El examen de selección tímica positivo y negativo por citometría de flujo

Resumen

Se presenta una citometría de flujo basado en el método para examinar el desarrollo de las células T In vivo Utilizando ratones genéticamente manipulados en un fondo de tipo salvaje o receptor de células T transgénicos.

Resumen

Un sistema inmunológico saludable requiere que las células T responden a antígenos extraños sin dejar de ser tolerante a antígenos propios. Reordenamiento aleatorio del receptor de células T (TCR) α y β loci genera un repertorio de células T con una gran diversidad en la especificidad de antígeno, tanto para uno mismo y extranjeros. Selección del repertorio durante el desarrollo en el timo es crítico para la generación de células T segura y útil. Los defectos en la selección tímica contribuir al desarrollo de trastornos autoinmunes e inmunodeficiencia ^1-4.

Progenitores de células T entrar en el timo como dobles negativas (DN) timocitos que no expresan CD4 o CD8 co-receptores. Expresión de la αβTCR y ambos receptores co-ocurre en el doble positiva (DP) etapa. Interacción de la αβTCR con el auto-péptido-MHC (pMHC) presentados por células tímicas determina el destino de la timocitos DP. Interacciones de alta afinidad conducir a la selección negativa y la eliminaciónción de las materias autorreactivas timocitos. Interacciones de baja afinidad resultado en la selección positiva y el desarrollo de las células CD4 o CD8 individuales positivos (SP) células T capaces de reconocer antígenos extraños presentados por auto-MHC ^5.

La selección positiva puede ser estudiada en ratones con un anticuerpo policlonal (tipo salvaje) repertorio TCR mediante la observación de la generación de células T maduras. Sin embargo, no son ideales para el estudio de selección negativa, que implica la supresión de pequeñas poblaciones específicas de antígeno. Muchos sistemas modelo se han utilizado para estudiar la selección negativa, pero varían en su capacidad para recapitular los eventos fisiológicos ^6. Por ejemplo, la estimulación in vitro de timocitos carece del entorno del timo que está íntimamente involucrada en la selección, mientras que la administración de antígeno exógeno puede conducir a la supresión no específica de los timocitos ^7-9. En la actualidad, las mejores herramientas para estudiar en la selección negativa vivo son ratones que expresan una transgenic TCR específico para el auto-antígeno endógeno. Sin embargo, muchos clásicos modelos transgénicos TCR se caracterizan por prematura expresión de la cadena TCRα transgénica en la etapa de DN, lo que resulta en la eyaculación de selección negativa. Nuestro laboratorio ha desarrollado el modelo HY ^CD4, en el que el transgénico HY TCRα está condicionalmente expresó en la fase DP, permitiendo la selección negativa que se producen durante la transición a DP SP como ocurre en ratones de tipo salvaje ^10.

Aquí se describe un flujo de citometría de protocolos para examinar la selección tímica positivo y negativo en el modelo de ratón HY ^CD4. Mientras que la selección negativa ^en las células CD4 HY ratones es muy fisiológico, estos métodos también se pueden aplicar a otros modelos transgénicos TCR. También se presentarán las estrategias generales para el análisis de la selección positiva en un repertorio policlonal aplicable a cualquier ratones genéticamente manipulados.

Protocolo

Consulte la Figura 1 para un esquema general del protocolo experimental.

