Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz T hücre gelişimini incelemek üzere bir akım sitometri tabanlı bir yöntem sunmak In vivo Bir yabani-tip veya T hücre reseptörü transgenik arka plan üzerinde genetik manipüle fare kullanarak.

Özet

Sağlıklı bir bağışıklık sistemi kendi antijenlerine tolerans kalırken T hücrelerinin yabancı antijenleri yanıt gerektirir. T hücre reseptör (TCR) α ve β lokusların Rastgele düzenlenmesi öz ve yabancı hem antijen özgüllüğü engin çeşitliliği ile T hücre repertuarı oluşturur. Timusta gelişimi sırasında repertuar seçimi güvenli ve kullanışlı T hücreleri üretmek için önemlidir. Timik seçiminde Kusur otoimmün ve immün bozuklukları 1-4 gelişmesine katkıda bulunur.

T hücre progenitörler CD4 veya CD8 co-reseptörleri ifade etmezler çift negatif (DN) timositleri olarak timus girin. ΑβTCR hem eş-reseptör ekspresyonu çift pozitif (DP) aşamada gerçekleşir. Öz-peptid-MHC (pMHC) timus hücreleri tarafından sunulan ile αβTCR Etkileşimi DP timosit kaderini belirler. Yüksek afinite etkileşimleri olumsuz seçimi ve ortadan kalk yolkendinden reaktif timositlerin tion. CD4 veya kendinden MHC 5 tarafından sunulan yabancı antijenleri tanıma yeteneğine CD8 tek pozitif (SP) T hücrelerinin pozitif seçimi ve gelişimi Düşük afinite etkileşimleri sonucu.

Pozitif Seçimi olgun T hücrelerinin üretimi gözlemleyerek bir poliklonal (yabani-tip) TCR repertuarı ile farelerde incelenebilir. Bununla birlikte, küçük antijen-spesifik popülasyonlarının silme içerir negatif seçim çalışma için ideal değildir. Birçok model sistemler negatif seçim çalışma ama fizyolojik olaylar 6 özetlemek için yeteneklerini değiştirmek için kullanılan edilmiştir. Eksojen antijen uygulamasından timositlerde 7-9 non-spesifik silme yol açabilir Örneğin, timositlerde in vitro uyarımı olarak, iç içe işlemine dahil olan timik ortam yoksundur. Şu anda, in vivo negatif seleksiyon eğitim için en iyi araçları bir transgresyon ifade fareler vardırself-antijen endojen için ENIC TCR özgü. Bununla birlikte, birçok klasik TCR transjenik modelleri prematüre negatif seçim ile sonuçlanan, DN aşamada transgenik TCRα zincirinin erken ifade ile karakterize edilir. Bizim laboratuvar olarak 10 yabani-tip farelerden oluşan negatif seleksiyon SP geçiş DP sırasında meydana sağlayan, transgenik HY TCRα şartlı DP aşamada ifade edildiği HY cd4 model geliştirdi.

Burada, HY cd4 fare modelinde timik pozitif ve negatif seçim incelemek için bir akış sitometri tabanlı protokol açıklar. HY CD4 farelerde, negatif seleksiyon çok fizyolojik olmakla birlikte, bu yöntemlerin diğer TCR transjenik modelleri ile de uygulanabilir. Biz de herhangi bir genetik manipüle fare için geçerli bir poliklonal repertuar olumlu seçimi analiz için genel stratejiler sunacak.

Protokol

Deneysel protokol genel bir şema için Şekil 1 'e bakınız.

1. Teşrih

  1. 60 x 15 mm Petri kabı içine yerleştirin steril çelik örgü ekran. Bir birim doku örneği başına gereklidir.
  2. Her bir tabak için Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 5 ml ilave edilir. Buz üzerinde yemekleri tutun.
  3. CO 2 ile farelerin Euthanize.
  4. Diseksiyon yüzey Güvenli fare yukarı bakacak ventral tarafta. Sterilizasyon için% 70 etanol ve kürk aşağı keçeleşmiş sağlamak için Sprey fare.
  5. Cerrahi makas kullanarak, sadece genital Yukarıdaki karın derisinde bir ventral kesi yaparak diseksiyon başlar. Çene insizyon yukarı uzatın.
  6. Midline itibaren, tüm uzuvları boyunca kesi uzanması. Gevşek cilt geri çekin ve diseksiyon yüzeye aşağı pin.
  7. Timus Harvest:
    1. Bir kesi yapmak için sternumun alt ucu kaldırın.
    2. Karaciğer kaçınmak, göğüs kafesi ayırmak ve sonra her tarafa göğüs kafesi kesmek için diyafram kesti. Akciğer ve kalp önlemek için dikkat çekici, her iki tarafta göğüs kafesi yukarı kesin.
    3. Göğüs kafesi arkasında forseps ile yavaşça çekin. Timus kalp üzerinde bulunan bir beyaz, bilobe organdır. Lobların alt kavramak için forseps düz kenar kullanarak yavaşça timus çekin ve ekran örgü üzerine yerleştirin.
  8. Dalak Harvest:
    1. Dalak karaciğer aşağıda farenin karın boşluğunda, sol tarafında yer alan kırmızı, sörf tahtası şeklinde bir organdır.
    2. Karın boşluğuna bir kesi olun. Yavaşça bağ dokusu uzakta tease ikinci çifti kullanılarak, forseps bir çift ile dalak dışarı çekin. Ayrı bir boy gözenekli elek üzerinde dalak yerleştirin.

