериальной фиксации на твердом носителе действительно должна находиться под контролем и определен параметр (ы). Приверженцем свойства curli связаны с их ¹⁷ природы амилоида и могут быть использованы для улучшения процессов биоремедиации, но более простой и легко управляемое устройство должно быть создано.

Среди них 7 генов ^18, набор из 5 абсолютно необходимы гены curli синтеза (csgB и csgA мономеров кодирования волокна) и экспорта (csgE csgF и csgG, кодирующий комплекс curli секреции) были выбраны для построения синтетического оперона. Чтобы спастись от "естественных" регулирование curli, синтетический оперона, содержащие эти 5 генов РГС под контролем сильных и кобальт-overinducible промотора (рис. 2) был разработан и синтезирован. Шаг за шагом анализа curli кодирования региона и методика расчета для функционального синсинтетических оперона описаны. Два метода для визуализации и количественной оценки бактериальной адгезии к полистирола и стекла объяснил.

протокол

1. Biobrick дизайн и синтез Curli Operon

1. Определение генетической организации и локализации эндогенных транскрипции и трансляции сигналов генов curli. Эти информации собрались в специализированных базах данных, таких как RegulonDB или EcoGene ^б и завершена внимательного прочтения соответствующих публикаций. Управление данными и в preanalysis кремний проводились с Клон менеджер программного обеспечения ^с.
2. Выберите соответствующие кодирующие последовательности. Набор из пяти абсолютно необходимы гены curli синтеза (csgB и csgA мономеров кодирования волокна) и экспорта (csgE csgF и csgG, кодирующий комплекс Керлин секреции) были выбраны для построения синтетического оперона. Извлечение выбранных последовательностей из базы данных в формате FASTA.
   Как кластера csgGFE является антисмысловой в E. генома палочки, преобразовать эту последовательность в своем обратном counterp дополненияискусство с помощью клонов средства диспетчера операций> Процесс молекулу> Invert молекулы. Вставить csgEFG последовательности за csgBA с помощью функции "перевязывать" (Clone> перевязывать).
3. Добавить соответствующим промотором. При размещении пяти выбранных генов curli под контролем промотора P RCN, curli, по прогнозам, будет более-производятся в присутствии кобальта и никеля. RCN локус кодирует истечения насосов ответственность за Ni и Co детоксикации (RCNA) и его родственные металло-регулятора (rcnR). RcnR контролирует экспрессию RCNA и собственных генов в ответ на Ni и Co ^19. RCN последовательности, содержащей rcnR CDS, весь RCN межгенные региона, а также 41 первых нуклеотидов RCNA был placedin перед csgBAEFG химерических последовательности (рис. 1, последовательность вся конструкция предоставляется как дополнительная данных).
4. Оптимизация транскрипционнойсигналы. Идеальный сайт связывания рибосомы (или совершенное RBS = AAGGAGGTATATA) был добавлен в передней части первого ATG последовательности ДНК csgBA. Второй совершенной RBS был добавлен в передней части csgEFG последовательности. Эндогенные RBS за csgB и csgF и csgG гены сохраняются.
5. Для установки ИГЕМ стандартов, устройство должно быть в окружении стандартного префикса и суффикса BioBrick, содержащие сайты рестрикции для Eco RI, Pst I (префикс) и Spe I и Xba I (суффикс). Вставьте соответствующие последовательности на каждом конце устройства ^D.
6. Ликвидация любых Eco RI, Pst I, Spe I и Xba я признании сайт в устройстве. Для облегчения дальнейшего процесса сборки, часть BioBrick само по себе не может содержать любое из этих сайтов рестрикции. В кремнии ограничение анализ выявил одну устройства Pst I место в последовательности csgA, один Pst I место в последовательности rcnRи один Eco RI сайт в csgE ген. Эти участки расположены соответственно в позиции 80 (Mut1), 1340 (Mut2) и 1830 (Mut3) устройства последовательность (дополнительные данные), а также были изменены следующим по молчащие мутации.
   Mut1 Pst я сайте CTGCAG изменилось в CGTCTG
   Mut2 Pst я сайте CTGCAG изменилось в CAGCAG
   Mut3 Eco GAATTC сайте RI изменилось в GAATT
7. Запуск через перевод моделирования с использованием программного обеспечения клонов Manager (Operation> Процесс молекул> Перевести молекул). Используйте программу выравнивания последовательности взрыв, чтобы проверить, идеально гомологии между дикого типа curli белки и белки, кодируемые синтетических оперона.
8. Закажите синтетических оперона. Коммерческие услуги синтез генов, имеются многочисленные компании по всему миру, наш партнер был Genecust (Люксембург). 4 мкг искусственного оперона (3165 б.п.) были получены несколько недель спустя и вставляют в pUC57 (pIG2).

