Esame di Selezione timica positivi e negativi per Citometria a Flusso

Riepilogo

Vi presentiamo un metodo basato citometria di flusso per esaminare lo sviluppo delle cellule T In vivo Utilizzando topi geneticamente manipolati su un tipo selvatico o T sfondo recettore delle cellule transgeniche.

Abstract

Un sistema immunitario sano è necessario che le cellule T rispondono agli antigeni estranei, pur rimanendo tolleranza di auto-antigeni. Riarrangiamento casuale del recettore delle cellule T (TCR) α e β loci genera un repertorio T cella con grande diversità nella specificità antigenica, sia per sé ed esteri. Selezione del repertorio durante lo sviluppo nel timo è critica per generare le cellule T sicuro e utile. Difetti di selezione timica contribuire allo sviluppo di malattie autoimmuni e immunodeficienza ^1-4.

Progenitori delle cellule T inserire il timo come doppi negativi (DN) timociti che non esprimono CD4 o CD8 co-recettori. Espressione del αβTCR ed entrambi co-recettori avviene a doppio positivo (DP) stadio. Interazione del αβTCR con auto-peptide-MHC (pMHC) presentata da parte delle cellule del timo determina il destino del timociti DP. Interazioni ad alta affinità portare alla selezione negativa e di eliminazionezione di auto-reattivi timociti. Bassa affinità risultato interazioni in selezione positiva e sviluppo di CD4 o CD8 singoli positivi (SP) cellule T capaci di riconoscere antigeni estranei presentati da auto-MHC ^5.

Selezione positiva può essere studiata in topi con un anticorpo (tipo selvatico) repertorio TCR osservando la generazione di cellule T mature. Tuttavia, essi non sono ideali per lo studio di selezione negativa, che comporta l'eliminazione di piccoli antigene-specifiche popolazioni. Molti sistemi modello sono stati utilizzati per studiare selezione negativa, ma variano nella loro capacità di ricapitolare eventi fisiologici ^6. Per esempio, stimolazione in vitro dei timociti manca dell'ambiente timica che è intimamente coinvolto nella selezione, mentre la somministrazione di antigene esogeno può portare a non-specifico delezione di timociti ^7-9. Attualmente, i migliori strumenti per lo studio in vivo selezione negativa sono topi che esprimono una transgENIC specifico TCR per endogena auto-antigene. Tuttavia, molti classici modelli transgenici TCR sono caratterizzati dalla prematura espressione della catena transgenico TCRα nella fase DN, con conseguente prematuro selezione negativa. Il nostro laboratorio ha sviluppato il modello HY ^cd4, in cui il transgenico HY TCRα condizionatamente espressa nella fase DP, consentendo la selezione negativa a verificarsi durante il DP di transizione SP come avviene nei topi di tipo selvatico ^10.

Qui, si descrive un protocollo basato citometria di flusso per esaminare timica selezione positiva e negativa nel topo HY modello ^CD4. Mentre la selezione negativa in topi ^CD4 HY è altamente fisiologica, questi metodi possono essere applicati anche ad altri modelli transgenici TCR. Ci sarà anche la presentazione delle strategie generali per l'analisi di selezione positiva in un repertorio policlonale applicabile a tutti i topi geneticamente manipolati.

Protocollo

Fare riferimento alla Figura 1 per uno schema generale del protocollo sperimentale.