2. Hücre Hazırlanması

  1. 3 ml şırınga bir pistonu kullanarak, eziyetsadece bağ dokusu ve yağ kalıntıları kadar ekran örgü içine organları. Çanak HBSS üç kez örgü durulayın. Her doku örneği için yeni bir dalgıç kullanın.
    1. Doku homojenleştirici için diğer seçenekler bu yöntem yerine kullanılabilir.
  2. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
  3. 335 santrifüje edilerek pellet hücreler 4 ° C 'de 5 dakika xg
  4. Oda sıcaklığında 10 dakika için ACK lizis tamponu 500 ul (0.15 M NH4CI, 10 mM KHC0 3, 0.1 mM Na 2 EDTA, pH 7.2) içinde süspanse splenositlerin. 20 süspanse timositleri x 10 6 hücre / ml FACS tampon (PBS,% 1 FCS,% 0.02 sodyum azid) ve buz üzerinde bir kenara koyun.
  5. HBSS 5 ml ekleyerek izotoniklik için splenositlerin dönün. Pelet 20 santrifüj ve tekrar süspansiyon tarafından splenositlerin x 10 6 hücre / FACS tampon ml. Hücrelerinin steril kalması gerekiyorsa, steril RPMI +% 10 FCS kullanabilirsiniz.

3.Akış sitometrisi için Boyama Hücreleri

Bu protokolün amacı, yabani-tip (WT) ve HY cd4 fareler kullanarak pozitif ve negatif seçim analizi için stratejilerin altını çizmektir. Flow sitometri deneysel tasarım, satın alma, ve analizi ile ilgili genel değerlendirmeler için, biz Tung ark mükemmel bir inceleme okuyucuları bakın. 11.

  1. Alikot 4 x 10 96-kuyulu plakanın her bir kuyucuğa akış sitometrisi numune başına 6 timositlerde yanı sıra, telafi kontrol başına 1 x 10 6 WT splenositlerin. Transgenik fareler kullanarak, size deneyde bir denetim olarak WT fare içermelidir.
  2. Buz üzerinde 10 dakika için anti-CD16/32 (klon 2.4G2) ile hücreler inkübe ederek Fc reseptörleri bloke ederler.
  3. 5 dk için 4 ° C sıcaklıkta 335 x g'de plaka Spin. Kapağını kaldırın ve bir kez plaka iterek kuyulardan sıvı dağıtmak, bir lavabo içine doğru bakmalıdır. FACS tamponu içinde 200 ul her bir kuyu yeniden süspanse edin. Yıkama tekrarlayın.
  4. Aşağıda listelenen de FACS tampon başına 200 ul içinde seyreltme göre her bir antikor için optimum konsantrasyonu kullanılarak, antikor kokteyller hazırlayın. Her bir antikorun en uygun konsantrasyon pozitif ve negatif nüfusun büyük ayırma vermek için gereken en düşük konsantrasyon olarak tanımlanmıştır. , Belirli bir antikor için negatif bir nüfus var ise, bir antikor izotip dahil edilmelidir. İstenirse kuyu başına toplam hacmi (kuyu başına 100 ul) örneğin küçültülmüş olabilir.
    1. WT timüs: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ya da anti-CD5, anti-CD24
    2. Timus HY CD4: anti-TCR HY (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ya da anti-CD5, anti-CD24
      CD69 lo ve timositleri yılında CD69 yüksek nüfus daha iyi ayrılması elde etmek için, onun tarafından izlenen bir biotinlenmiş anti-CD69 primer antikor kullanılması tavsiye edilir ikincil bir florokrom-konjuge streptavidin içeren leke. Biz uCD5 boyama için se aynı stratejiyi.
  5. Karanlıkta buz üzerinde 30 dakika süre ile FACS tamponu içinde antikor kokteyli 200 ul hücre ile inkübe edin.
  6. Antikor kokteyli boyama ile eş zamanlı olarak, tek bir florokrom-konjuge antikor ile her kompanzasyon kontrolü leke. İdeal olarak, dengeleme boyama antikor kokteyli içinde kullanılan aynı antikorları içerir. Birçok antijen test ediliyor Ancak, her bir antijen için boyama büyük deneyler için uygun olmayabilir. Bu nedenle, anti-CD4, anti-CD8 ya da ya da için yüksek renklendirme, bu antijenlerin ifadesi ya da telafi boncuk kullanımına bağlı olarak tavsiye edilir. Karanlıkta buz üzerinde 30 dakika süre ile FACS tamponu içinde Leke. Bir telafi kontrolü boyanmadan bırakın.
  7. FACS tamponu ile iki kez hücreleri yıkayın.
  8. FACS tampon ve FACS tüplerine transfer süspanse edin hücreleri.
  9. Akış sitometresinde örnekleri edinin. FSC-A edinimi ve FSC-W dahilçiftli ayrımcılık llow.

