Prüfung Thymic positive und negative Selektion mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Durchflusszytometrie-basierte Methode zur T-Zell-Entwicklung zu untersuchen In vivo Mit genetisch manipulierten Mäusen auf einer Wildtyp-oder T-Zell-Rezeptor transgenen Hintergrund.

Zusammenfassung

Ein gesundes Immunsystem verlangt, dass T-Zellen fremde Antigene reagieren, während verbleibenden tolerant gegenüber Selbst-Antigenen. Random Umlagerung der T-Zell-Rezeptor (TCR) α und β loci erzeugt eine T-Zell-Repertoire mit riesigen Vielfalt in Antigenspezifität, sowohl sich selbst als auch ausländische. Auswahl des Repertoires während der Entwicklung im Thymus ist kritisch für die Erzeugung und sichere nützlich T-Zellen. Defekte im Thymus Auswahl zur Entwicklung von Autoimmun-und Immunschwäche-Erkrankungen ^1-4.

T-Zell-Vorläufer geben den Thymus als doppelt negative (DN) Thymozyten, die nicht exprimieren CD4 oder CD8 Co-Rezeptoren. Expression des αβTCR und beide Co-Rezeptoren tritt bei der doppelt positiven (DP) Bühne. Interaktion des αβTCR mit Selbst-Peptid-MHC (pMHC) durch Thymus-Zellen präsentiert bestimmt das Schicksal der DP Thymozyten. Hochaffine Wechselwirkungen zu negativen Selektion und Eliminierung führention von selbst-reaktiven Thymozyten. Low Affinitätswechselwirkungen Ergebnis in positiver Selektion und Entwicklung von CD4 oder CD8 einzigen positiven (SP) T-Zellen in der Lage zu erkennen fremde Antigene durch Selbst-MHC ⁵ dargestellt.

Positive Selektion kann in Mäusen mit einem polyklonalen (Wildtyp) TCR Repertoires werden durch Beobachten der Erzeugung von reifen T-Zellen untersucht. Sie sind jedoch nicht ideal für das Studium der negativen Selektion, die Deletion von antigenspezifischen kleinen Populationen umfasst. Viele Modellsysteme verwendet worden, um negative Selektion zu studieren, aber variieren in ihrer Fähigkeit zu rekapitulieren physiologische Ereignisse ^6. Zum Beispiel in-vitro-Stimulation von Thymozyten fehlt die Thymus-Umgebung, die innig in Auswahl beteiligt ist, während Verabreichung von exogenen Antigens an nicht-spezifische Deletion von Thymozyten ^7-9 führen kann. Derzeit sind die besten Werkzeuge für die Untersuchung in vivo negative Selektion Mäuse, die eine transg ausdrückenenic TCR spezifisch für endogene Selbst-Antigen. Allerdings sind viele klassischen TCR-transgene Modelle von vorzeitigem Expression des transgenen TCRα Kette am DN Stufe dadurch, was zu einem vorzeitigen negative Selektion. Unser Labor hat den HY ^cd4 Modell, bei dem der transgene HY TCRα bedingt am DP Stufe exprimiert wird entwickelt, wodurch negative Selektion während der DP bis SP Übergang auftreten wie dies bei Wildtyp-Mäusen ^10.

Hier beschreiben wir eine Durchflusszytometrie-basiertes Protokoll zum Thymus positive und negative Selektion in der HY ^cd4 Mausmodell zu untersuchen. Während negative Auswahl HY ^cd4 Mäusen ist höchst physiologischen können diese Verfahren auch auf andere TCR-transgene Modelle angewendet werden. Wir werden außerdem allgemeine Strategien zur Analyse positive Selektion in einem polyklonalen Repertoire für alle genetisch manipulierten Mäusen.

Protokoll

Siehe Abbildung 1 für eine allgemeine Regelung des experimentellen Protokolls Abbildung.