1. Dissezione

1. Luogo sterile setaccio a maglia d'acciaio in 60 x 15 millimetri capsula di Petri. Una unità è necessaria per campione di tessuto.
2. Aggiungere 5 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a ogni piatto. Tenere i piatti sul ghiaccio.
3. Eutanasia topi con CO _2.
4. Del mouse sulla superficie protetta dissezione, lato ventrale rivolto verso l'alto. Mouse spruzzo con 70% etanolo per la sterilizzazione e per assicurare che il pelo è arruffati giù.
5. Usando forbici chirurgiche, cominciano dissezione facendo una incisione nella pelle ventrale addominale appena sopra i genitali. Estendere incisione verso l'alto fino al mento.
6. Dalla linea mediana, estendere l'incisione giù lungo tutti gli arti. Tirare indietro la pelle flaccida e il pin verso il basso sulla superficie dissezione.
7. Raccolto il timo:
   1. Sollevare la punta inferiore dello sterno per fare un'incisione.
   2. Evitare il fegato, tagliare il diaframma per staccare la gabbia toracica e poi tagliare la gabbia toracica per ogni lato. Tagliare i cassa toracica verso l'alto su entrambi i lati, avendo cura di evitare i polmoni e il cuore.
   3. Estrarre delicatamente il retro cassa toracica con una pinza. Il timo è un bianco, organo bilobato situato sopra il cuore. Utilizzando il bordo piatto della pinza per afferrare la parte inferiore dei lobi, tirare delicatamente il timo e posizionarlo sullo schermo maglia.
8. Raccogliere la milza:
   1. La milza è un rosso, a forma di tavola da surf organo situato sul lato sinistro della cavità addominale del mouse, sotto il fegato.
   2. Effettuare un'incisione nella cavità addominale. Estrarre delicatamente la milza con un paio di pinze, con la seconda coppia per prendere in giro via del tessuto connettivo. Posizionare la milza su uno schermo a rete separata.

2. Preparazione cellulare

1. Utilizzando uno stantuffo di una siringa da 3 ml, macinareorgani nello schermo maglia fino tessuto connettivo e solo resti di grasso. Sciacquare maglia con HBSS dal piatto tre volte. Utilizzare un pistone nuovo per ogni campione di tessuto.
   1. Altre opzioni per omogeneizzare tessuto può essere utilizzato al posto di questo metodo.
2. Contare le cellule con un emocitometro.
3. Pellet di cellule per centrifugazione a 335 xg per 5 minuti a 4 ° C.
4. Splenociti Risospendere in 500 pl di tampone di lisi ACK (0,15 M NH ₄ Cl, 10 mM KHC0 _3, 0,1 mM Na ₂ EDTA, pH 7,2) per 10 min a temperatura ambiente. Timociti Risospendere a 20 x 10 ⁶ cellule / ml in FACS tampone (PBS, 1% FCS, sodio azide 0,02%) e mettere da parte su ghiaccio.
5. Ritorno splenociti di isotonicità aggiungendo 5 ml di HBSS. Splenociti pellet per centrifugazione e risospendere a 20 x 10 ⁶ cellule / ml in tampone FACS. Se le cellule hanno bisogno di rimanere sterile, è possibile utilizzare sterile RPMI + 10% FCS.

3.Le cellule colorazione per Citometria a Flusso

Lo scopo di questo protocollo è quello di delineare strategie per l'analisi di selezione positiva e negativa utilizzando tipo selvatico (WT) e topi ^CD4 HY. Per considerazioni di carattere generale in materia di citometria a flusso di progettazione sperimentale, l'acquisizione e l'analisi, si rimanda ad un eccellente recensione di Tung et al ^11.