2. Визуализация и количественно Приверженец бактерий на полистирол

1. Заполните каждую лунку 24-луночных полистирола пластины с 2 мл M63 минимальной среды (глюкоза 0,2%) и прививать каждую лунку с 106 клетками ночной культуры. Рост бактерий при 30 ° С в течение 18 до 48 часов без встряхивания. Каждый столбец (4 скважины) представляет собой модальности. Добавить необходимое количество кобальта (25 до 100 мм) и антибиотики (ампициллин 100 мкг ^-1) при необходимости. 3 первых рядах 24-луночный планшет используется для количественной оценки приверженцем бактерий путем усреднения 3 повторений, последний левый ряд используется для визуализации биопленки.
2. За 3 первых рядах 24-луночный планшет: для каждой скважины, восстановление супернатант, содержащий планктонных клеток.
3. Тщательно промыть каждую лунку по 1 мл M63 и бассейн 1 мл мыть с начальной супернатанта, полученного в 2,2). Этот бассейн называется бассейном клеток (= S).
4. Восстановление биопленки в 1 мл ОF M63, очищая и пипетки вверх и вниз (= B). Vortex 15 сек. Оценить количество поверхностно-прилагается и плавание бактерий из оптической плотности при 600 нм (OD 600), чтобы дать соблюдения процентах, соответствующие каждой модальности.
5. Процент соблюдения рассчитывается по формуле: BX100 / (3xs + B).
6. Только за последнюю строку в 24-луночный планшет: отказаться от планктонных клеток.
7. Промыть 1 мл M63 биопленки, которая сложилась на дне тарелки.
8. Сухие пластины открыты в течение 1 часа при 80 ° C.
9. Добавить 100 мкл 20% кристаллического фиолетового в течение 2 мин в каждую лунку следуют обширные промывки водой для визуализации поверхности подключенных бактерий.
   Три независимые анализы (пластины) должны быть выполнены, чтобы обеспечить воспроизводимость.

3. Визуализируйте Приверженец бактерий на стекле с помощью микроскопа

1. Получить флуоресцентные шасси. E. палочки SCC1 ^{электронной} штамм, который constitutivelУ выражает зеленого флуоресцентного белка (GFP) без заметных отличия от родительского штамма MG1655 ²⁰ является подходящим хозяином для плазмиды подшипник синтетических curli оперона.
2. Преобразование SCC1 с pIG2 плазмиды (= синтетических curli оперона вставляется в Eco RI / Pst я сайте pUC57 плазмиды), чтобы получить S23 напряжения. Преобразование SCC1 с контрольной плазмиды (pUC18) для получения контрольного штамма S24 ^21.
3. Расти ночь precultures из S23 и управления (S24) штаммов при 30 ° C в М63 среде с глюкозой (0,2%) и ампициллин (100 мкг ^-1).
4. Инокулировать 15 мл той же среды в чашках Петри с 100 мкл precultures. Добавить соответствующей концентрации кобальта (т.е. 25 мкм) и не забывать отрицательный контроль без кобальта. Ввести 3 прямоугольных покровного стекла в каждой чашке Петри. Выдержите в течение ночи при 30 ° C без встряхивания.
5. Удалить покровное сюдам чашку Петри и тщательно осушить его. Тщательно очистите нижнюю часть лица с небольшой материал хлопка пропитана 70 ° этанола вытирая каждый бактериальных остатков. Для конфокальной наблюдения, очистить и верхние концы на несколько миллиметров для дальнейшей фиксации покровное.
6. Приверженец бактерии могут быть визуализированы напрямую, но быстро под флуоресцентным микроскопом, но тщательно избегать сушки образца.
7. Для конфокальной наблюдения, хранение покровное на предметное стекло с верхней поверхности покрыты биопленки лицевой стороной вверх. Биопленки затем покрывается большим покровным, который крепится к стеклу лаком. Инверсия установки, так что биопленки теперь будет на нижней части лица.
8. Место установки под конфокальный лазерный микроскоп. Право Axioplan2 LSM510 (Zeiss) конфокальный лазерный микроскоп был использован на платформе ^F Platim.
9. Установка. Excite GFP при 488 нм, и собирать бактериальные флуоресценции в диапазоне от 500 до 600 нм . Используйте 40x цель погружения нефти для получения изображений в лазерной сканирующей конфокальной режиме. Сканирование общей трехмерной структуры биопленки с твердой поверхностью к интерфейсу с ростом средней, используя шагом 1 мкм.
10. Выполните трехмерной проекции с Imaris программного обеспечения (Bitplane, Цюрих, Швейцария). Определение толщины биопленки на основе анализа среднего значения г по статистическим продольные срезы. Количественное biovolumes биопленки могут быть извлечены из конфокальной Z-стеки, как описано в другом месте ^22.

RegulonDB предоставляет информацию о механистической оперона организации и их разложение на единицы транскрипции, промоутеров и их сигма типа, гены и их сайты связывания рибосом, терминаторы, сайты связывания транскрипционных регуляторов конкретной, а также их организация в нормативных фраз.ET = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp

^б EcoGene база данных содержит обновленную информацию о E. соН К-12 генома и протеома последовательностей, в том числе обширную библиографию ген. Одним из основных направлений EcoGene была переоценка сайтов начала трансляции. http://ecogene.org/

^С http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm

^г http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix

^{электронной} дар Чун Чау Цзе, Nan Yang технический университет, Сингапур.

^F Platim микроскопических платформы UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

Результаты

В кремнии аннотации дикой последовательности РГС типа E. палочки K12, связанные с оптимизацией транскрипции и трансляции сигналов позволило разработать единый синтетический curli оперона P RCN-CSG показано на рисунке 3 (полная последовательность в дополнительных ...

Обсуждение

Критические шаги

Наиболее важным шагом в этом синтетический подход биологии гена дизайна. Синтетический геном дизайн должен быть тщательно для обеспечения эффективной производственной системы. Два гена, кодирующие волокна мономеров и трех генов, кодирующих белки, учас?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
pIG2			pUC57 (pMB1 ори, 2710 б.п.) с 3165 б.п. EcoRI / PstI фрагмент, содержащий синтетические P RCN - csgBAEFG оперона; Amp г
pUC18			MultiCopy плазмиды (pMB1 ори, 2686 б.п.), Amp г
S23			SSC1 (= GFP с метками MG1655, дар CC Зи) / pIG2
S24			SSC1/pUC18
CoCl 2	Сигма		0,1 М раствор хранится при комнатной температуре
M63			29
24-луночный планшет	Nunc	55429	Полистирол 24-луночные планшеты