4. Akım Sitometri Veri Analizi - Sigara TCR Transgenik Fare

Biz flow sitometri veri analizi için FlowJo kullanın. Non-TCR transgenik fareler için yolluk strateji 2A Şekil bakın.

  1. SSC, "lenfosit" nüfus üzerindeki elektronik kapıdan FSC-A kullanma.
  2. "Lenfosit" nüfus içinde, hücre çiftler ve aggregrates dışlamak için elektronik kapı FSC-W lo nüfus FSC-W tarafından FSC-A kullanın. Bu "singlet" kapısıdır.
  3. "Singlet" kapısı, CD4 arsa CD8 olayları kullanma. DN, DP donuk, DP aydınlık için geçitler çizin, CD4 Şekil 2B'de gösterildiği gibi + CD8 lo, CD4SP ve CD8SP nüfus.
  4. CD4SP ve CD8SP kapılar altında, CD24 araziler tarafından TCRβ oluşturun. Şekil 2C tasvir gibi kapıları çizmek için kadranda gating aracını kullanın.
  5. A ne oluşturmaCD69 ile TCRβ: "tekli" kapısı w arsa. Kapıları A, B, C, D, Şekil 2B'de gösterilmiştir. Çizme
  6. CD5 tarafından TCRβ: "tekli" kapıdan başka bir arsa oluşturun. Şekil 2E tasvir gibi kapıları i, ii, iii, iv çizin. Bu pozitif seleksiyon incelenmesi için başka bir stratejidir.
  7. Kapıları i, ii, iii, iv, A, B, C, D (Şekil 2B, E) "singlet" altından DN, DP donuk, DP parlak, CD4 int, CD4SP ve CD8SP kapıları uygulayın.
  8. Eğer hedef nüfus ulaşana kadar sonraki her kapının frekansını organ selülarite çarparak belirli bir alt kümesi hücrelerin sayısını hesaplayın. Örneğin, TCRβ hi CD69-CD8SP timositlerin sayı timüs sellüler x% TCR BHI tarafından belirlenecektir CD69-(D fraksiyonu) x% CD8SP.
    1. Sayma zaten canlı ve ölü hücreleri böylece "lymphoc içermez dikkate alırhesaplamalarda YTE "kapısı.

5. Akım Sitometri Veri Analizi - TCR Transgenik Fareler

TCR transgenik fareler için yolluk strateji 3A Şekil bakın.

  1. Adımlarda, önceki bölümlerde olduğu gibi 4.1 ve 4.2 izleyin.
  2. "Singlet" kapı altında T3.70 üzerine SSC arsa ve kapı bir T3.70 oluşturmak + hücre popülasyonu antijen-spesifik T hücreleri (Şekil 3B) analiz etmek. Bazı durumlarda, bu non-spesifik antijen (T3.70-) T hücre popülasyonu bu nüfusu karşılaştırmak için ilgi çekici olabilir.
  3. Içinde T3.70 + nüfus, beraberlik DN, DP, CD4SP ve CD8SP kapıları (Şekil 3C).
    1. Çok az T3.70 + hücreleri olacak gibi WT kontrol örnekleri için, "tekli" kapısının altına bu kapılardan çizmek veya bir T3.70 kapısı oluşturun.
  4. CD8SP kapısı altında, oluşturmakCD24 arsa T3.70. Dört nüfus (Şekil 3F) içine hücre bölmek için kadranda gating aracını kullanın.
  5. WT fareler ve HY cd4 farelerin T3.70 + DP bölmesi (Şekil 4A) DP bölmesinde CD69 ekspresyonu gösteren Kalıplı bir histogram oluşturun. CD5 ekspresyonu (Şekil 4B) incelemek için tekrarlayın.
  6. 4.8 gibi ilgi her alt hücrelerin mutlak sayısını hesaplayın.