1. Disección

1. Place acero estéril pantalla de malla en 60 x 15 mm plato Petri. Una unidad se necesita por muestra de tejido.
2. Añadir 5 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a cada placa. Mantenga los platos en hielo.
3. Eutanasiar ratones con CO _2.
4. Ratón segura a la superficie de la disección, la parte ventral hacia arriba. Spray de ratón con 70% de etanol para la esterilización y para asegurar que la piel es enredado abajo.
5. Usando tijeras quirúrgicas, comenzar la disección haciendo una incisión ventral en la piel abdominal justo por encima de los genitales. Extienda la incisión hacia arriba a la barbilla.
6. Desde la línea media, extender la incisión hacia abajo a lo largo de todas las extremidades. Tire hacia atrás la piel suelta y el pin a la superficie disección.
7. Coseche el timo:
   1. Levante la punta inferior del esternón para hacer una incisión.
   2. Evitar el hígado, cortar el diafragma para separar las costillas y luego se corta la caja torácica a cada lado. Cortar hacia arriba costillas en cada lado, teniendo cuidado de evitar los pulmones y el corazón.
   3. Tire suavemente de la caja torácica espalda con pinzas. El timo es un órgano blanco, bilobulado situado por encima del corazón. Con el borde plano de la pinza para agarrar la parte inferior de los lóbulos, tire suavemente el timo y lo coloca en la pantalla de malla.
8. Se recoge el bazo:
   1. El bazo es un rojo, en forma de tabla de surf órgano situado en el lado izquierdo de la cavidad abdominal del ratón, por debajo del hígado.
   2. Hacer una incisión en la cavidad abdominal. Retire con cuidado el bazo con un par de pinzas, utilizando el par de segundos para provocar el tejido conectivo. Coloque el bazo en una pantalla de malla separada.

2. Preparación de células

1. El uso de un émbolo de una jeringa de 3 ml, molerórganos en la malla hasta que el tejido conectivo y sólo restos de grasa. Enjuague con HBSS malla de la cápsula tres veces. Utilice un émbolo nuevo para cada muestra de tejido.
   1. Otras opciones para la homogeneización de tejido se puede utilizar en lugar de este método.
2. Contar las células usando un hemocitómetro.
3. Precipitar las células por centrifugación a 335 xg durante 5 min a 4 ° C.
4. Esplenocitos Resuspender en 500 l de tampón de lisis ACK (0,15 M NH ₄ Cl, 10 mM KHC0 _3, 0,1 mM Na ₂ EDTA, pH 7,2) durante 10 min a temperatura ambiente. Timocitos Resuspender a 20 x 10 ⁶ células / ml en tampón FACS (PBS, 1% FCS, 0,02% de azida de sodio) y dejar de lado en el hielo.
5. Volver a la isotonicidad esplenocitos mediante la adición de 5 ml de HBSS. Pellet esplenocitos por centrifugación y se resuspende en 20 x 10 ⁶ células / ml en tampón FACS. Si las células deben permanecer estériles, puede utilizar estéril RPMI + 10% de FCS.

3.Las células de tinción para citometría de flujo

El objetivo de este protocolo es delinear estrategias para el análisis de selección positiva y negativa usando tipo salvaje (WT) y ratones HY ^CD4. Por consideraciones generales relacionadas con la citometría de flujo de diseño experimental, adquisición y análisis, nos referimos a los lectores una excelente revisión de Tung et al. ¹¹

1. Alícuota de 4 x 10 ⁶ timocitos por muestra de citometría de flujo a cada pocillo de una placa de 96-pocillos, así como 1 x 10 ⁶ esplenocitos WT por control de compensación. Si el uso de ratones transgénicos, se debe incluir un ratón WT como un control en un experimento.
2. Bloquear los receptores Fc mediante la incubación de las células con anti-CD16/32 (clon 2.4G2) durante 10 min en hielo.
3. Girar la placa a 335 xg, a 4 ° C durante 5 min. Retire la tapa y disipar líquido de los pozos colocando el plato una vez, boca abajo en el fregadero. Resuspender cada pocillo en 200 l de tampón FACS. Repita el lavado.
4. Preparar cócteles de anticuerpos como se indica a continuación, utilizando la concentración óptima de cada anticuerpo sobre la base de la dilución en 200 l de tampón FACS por pocillo. La concentración óptima de cada anticuerpo se define como la concentración más baja necesaria para proporcionar la mayor separación de las poblaciones positivas y negativas. Si no existe una población negativa para un determinado anticuerpo, un anticuerpo isotipo deben ser incluidos. El volumen total por pocillo se puede reducir (por ejemplo a 100 l por pocillo) si se desea.
   1. PESO timo: anti-TCRβ, anti-CD4 y anti-CD8, anti-CD69 o anti-CD5 y anti-CD24
   2. HY timo ^CD4: anti-TCR HY (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 o anti-CD5, anti-CD24
      Para obtener una mejor separación de CD69 y CD69 ^Mín poblaciones ^HI de los timocitos, se recomienda que un anticuerpo biotinilado anti-CD69 primaria ser utilizado, seguido de una tinción secundaria que contiene un fluorocromo conjugado estreptavidina. Nos üsí la misma estrategia para CD5 tinción.
5. Se incuban las células con 200 l de cóctel de anticuerpos en tampón FACS durante 30 min en hielo en la oscuridad.
6. Coincidiendo con la tinción de anticuerpos cóctel, mancha cada control de compensación con un solo fluorocromo y conjugado de anticuerpos. Idealmente, la tinción de compensación implica los mismos anticuerpos tal como se utiliza en el cóctel de anticuerpos. Sin embargo, la tinción para cada antígeno individual puede no ser factible para grandes experimentos cuando muchos antígenos se está ensayando. Por lo tanto, la tinción de los anticuerpos anti-CD4 o anti-CD8 es recomendable debido a la alta expresión de estos antígenos, o el uso de perlas de compensación. Teñir en tampón FACS durante 30 min en hielo en la oscuridad. Agregar un control de compensación sin mancha.
7. Lavar las células dos veces con tampón FACS.
8. Resuspender las células en tampón FACS y la transferencia a tubos de FACS.
9. Adquirir muestras en citómetro de flujo. Incluye la adquisición de FSC y FSC-A-W para unllow de discriminación doblete.

4. Análisis de citometría de flujo de datos - Non-TCR ratones transgénicos

Usamos FlowJo por citometría de flujo de análisis de datos. Refiérase a la Figura 2A para la estrategia de activación periódica para no TCR ratones transgénicos.

1. Usando FSC-A por SSC, puerta electrónica en el "linfocitos" de la población.
2. Dentro de la "linfocitos" de la población, el uso FSC-A por el FSC-W electrónicamente a la puerta de la FSC-W población ^lo excluir dobletes celulares y aggregrates. Esta es la "camiseta" de la puerta.
3. Con los acontecimientos de la "camiseta" puerta, parcela CD8 por CD4. Dibuja puertas para DN, ^aburrido DP, DP ^brillante, CD4 ⁺ CD8 poblaciones ^lo, CD4SP CD8SP y como se muestra en la Figura 2B.
4. En las puertas CD4SP y CD8SP, crear TCRβ por CD24 parcelas. Utilice la herramienta de gating cuadrante para dibujar puertas como se muestra en la Figura 2C.
5. Crear una new argumento de la "camiseta" puerta: TCRβ de CD69. Dibujar puertas A, B, C, D tal como se representa en la Figura 2D.
6. Crear otra parcela de la "camiseta" puerta: TCRβ por CD5. Dibujar puertas i, ii, iii, iv como se representa en la figura 2E. Esta es otra estrategia para el examen de selección positiva.
7. Aplicar DN, ^aburrido DP, DP ^{brillante, int} CD4, CD4SP y puertas CD8SP de debajo de "singlete" a puertas i, ii, iii, iv, A, B, C, D (Figura 2 D, E).
8. Calcular el número de células en un determinado subconjunto de multiplicar celularidad de órganos por la frecuencia de cada puerta posterior hasta llegar a la población objetivo. Por ejemplo, el número de TCRβ ^hi-CD69 CD8SP timocitos sería determinado por el timo celularidad x% bhi TCR CD69-(fracción D) x CD8SP%.
   1. Contando ya tiene en cuenta que las células vivas y muertas por lo que no se incluye el lymphoc "YTE "puerta en sus cálculos.

5. Análisis de citometría de flujo de datos - TCR ratones transgénicos

Consulte la Figura 3A para la estrategia de puerta para TCR ratones transgénicos.