Ein. Präparation

1. Ort sterile Stahlgitter Bildschirm in 60 x 15 mm Petrischale. Eine Einheit wird pro Gewebeprobe nötig.
2. 5 ml balanced salt Hank-Lösung (HBSS) zu jedem Gericht. Halten Sie Speisen auf dem Eis.
3. Einschläfern Mäuse mit CO _2.
4. Sichere Maus Dissektion Oberfläche Bauchseite nach oben. Spray-Maus mit 70% Ethanol für die Sterilisation und sicherzustellen, dass das Fell verfilzt wird unten.
5. Verwendung von chirurgischen Schere, beginnen Dissektion indem ein Einschnitt in der ventralen Bauchhaut knapp oberhalb der Genitalien. Verlängern Sie die Inzision nach oben bis zum Kinn.
6. Von der Mittellinie, verlängern die Inzision entlang aller Glieder. Ziehen Sie die lose Haut und stecken Sie es bis zur Dissektion Oberfläche.
7. Ernten Sie die Thymus:
   1. Heben Sie die untere Spitze des Brustbeins, um einen Schnitt zu machen.
   2. Die Vermeidung der Leber, senken die Membran an den Brustkorb zu lösen und dann geschnitten den Brustkorb zu jeder Seite. Schneiden Sie die Brustkorb nach oben auf jeder Seite, kümmert sich um die Lunge und des Herzens zu vermeiden.
   3. Ziehen der Brustkorb wieder mit einer Pinzette. Der Thymus ist ein weißes, bilobed Organ oberhalb des Herzens. Mit dem flachen Rand der Zange, um die Unterseite der Flügel zu erfassen, ziehen Sie den Thymus und legen Sie es auf dem Sieb.
8. Ernten die Milz:
   1. Die Milz ist ein roter, Surfboard-förmige Organ auf der linken Seite der Maus der Bauchhöhle, unterhalb der Leber entfernt.
   2. Einen Einschnitt in die Bauchhöhle. Ziehen Sie vorsichtig die Milz mit einer Pinzette, mit dem zweiten Paar zu necken sich Bindegewebe. Legen Sie die Milz auf einem separaten Sieb.

2. Cell Preparation

1. Verwendung eines Kolbens aus einer 3-ml-Spritze, schleifenOrgane in den Sieb, bis nur Bindegewebe und Fett bleibt. Spülen Mesh mit HBSS aus der Schale dreimal. Verwenden Sie einen neuen Kolben für jede Gewebeprobe.
   1. Andere Möglichkeiten zur Homogenisierung Gewebe kann anstelle dieses Verfahren verwendet werden.
2. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
3. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 335 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
4. Splenozyten resuspendieren in 500 ul ACK-Lysepuffer (0,15 M NH ₄ Cl, 10 mM KHC0 _3, 0,1 mM Na ₂ EDTA, pH 7,2) für 10 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Thymozyten bei 20 x 10 ⁶ Zellen / ml in FACS-Puffer (PBS, 1% FCS, 0,02% Natriumazid) und beiseite stellen auf Eis.
5. Splenozyten zurückzukehren, um Isotonie durch Zugabe von 5 ml HBSS. Pellet Splenozyten durch Zentrifugieren und Resuspendieren bei 20 x 10 ⁶ Zellen / ml in FACS-Puffer. Wenn Zellen steril bleiben müssen, können Sie sterilem RPMI + 10% FCS.

3.Färbung Cells für die Durchflusszytometrie

Der Zweck dieses Protokolls ist es, Strategien für die Analyse der positiven und negativen Selektion mit Wildtyp (WT) und HY ^cd4 Mäusen zu skizzieren. Für allgemeine Überlegungen zur Durchflusszytometrie experimentelles Design, Beschaffung und Analyse verweisen wir die Leserschaft auf eine ausgezeichnete Bewertung von Tung et al. ¹¹

1. Aliquot 4 x 10 ⁶ pro Thymozyten Durchflußcytometrieprobe zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte, sowie 1 x 10 ⁶ Splenozyten WT pro Kompensationssteuerung. Bei der Verwendung von transgenen Mäusen, sollten Sie einen WT-Maus als Kontrolle in den Test einbezogen werden.
2. Fc-Rezeptoren blockieren, durch Inkubieren von Zellen mit anti-CD16/32 (Klon 2.4G2) für 10 min auf Eis.
3. Drallplatte bei 335 × g bei 4 ° C für 5 min. Deckel entfernen und zu zerstreuen Flüssigkeit sorgfältig durch Ausklopfen der Platte einmal nach unten in einer Senke. Resuspendieren jedes Well in 200 ul FACS Puffer. Wiederholen Sie die Wäsche.
4. Bereiten Antikörper Cocktails wie unten aufgeführt, über die optimale Konzentration jedes Antikörpers zur Verdünnung in 200 ul FACS-Puffer pro well basiert. Die optimale Konzentration der einzelnen Antikörper wird als die niedrigste Konzentration benötigt wird, um die größte Trennung von positiven und negativen Populationen geben definiert. Wenn es keinen negativen Population für einen gegebenen Antikörper, sollte ein Isotyp-Antikörper enthalten sein. Das Gesamtvolumen pro Vertiefung können verkleinert werden (zB zu 100 ul pro Well), falls gewünscht.
   1. WT Thymus: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8-, Anti-CD69 oder anti-CD5-, Anti-CD24
   2. HY ^cd4 Thymus: anti-TCR HY (T3.70), anti-CD4, anti-CD8-, Anti-CD69 oder anti-CD5-, Anti-CD24
      Um eine bessere Trennung von CD69 und CD69 ^{lo hallo} Populationen in Thymocyten zu erhalten, wird empfohlen, dass ein biotinylierter anti-CD69 primärer Antikörper verwendet werden, gefolgt von einem sekundären Fleck enthält Fluorochrom-konjugiertem Streptavidin. Wir use die gleiche Strategie für CD5 Färbung.
5. Inkubieren von Zellen mit 200 ul Antikörper-Cocktail in FACS-Puffer für 30 min auf Eis im Dunkeln.
6. Zeitgleich mit Antikörper-Cocktail Färbung, färben jede Entschädigung Steuerung mit einer einzigen Fluorochrom konjugierte Antikörper. Im Idealfall beinhaltet Entschädigung Färbung die gleichen Antikörper wie in der Antikörper-Cocktail verwendet. Allerdings kann Färbung für jedes einzelne Antigen nicht machbar sein für größere Experimente, wenn viele Antigene untersucht wird. Daher wird Anfärben für entweder Anti-CD4-oder Anti-CD8 empfohlen aufgrund hoher Expression dieser Antigene, oder die Verwendung von Kompensation Kügelchen. Färben in FACS-Puffer für 30 min auf Eis im Dunkeln. Lassen Sie eine Ausgleichsregelung ungefärbt.
7. Waschen der Zellen zweimal mit FACS-Puffer.
8. Die Zellen in FACS-Puffer und Transfer zum FACS-Röhrchen.
9. Erwerben Proben auf Durchflusszytometer. Beinhalten den Erwerb von FSC-A-und FSC-W einllow für Dublett Diskriminierung.

4. Analyse der Durchflusszytometrie Data - Non-TCR transgenen Mäusen

Wir verwenden FlowJo für die Durchflusszytometrie Datenanalyse. Siehe 2A für die Gating-Strategie für nicht-TCR transgenen Mäusen Abbildung.

1. Mit FSC-A von SSC, elektronisch Tor auf der "Lymphozyten" Bevölkerung.
2. Im Rahmen der "Lymphozyten" Bevölkerung, verwenden FSC-A von FSC-W elektronisch Tor des FSC-W ^lo Bevölkerung zu Zelle Dubletten und aggregrates auszuschließen. Dies ist die "Singulett" Tor.
3. Mit den Veranstaltungen in der "Singulett" Tor, Grundstück CD8 von CD4. Zeichnen Tore für DN, DP ^langweilig, DP ^hell, CD4 ⁺ CD8 ^lo, CD4SP und CD8SP Populationen wie in 2B dargestellt.
4. Unter dem CD4SP und CD8SP Tore, erstellen TCRβ von CD24 Plots. Verwenden Sie den Quadranten Gating-Tool zu Toren zu ziehen wie in 2C dargestellt.
5. Erstellen Sie eine new Plot aus der "Singulett" Tor: TCRβ von CD69. Zeichnen Gatter A, B, C, D wie in 2D dargestellt.
6. Erstellen Sie ein weiteres Grundstück von der "Singulett" Tor: TCRβ von CD5. Zeichnen Gatter i, ii, iii, iv, wie in 2E dargestellt ist. Dies ist eine weitere Strategie zur Untersuchung positive Selektion.
7. Bewerben DN, DP ^langweilig, DP ^hell, CD4 ^int, CD4SP und CD8SP Toren unter "Singulett" zu Toren i, ii, iii, iv, A, B, C, D (2D, E).
8. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen in einer bestimmten Untergruppe durch Multiplikation Orgel Zellularität durch die Häufigkeit der einzelnen nachfolgenden Tor, bis Sie Ihre Zielgruppe erreichen. Zum Beispiel kann die Anzahl der TCRβ ^hallo CD69-CD8SP Thymozyten würde durch Thymus Zellularität x% TCR bhi bestimmt werden CD69-(Fraktion D) x% CD8SP.
   1. Zählen berücksichtigt bereits die lebenden und toten Zellen also nicht auch die "lymphocYTE "Tor in Ihren Berechnungen.

5. Analyse der Durchflusszytometrie Data - TCR transgenen Mäusen

Siehe 3A für die Gating-Strategie für TCR transgenen Mäusen Abbildung.