1. Aliquotare 4 x 10 ⁶ timociti per campione di citometria a flusso per ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, così come 1 x 10 ⁶ splenociti WT per il controllo di compensazione. Se si utilizza topi transgenici, è necessario includere un topo WT come un controllo in un esperimento.
2. Bloccare i recettori Fc incubando le cellule con anti-CD16/32 (clone 2.4G2) per 10 min in ghiaccio.
3. Spin piastra a 335 xg a 4 ° C per 5 min. Togliere il coperchio e dissipare liquido dai pozzetti muovendo la piastra una volta, a faccia in giù in un lavandino. Risospendere ogni pozzetto in 200 pl di tampone FACS. Ripetere il lavaggio.
4. Preparare cocktail di anticorpi come di seguito elencati, usando la concentrazione ottimale di ciascun anticorpo base diluizione in 200 pl di tampone FACS per pozzetto. La concentrazione ottimale di ciascun anticorpo è definita come la concentrazione minima necessaria per fornire il più grande separazione di popolazioni positive e negative. Se non c'è popolazione negativa per un determinato anticorpo, un anticorpo isotipo dovrebbero essere inclusi. Il volume totale per pozzetto può essere ridotta (ad esempio a 100 pl per pozzetto), se desiderato.
   1. WT timo: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 o anti-CD5, anti-CD24
   2. ^CD4 HY timo: anti-HY TCR (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 o anti-CD5, anti-CD24
      Per ottenere una migliore separazione di CD69 e CD69 ^lo popolazioni ^hi in timociti, si raccomanda che un anticorpo biotinilato anti-CD69 primaria essere utilizzato, seguito da una macchia secondaria contenente fluorocromo coniugato streptavidina. Abbiamo use la stessa strategia per CD5 colorazione.
5. Incubare le cellule con 200 ml di cocktail di anticorpi in tampone FACS per 30 min in ghiaccio, al buio.
6. In concomitanza con colorazione anticorpo cocktail, macchia ogni controllo di compensazione con un solo fluorocromo coniugato anticorpo. Idealmente, colorazione compensazione comporta gli stessi anticorpi utilizzati nel cocktail di anticorpi. Tuttavia, colorazione per ciascun antigene specifico non può essere fattibile per grandi esperimenti quando molti antigeni sono stati dosati. Pertanto, sia per colorazione anti-CD4 e anti-CD8 è raccomandato per l'alta espressione di questi antigeni, o l'uso di perline di compensazione. Macchia in tampone FACS per 30 min in ghiaccio, al buio. Lascia un controllo di compensazione senza macchia.
7. Lavare le cellule due volte con tampone FACS.
8. Risospendere le cellule in tampone FACS e trasferimento tubi FACS.
9. Acquisire campioni su citofluorimetro. Include l'acquisizione di FSC-A e FSC-W a unallow di discriminazione doppietto.

4. Analisi dei dati Citometria a flusso - non TCR topi transgenici

Usiamo FlowJo per citometria a flusso l'analisi dei dati. Fare riferimento alla Figura 2A per la strategia di gating per i non-TCR topi transgenici.

1. Utilizzo di FSC-A da SSC, cancello elettronico sulla popolazione "linfociti".
2. All'interno della popolazione "linfociti", utilizzare FSC-A da FSC-W per via elettronica porta del FSC-W popolazione ^lo escludere doppietti cellulari e aggregrates. Questa è la porta "singoletto".
3. Con gli eventi del cancello "singoletto", la trama da CD4 CD8. Disegna cancelli per DN, DP ^sordo, DP ^luminoso, CD4 ⁺ CD8 popolazioni ^ecco, CD4SP e CD8SP come illustrato nella figura 2B.
4. Sotto le porte CD4SP e CD8SP, creare TCRβ da CD24 trame. Utilizzare lo strumento gating quadrante per disegnare cancelli come illustrato in Figura 2C.
5. Creare una new trama dal cancello "singoletto": TCRβ da CD69. Disegnare porte A, B, C, D, come illustrato nella Figura 2D.
6. Creare un altro grafico dal cancello "singoletto": TCRβ da CD5. Disegnare porte I, II, III, IV come illustrato nella Figura 2E. Questa è un'altra strategia per l'esame di selezione positiva.
7. Applicare DN, DP ^sordo, DP ^{luminoso, int} CD4, CD4SP e CD8SP porte da sotto "singoletto" ai cancelli i, ii, iii, iv, A, B, C, D (Figura 2D, E).
8. Calcolare il numero di cellule in un particolare sottoinsieme moltiplicando cellularità organo per la frequenza di ogni porta successiva fino a raggiungere la popolazione target. Per esempio, il numero di TCRβ ^hi-CD69 CD8SP timociti sarebbe determinata dal timo cellularità x% TCR BHI-CD69 (frazione D) x CD8SP%.
   1. Conteggio tiene già conto delle cellule vive e morte in modo da non includere il "lymphocYTE "porta nei calcoli.

5. Analisi dei dati Citometria a flusso - TCR topi transgenici

Fare riferimento alla Figura 3A per la strategia di gating per TCR topi transgenici.

1. Seguire i punti 4.1 e 4.2, come nella sezione precedente.
2. Sotto il cancello "singoletto", creare un T3.70 dalla trama SSC e cancello sul T3.70 ⁺ popolazione cellulare per analizzare antigene-specifiche cellule T (Figura 3B). In alcune circostanze, può essere interessante confrontare questa popolazione alla non-antigene specifico (T3.70) popolazione delle cellule T.
3. All'interno della popolazione T3.70 ^+, disegnare DN, DP, CD4SP e CD8SP porte (Figura 3C).
   1. Per i campioni di controllo WT, disegnare questi cancelli sotto la porta "singoletto" o creare un T3.70-gate come ci saranno pochissimi T3.70 ⁺ cellule.
4. Sotto il cancello CD8SP, creare unT3.70 da CD24 trama. Utilizzare lo strumento di gating quadrante per dividere le celle in quattro popolazioni (Figura 3F).
5. Creare un istogramma sovrapposto raffigurante CD69 espressione nel vano DP di topi WT e T3.70 ⁺ vano DP di ^CD4 HY topi (Figura 4A). Ripetere esaminare CD5 espressione (Figura 4B).
6. Calcolare il numero assoluto di cellule in ciascun sottoinsieme di interesse come in 4,8.

Risultati

In fisiologiche TCR modelli transgenici e topi WT, selezione positiva inizia nella fase DP ^luminoso prima di passare alla fase di DP ^opaca dopo l'incontro di antigene. Timociti DP ^opaco quindi inserire una transizione CD4 ⁺ CD8 ^lo stadio prima di diventare CD4SP o timociti CD8SP (Figura 2B). Timociti maturi SP sono caratterizzati da elevata espressione TCR e perdita di CD24 (Figura 2C). Mentre il CD8 da CD4 profilo può rivelare...

Discussione

Il protocollo qui presentato può essere utilizzato per esaminare selezione positiva e negativa in non-transgenici TCR e TCR topi transgenici. Questo protocollo descrive la colorazione degli antigeni di superficie. Per un'ulteriore analisi dei meccanismi molecolari, è spesso necessario eseguire la colorazione intracellulare. Usiamo il BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit per la maggior parte delle proteine ​​intracellulari e la Foxp3 BD Biosciences Kit di colorazione per fattori di trascrizione. Noi di solito ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Sale HyClone Hank soluzione equilibrata	Thermo Scientific	SH30030.02
Rete metallica schermi	Cedarlane	CX-0080-E-01
Piastre di Petri (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	877221
Siringhe (3 ml)	BD Biosciences	309657
Provette coniche (15 ml)	Sarstedt	62.554.205
Microscopio	Zeiss - Primo Star	415500-00XX-000
Emocitometro	HausserScientifico	3110
Piastra a 96 pozzetti	Sarstedt	82.1582.001
Pipetta multicanale	FISHERBRAND	21-377-829
Siero fetale di vitello	PAA	A15-701
Tampone fosfato salino	Fisher Scientific	SH3025802
Sodio azide	IT Baker Chemical Co.	V015-05
FcR reagente bloccante			Clone 2.4G2
Anti-mouse HY TCR	eBioscience	XX-9930-AA *	Clone T3.70
Anti-topo CD4	eBioscience	XX-0042-AA *	Clone RM4-5
Lanti-mouse CD8α	eBioscience	XX-0081-AA *	Clone 53-6,7
Anti-topo CD24	eBioscience	XX-0242-AA *	Clone M1/69
Anti-mouse TCRβ	eBioscience	XX-5961-AA *	Clone H57-597
Anti-topo CD69 Biotinylated	eBioscience	13-0691-AA *	Clone H1.2F3
Anti-mouse CD5 Biotinylated	eBioscience	13-0051-AA *	Clone 53-7,3
Streptavidina	eBioscience	XX-4217-AA *
Citometro di flusso	BD Biosciences - FACS Canto	338962
FACS tubi	BD Biosciences	352052
Citometria di flusso software di analisi	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7 / 9
HyClone RPMI - 1640	Thermo Scientific	SH30027.01
			* Varia da XX e YY fluorocromo varia per grandezza flaconcino.