1. Siga los pasos 4,1 y 4,2 como en la sección anterior.
2. Bajo el "singlete" puerta, crear un T3.70 por parcela SSC y la puerta en la T3.70 ⁺ población celular a analizar antígenos específicos de células T (Figura 3B). En algunas circunstancias, puede ser de interés para comparar esta población a la no específica de antígeno (T3.70-) población de células T.
3. Dentro de la población T3.70 ^+, dibujar DN, DP, CD4SP y CD8SP puertas (Figura 3C).
   1. Para las muestras de control WT, dibujar estas puertas bajo la "camiseta" puerta o crear una T3.70-gate, ya que habrá muy pocos T3.70 ⁺ células.
4. Bajo la puerta CD8SP, crear unaT3.70 por CD24 trama. Utilice la herramienta de gating cuadrante para dividir las células en cuatro poblaciones (Figura 3F).
5. Crear un histograma que representa superpuesto expresión de CD69 en el compartimiento de DP de ratones WT y T3.70 ⁺ compartimiento DP ^de CD4 HY ratones (Figura 4A). Repetir para examinar la expresión de CD5 (Figura 4B).
6. Calcular el número absoluto de células en cada subconjunto de interés como en 4,8.

Resultados

En fisiológicos TCR modelos transgénicos y ratones WT, la selección positiva se inicia en la etapa DP ^brillante antes de pasar a la etapa de DP ^aburrido después del encuentro de antígeno. Timocitos DP ^aburridos a continuación, introduzca un CD4 ⁺ CD8 etapa de transición antes de convertirse en ^lo CD4SP o timocitos CD8SP (Figura 2B). Timocitos maduros SP se caracteriza por la alta expresión de TCR y la pérdida de CD24 (Figura 2C).

Discusión

El protocolo presentado aquí puede ser utilizado para examinar la selección positiva y negativa en no-TCR transgénicos y ratones transgénicos TCR. Este protocolo describe la tinción de antígenos de superficie. Para un análisis más detallado de los mecanismos moleculares, a menudo es necesario para realizar la tinción intracelular. Usamos la BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit para la mayoría de las proteínas intracelulares y el Kit de BD Biosciences Foxp3 de tinción para los factores de transcripción. Por...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Solución salina equilibrada de Hank HyClone	Thermo Scientific	SH30030.02
Pantallas metálicas de malla	Cedarlane	CX-0080-E-01
Placas de Petri (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	877221
Jeringuillas (3 ml)	BD Biosciences	309657
Tubos cónicos (15 ml)	Sarstedt	62.554.205
Microscopio	Zeiss - Primo Star	415500-000-00XX
Hemocitómetro	HausserCientífico	3110
Placa de 96 pocillos	Sarstedt	82.1582.001
Pipeta multicanal	Fisherbrand	21-377-829
Suero de ternero fetal	PAA	A15-701
Salina tamponada con fosfato	Fisher Scientific	SH3025802
Sodio azida	IT Baker Chemical Co.	V015-05
FcR reactivo de bloqueo			Clone 2.4G2
Anti-ratón HY TCR	eBioscience	XX-9930-YY *	Clone T3.70
Mouse anti-CD4	eBioscience	XX-0042-YY *	Clone RM4-5
Lanti-ratón CD8	eBioscience	XX-0081-YY *	Clone 53-6.7
Anti-CD24 de ratón	eBioscience	XX-0242-YY *	Clone M1/69
Anti-ratón TCRβ	eBioscience	XX-5961-YY *	Clon H57-597
Anti-CD69 de ratón biotinilado	eBioscience	13-0691-AA *	Clone H1.2F3
Anti-ratón biotinilado CD5	eBioscience	13-0051-YY *	Clone 53-7.3
Estreptavidina	eBioscience	XX-4217-YY *
Citómetro de flujo	BD Biosciences - FACS Canto	338962
FACS tubos	BD Biosciences	352052
La citometría de flujo de software de análisis	TreeStar - FlowJo	FlowJo v7 / 9
HyClone medio RPMI - 1640	Thermo Scientific	SH30027.01
			* XX varía según el fluorocromo y YY varía según el tamaño del vial.