1. Folgen Sie den Schritten 4,1 und 4,2, wie im vorherigen Abschnitt.
2. Unter dem "Singulett" Tor, eine T3.70 von SSC Plot und Tor auf der T3.70 ⁺ Zellpopulation Antigen-spezifischen T-Zellen (3B) zu analysieren. In manchen Fällen kann es von Interesse sein, diese Bevölkerung zu dem nicht antigenspezifischen (T3.70-) T-Zell-Population zu vergleichen.
3. Innerhalb der T3.70 ⁺ Bevölkerung, draw DN, DP, CD4SP und CD8SP Tore (3C).
   1. Für WT Kontrollproben, zeichnen diese Tore unter dem "Singulett" Tor oder eine T3.70-Gate, da nur sehr wenige T3.70 ^+-Zellen sein wird.
4. Unter dem CD8SP Tor, erstellen Sie eineT3.70 von CD24 Grundstück. Verwenden des Quadranten Gating Werkzeug, um Zellen in vier Populationen (3F) zu unterteilen.
5. Neu überlagerte Histogramm, welches die CD69-Expression in den DP-Kompartiment von WT-Mäusen und T3.70 ⁺ DP Abteil HY ^cd4 Mäusen (4A). Wiederholen Sie den Vorgang CD5 Expression (4B) zu untersuchen.
6. Berechnen der absoluten Anzahl von Zellen in jeder Untergruppe von Interesse, wie in 4.8.

Ergebnisse

In physiologischen TCR transgene Modelle und WT Mäusen, beginnt positive Selektion an der DP ^hellen Bühne, bevor er in den DP ^langweilig Stufe nach Antigen Begegnung. DP ^langweilig Thymozyten und geben Sie dann eine Übergangsregelung CD4 ⁺ CD8 ^lo Bühne, bevor er CD4SP oder CD8SP Thymozyten (Abbildung 2B). Mature SP Thymozyten zeichnen sich durch hohe TCR-Expression und den Verlust von CD24 (2C) gekennzeichnet. Während die CD8 d...

Diskussion

Die hier vorgestellten Protokoll kann verwendet werden, um positive und negative Selektion in nicht-transgenen und TCR TCR-transgenen Mäusen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Färbung von Oberflächen-Antigenen. Für die weitere Analyse der molekularen Mechanismen, ist es oft notwendig, intrazelluläre Färbung führen. Wir verwenden die BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit für die meisten intrazellulären Proteinen und der BD Biosciences Foxp3 Staining Kit für Transkriptionsfaktoren. Wir in der Regel ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
HyClone Hanks balanced salt solution	Thermo Scientific	SH30030.02
Drahtgewebeelementen	Cedarlane	CX-0080-E-01
Petrischalen (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	877221
Spritzen (3 ml)	BD Biosciences	309657
Konischen Röhren (15 ml)	Sarstedt	62.554.205
Mikroskop	Zeiss - Primo Star	415.500-00XX-000
Hemocytometer	HausserWissenschaftlich	3110
96-Well-Platte	Sarstedt	82.1582.001
Mehrkanalpipette	Fisherbrand	21-377-829
Fötales Kälberserum	PAA	A15-701
Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung	Fisher Scientific	SH3025802
Natriumazid	IT Baker Chemical Co.	V015-05
FcR Blockierungsreagenz			Clone 2.4G2
Anti-Maus-HY TCR	eBioscience	XX-9930-YY *	Clone T3.70
Anti-Maus-CD4	eBioscience	XX-0042-YY *	Clone RM4-5
Anti-Maus CD8a	eBioscience	XX-0081-YY *	Clone 53-6,7
Anti-Maus-CD24	eBioscience	XX-0242-YY *	Clone M1/69
Anti-Maus-TCRβ	eBioscience	XX-5961-YY *	Clone H57-597
Anti-Maus-CD69 Biotinylierte	eBioscience	13-0691-YY *	Clone H1.2F3
Anti-Maus-CD5 Biotinylierte	eBioscience	13-0051-YY *	Clone 53-7,3
Streptavidin	eBioscience	XX-4217-YY *
Durchflusszytometer	BD Biosciences - FACS Canto	338962
FACS-Röhrchen	BD Biosciences	352052
Durchflusszytometrie-Analyse-Software	TreeStar - FlowJo	FlowJo v7 / 9
HyClone RPMI - 1640 Medium	Thermo Scientific	SH30027.01
			* XX variiert je nach Fluorochrom und YY variiert je nach Gefäß Größe.