Sonuçlar

Fizyolojik TCR transgenik modeller ve WT farelerde, pozitif seleksiyon antijen karşılaşma sonrasında DP donuk aşamaya geçmeden önce DP parlak aşamada başlar. DP donuk timositleri ardından CD4SP veya CD8SP timositleri (Şekil 2B) olmadan önce bir geçiş CD4 + CD8 lo sahne girin. Olgun SP timositleri yüksek TCR ekspresyonu ve CD24 (Şekil 2C) kaybı ile karakterize edilir. Profil CD69 veya CD5 tarafından TCRβ inceleyere...

Tartışmalar

Burada sunulan protokol olmayan TCR transjenik ve TCR transgenic farelerde pozitif ve negatif seçim incelemek için kullanılabilir. Bu protokol, yüzey antijenlerinin boyama açıklanmaktadır. Moleküler mekanizmalarının daha fazla analiz için, genellikle hücre içi boyama yapmak için gereklidir. Biz transkripsiyon faktörleri için en intraselüler proteinler ve BD Biosciences Foxp3 Boyama Seti BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kiti kullanın. Biz genellikle hemen boyama sonra örnekleri kazanır. Bununla birli...

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Yazarlar kendi teknik yardım için Bing Zhang teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık Araştırması (MOP-86595) için Kanada Enstitüleri tarafından finanse edildi. SEKME CIHR Yeni Araştırmacı ve AHFMR Scholar olduğunu. Doktora ve AIHS Tam zamanlı Bursu - HY bir CIHR Kanada Lisansüstü Burs tarafından desteklenmektedir. SAN Kraliçe Elizabeth II Lisansüstü Burs tarafından desteklenmektedir. Doktora - AYWS bir NSERC Lisansüstü Burs tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
HyClone Hank'in dengeli tuz çözeltisi Thermo Scientific SH30030.02
Metal örgü ekranlar Cedarlane CX-0080-E-01
Petri kapları (60 x 15 mm) Fisher Scientific 877221
Enjektörler (3 ml) BD Biosciences 309657
Konik boru (15 ml) Sarstedt 62.554.205
Mikroskop Zeiss - Primo Yıldız 415500-00XX-000
Hemasitometre HausserBilimsel 3110
96-kuyulu plakalı Sarstedt 82.1582.001
Kanallı pipet Fisherbrand 21-377-829
Fetüs buzağı serumu PAA A15-701
Fosfat tamponlu salin Fisher Scientific SH3025802
Sodyum azid BT Baker Chemical Co V015-05
FCR engelleme reaktif Klon 2.4G2
Anti-fare HY TCR eBioscience XX-9930-YY * Klon T3.70
Anti-fare CD4 eBioscience XX-0042-YY * Klon RM4-5
AYüzgeç-fare CD8α eBioscience XX-0081-YY * Klon 53-6,7
Anti-fare CD24 eBioscience XX-0242-YY * Klon M1/69
Anti-fare TCRβ eBioscience XX-5961-YY * Klon H57-597
Anti-fare CD69 biotinlenmiş eBioscience 13-0691-YY * Klon H1.2F3
Anti-fare CD5 biotinlenmiş eBioscience 13-0051-YY * Klon 53-7,3
Streptavidin eBioscience XX-4217-YY *
Akış sitometresi BD Biosciences - FACS Canto 338962
FACS tüpler BD Biosciences 352052
Flow sitometri analiz yazılımı TreeStar - Flowjo FlowJo v7 / 9
HyClone RPMI - 1640 orta Thermo Scientific SH30027.01

Florokrom ve YY Şişe boyutuna göre değişir tarafından * XX değişir.

Referanslar

  1. Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
  2. Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
  3. Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
  4. Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
  5. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
  6. McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
  7. Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
  8. Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
  9. Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
  10. Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
  11. Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
  12. Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
  13. Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
  14. Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
  15. Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
  16. Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
  17. Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
  18. Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
  19. Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
  20. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
  21. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  22. Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  23. Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
  24. Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
  25. Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
  26. Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
  27. Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
  28. Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
  29. Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  30. Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
  31. Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
  32. Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm nolojiSay 68T pH cresel BiyolojiAnatomiFizyolojiThymusT h crenegatif seleksiyonpozitif seleksiyonotoimm niteak m sitometri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır