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요약

우리는 T 세포 개발을 검토 할 수있는 흐름 세포 계측법 기반 방법을 제시 생체 내 wildtype 또는 T 세포 수용체 유전자 변형 배경에 유전자 조작 쥐를 사용합니다.

초록

건강한 면역 체계가 자기 항원에 허용 남아있는 동안 T 세포가 외국 항원에 반응해야합니다. T 세포 수용체 (TCR) α와 β loci의 무작위 다시 정리하기는 자신과 외국에 모두 항원 특이성의 광대 한 다양성과 T 세포 레퍼토리를 생성합니다. thymus에서 개발 중에 레퍼토리의 선택은 안전하고 유용한 T 세포를 생성 중요합니다. thymic 선택에 결함이 면역과 면역 결핍 장애 1-4의 발전에 기여하고 있습니다.

T 세포 progenitors은 CD4 또는 CD8 공동 수용체를 표현하지 않는 2 중 부정 (DN) thymocytes로 thymus를 입력합니다. αβTCR하고 두 공동 수용체의 표현은 '더블 긍정적 (DP) 단계에서 발생합니다. 자기 펩타이드-MHC (pMHC) thymic 세포에서 제공과 αβTCR의 상호 작용은 DP의 thymocyte의 운명을 결정합니다. 높은 연관성 상호 작용은 부정적인 선택과 elimina로 연결자기 반응성 thymocytes의 기. CD4 또는 자기 MHC (5)에 의해 제시 외국 항원을 인식 할 수 CD8 하나의 긍정적 인 (SP) T 세포의 긍정적 인 선택과 개발에 낮은 친화 상호 작용 결과.

긍정적 인 선택은 성숙 T 세포의 생성을 관찰하여 polyclonal (wildtype) TCR의 레퍼토리와 마우스에서 공부 할 수 있습니다. 그러나, 작은 항원 특정 인구의 삭제를 포함 부정적인 선택의 연구에 적합하지 않습니다. 대부분의 모델 시스템은 부정적인 선택을 공부하지만, 생리 이벤트에게 6 요점을 되풀이하는 능력에 따라 다를하는 데 사용되었습니다. 외인성 항원의 행정 thymocytes 7-9의 비 특정 삭제 될 수 있습니다 예를 들어, thymocytes의 체외 자극에 깊은 선택에 관여 thymic 환경을 부족합니다. 현재 생체 부정적인 선택에서 공부에 가장 적합한 도구 transg을 표현할 마우스 아르자기 항원 내생에 enic TCR의 특정. 그러나 많은 고전 TCR 유전자 변형 모델은 조기 부정적인 선택의 결과로, DN 단계에서 유전자 변형 TCRα 체인의 조기 표현을 특징으로하고 있습니다. 우리 연구소는 10 wildtype 마우스에서 발생하는 부정적인 선택 SP 전환에 DP 동안 발생 할 수 있습니다 유전자 변형 HY TCRα이 조건 DP 단계에서 표현되는 HY의 CD4 모델을 개발했습니다.

여기, 우리는 HY의 CD4 마우스 모델에서 thymic 긍정적이고 부정적인 선택을 검토 할 수있는 흐름 세포 계측법 기반의 프로토콜을 설명합니다. HY의 CD4 마우스의 부정적인 선택이 매우 생리이지만,이 방법은 다른 TCR 유전자 변형 모델에도 적용 할 수 있습니다. 우리는 또한 유전자 조작 마우스에 적용 polyclonal 레퍼토리에 긍정적 인 선택을 분석하는 일반적인 전략을 제시합니다.

프로토콜

실험 프로토콜의 전반적인 구조에 대해 1 그림을 참조하십시오.

1. 해부

  1. 60 X 15mm 페트리 접시에 장소 무균 스틸 메쉬 화면. 하나의 단위 조직 샘플 당이 필요합니다.
  2. 각 요리에 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 5 ML을 추가합니다. 얼음 요리세요.
  3. CO 2와 쥐를 안락사시켜야.
  4. 분해 표면에 보안 마우스, 최대 직면하고 복부 쪽. 살균에 대한 70 %의 에탄올과 및 모피는 아래 헝클어되어 있는지 확인하는 스프레이 마우스.
  5. 수술 가위를 사용, 그냥 성기 위의 복부 피부에 복부​​ 절개를하여 절개를 시작합니다. 턱에 절개 위쪽을 연장합니다.
  6. 중간 선에서 모든 다리를 따라 절개를 확장합니다. 느슨한 피부를 당겨하고 분해 표면에 내려 핀.
  7. thymus를 수확 :
    1. 절개을 할 수있는 흉골의 하단 끝을 들어 봐요.
    2. 간을 피 갈비를 분리하고 각 측면에 갈비를 절감 가로막을 잘라. 폐와 심장을 피하기 위해 관리하고, 각 쪽의 흉곽 위쪽으로 자른다.
    3. 흉곽을 다시 집게로 부드럽게 당긴다. thymus은 심장 위에있는 흰색 bilobed 기관이다. 엽 (叶)의 하단을 파악하기 위해 포셉의 평면 가장자리를 사용하여 부드럽게 thymus을 뽑아 메쉬 화면에 배치.
  8. 비장을 수확 :
    1. 비장은 간 아래에있는 마우스의 복강의 왼쪽에있는 빨간색 서핑 보드 모양의 기관이다.
    2. 복강에 절개를합니다. 부드럽게 결합 조직을 멀리 감히 두 번째 쌍을 사용 포셉 한 쌍의와 함께 비장을 당겨. 별도의 메쉬 화면에서 비장를 놓습니다.

2. 셀 준비

  1. 3 ML의 주사기에서 플런저를 사용하여 분쇄만 결합 조직과 지방 유적까지 메쉬 화면에 기관. 요리의 HBSS 세 번으로 메쉬를 씻어. 각 조직 샘플에 대한 새로운 플런저를 사용하십시오.
    1. 조직을 homogenizing에 대한 다른 옵션은이 방법 대신 사용할 수 있습니다.
  2. hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다.
  3. 335에서 원심 분리하여 펠렛 세포는 4 ° C.에 5 분을 위해 XG
  4. 실온에서 10 분을위한 ACK 용해 버퍼 500 μl (0.15 M NH 4 CIA 같으니, 10 MM KHC0 3, 0.1 MM 그렇단이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.2)에 Resuspend splenocytes. 20 Resuspend thymocytes는 x 10 6 세포 / FACS 버퍼에 ML (PBS, 1 % FCS, 0.02 % 나트륨 azide)과 얼음에 둔다.
  5. HBSS의 5 ML을 추가하여 isotonicity에 splenocytes을 반환합니다. 펠렛의 20 원심 분리 및 resuspend로 splenocytes X 10 6 세포 / FACS 버퍼에 ML. 세포가 무균 상태로 유지해야하는 경우, 당신은 무균 RPMI + 10% FCS를 사용할 수 있습니다.

3.유동 세포 계측법에 얼룩 세포

이 프로토콜의 목적은 wildtype (WT)와 HY의 CD4 마우스를 사용하여 긍정적이고 부정적인 선택의 분석을위한 전략을 설명하는 것입니다. 유동 세포 계측법 실험 설계, 획득, 분석에 대한 일반적인 고려 사항의 경우, 우리는 퉁 외하여 우수 리뷰에 독자 참조하십시오. 11

  1. 나누어지는 4 X 10 96 - 웰 플레이트의 각 잘에 유동 세포 계측법 샘플 당 6 thymocytes뿐만 아니라 보상 제어 당 1 × 10 6 WT splenocytes. 유전자 변형 마우스를 사용하는 경우, 당신은 실험에 컨트롤로 WT 마우스를 포함해야합니다.
  2. 얼음에 10 분에 anti-CD16/32 (클론 2.4G2)로 세포를 잠복기가 FC 수용체를 차단합니다.
  3. 5 분에 대해 4 ° C에서 335 XG에서 판을 봐. 뚜껑을 제거하고 한 번 판을 flicking하여 우물에서 액체를 풀다, 세면대에 얼굴을 아래로. FACS 버퍼 200 μl의 각 우물을 Resuspend. 세탁을 반복합니다.
  4. 아래에 나열된뿐만 당 FACS 버퍼 200 μl에 희석를 기준으로하여 각 항체의 최적 농도를 사용하여 항체 칵테일을 준비합니다. 각 항체의 최적 농도는 긍정적이고 부정적인 인구의 가장 큰 분리를 제공하는 데 필요한 최저 농도로 정의됩니다. 특정 항체에 대한 부정적인 인구가없는 경우, isotype 항체가 포함되어야합니다. 원하는 경우도 당 총 볼륨이 (물론 당 100 μl로 등)를 줄일 수 있습니다.
    1. WT thymus : 안티 - TCRβ, 안티 CD4, 항 CD8, 항 CD69 또는 안티 CD5, 항 CD24
    2. thymus HY의 CD4 : 안티 - HY TCR (T3.70), 안티 - CD4, 항 CD8, 항 CD69 또는 안티 CD5, 항 CD24
      CD69 ro와 thymocytes에서 CD69 하이 인구의 더 나은 분리를 얻으려면, 그것은 다음, biotinylated 방지 CD69 주요 항체를 사용하는 것이 좋습니다 보조 fluorochrome - 복합 streptavidin을 포함하는 얼룩. 우리는 UCD5 착색에 대한 SE 같은 전략.
  5. 어둠 속에서 얼음에 30 분을위한 FACS 버퍼의 항체 칵테일 200 μl로 세포를 배양.
  6. 항체 칵테일 착색이 동시에, 하나의 fluorochrome - 복합 항체 각 보상 제어를 얼룩. 이상적으로, 보상 착색은 항체 칵테일에 사용되는 것과 같은 항체을 포함한다. 많은 항원이 assayed되고 나면 그러나, 각각의 항원에 대한 얼룩은 큰 실험에 대한 가능한하지 않을 수 있습니다. 따라서, 항 CD4 또는 안티 CD8 중에 얼룩은 높은 이들 항원의 표현, 또는 보상 비즈의 사용으로 인해 권장합니다. 어둠 속에서 얼음에 30 분을위한 FACS 버퍼에 청바지. 한 보상 제어 흠없는 둡니다.
  7. FACS 버퍼로 두 번 세포를 씻으십시오.
  8. FACS 버퍼와 FACS 튜브로 전송에 Resuspend 세포.
  9. 흐름 cytometer에 샘플을 수집. FSC-A의 수집 및에 FSC-W 포함이중 어 차별에 대한 llow.

4. 유동 세포 계측법 데이터 분석 - 비 TCR 트렌스 제닉 마우스

우리는 유동 세포 계측법 데이터 분석을 위해 FlowJo를 사용합니다. 비 TCR 유전자 변형 마우스의 게이팅 전략에 대한 2A 그림을 참조하십시오.

  1. SSC의 "림프구"인구에 전자 게이트에서 FSC-A를 사용합니다.
  2. "림프구"인구 내에서, 세포 doublets 및 aggregrates을 제외 할 전자 게이트 FSC-W 그냥 ... 인구에 FSC-W에 의해 FSC-A를 사용합니다. 이렇게하면 "중항"문입니다.
  3. "중항"게이트, CD4의 줄거리 CD8의 이벤트를 사용합니다. DN, DP 지루, DP 밝은에 문을 그려, CD4 그림 2B에 묘사 된대로 + CD8 이오, CD4SP 및 CD8SP 인구.
  4. CD4SP 및 CD8SP 문에서 CD24 플롯에 의해 TCRβ을 만듭니다. 그림 2C에 도시로 문을 끌기 위해 사분면의 게이팅 도구를 사용합니다.
  5. NE를 만듭니다CD69의 TCRβ : "중항"게이트에서 w의 줄거리. 문 A, B, C, D 그림 2D에 도시.을 그립니다
  6. CD5에 의해 TCRβ : "중항"게이트에서 다른 음모를 만듭니다. 그림 2E에 묘사 된대로 문 I, II, III, IV을 그립니다.이 긍정적 인 선택을 검토의 또 다른 전략이다.
  7. 문 I, II, III, IV, A, B, C, D (그림 2D, E)에 '중항 "아래에서 DN, DP 지루, DP 밝고 CD4의 정수, CD4SP 및 CD8SP 문을 적용합니다.
  8. 귀하의 대상 인구에 도달 할 때까지 이후의 각 게이트의 주파수에 의해 오르간 cellularity를​​ 곱하여 특정 하위 집합에있는 셀의 개수를 계산할 수 있습니다. 예를 들어, TCRβ 하이 CD69-CD8SP의 thymocytes의 수는 thymus cellularity X % TCR bhi에 의해 결정됩니다 CD69-(일부 D) X %의 CD8SP.
    1. 계산은 이미 라이브와 죽은 세포가 그렇게 'lymphoc을 포함하지 않는 고려귀하의 계산 yte "게이트.

5. 유동 세포 계측법 데이터의 분석 - TCR 트렌스 제닉 마우스

TCR 유전자 변형 마우스의 게이팅 전략에 대한 3A 그림을 참조하십시오.

  1. 단계 이전 섹션에서와 같이 4.1 및 4.2을 따르십시오.
  2. "중항"게이트에서 T3.70의 SSC 계획 및 게이트에 의해 T3.70을 만들 + 세포 인구를 항원 특정 T 세포 (그림 3B) 분석 할 수 있습니다. 일부 환경에서는 비 항원 특정 (T3.70-) T 세포의 인구에이 인구를 비교할 관심이있을 것으로 생각됩니다.
  3. 내 T3.70 + 인구, 추첨 DN, DP, CD4SP 및 CD8SP 문 (그림 3C).
    1. 거의 T3.70 + 세포가있을 것 같은 WT 제어 샘플에 대해 "중항"게이트에서이 문을 그리거나 T3.70의 문을 만듭니다.
  4. CD8SP 게이트에서을 만들CD24 플롯으로 T3.70. 네 인구 (그림 3 층)에 셀을 분할 할 사분면의 게이팅 도구를 사용합니다.
  5. WT 마우스와 HY의 CD4 마우스의 T3.70 + DP 구획 (그림 4A)의 DP 구획에서 CD69 표현을 묘사 겹쳐 히스토그램을 생성합니다. CD5 표현 (그림 4B)을 검사 반복합니다.
  6. 4.8에서와 같이 관심의 각 하위 집합에있는 셀의 절대 수를 계산합니다.

결과

생리 TCR 유전자 변형 모델 및 WT 생쥐에서 긍정적 인 선택 항원 만남 후 DP 지루 무대로 이동하기 전에 DP 밝은 단계에서 시작됩니다. DP 무딘 thymocytes는 CD4SP 또는 CD8SP의 thymocytes (그림 2B)가되기 전에 과도기적 CD4 + CD8에게 이오 단계를 입력합니다. 성숙 SP의 thymocytes은 높은 TCR의 표현과 CD24 (그림 2C)의 손실을 특징으로하고 있습니다. ...

토론

여기에 제시된 프로토콜은 비 TCR 유전자 변형과 TCR 유전자 변형 마우스의 양수와 음수 선택을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표면 항원의 착색에 대해 설명합니다. 분자 메커니즘의 추가 분석을 위해, 그것은 종종 세포 염색법을 수행 할 필요가 있습니다. 우리는 전사 인자 대부분의 세포 내 단백질과 BD Biosciences의 Foxp3의 얼룩 키트의 BD Biosciences Cytofix / Cytoperm 키트를 사용합니다...

공개

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 말

저자는 자신의 기술 지원을 빙 장을 감사드립니다. 이 작품은 건강 연구 (걸레-86595)에 대한 캐나다 연구소에 의해 자금을 지원했다. TAB는 CIHR 새로운 탐정과 AHFMR 학술 수 있습니다. 박사와 AIHS 풀 타임 학생이기 - QH는 CIHR 캐나다 대학원 장학금으로 지원됩니다. SAN은 퀸 엘리자베스 II 대학원 장학금으로 지원됩니다. 박사 - AYWS는 NSERC 대학원 장학금으로 지원된다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트 (선택 사항)
HyClone 행크의 균형 소금 솔루션 열 과학 SH30030.02
금속 메쉬 화면 Cedarlane CX-0080-E-01
배양 접시 (60 X 15mm) 피셔 과학 877221
주사기 (3 ML) BD Biosciences 309657
원추형 튜브 (15 ML) Sarstedt 62.554.205
현미경 Zeiss - 프리모 스타 415500-00XX-000
Hemocytometer Hausser과학적인 3110
96 - 웰 플레이트 Sarstedt 82.1582.001
멀티 채널 피펫 Fisherbrand 21-377-829
태아 송아지 혈청 PAA A15-701
인산염은 염분 버퍼 피셔 과학 SH3025802
나트륨 azide IT 베이커 화학 (주) V015-05
FcR 차단 시약 복제 2.4G2
안티 - 마우스 HY TCR eBioscience XX-9930-YY의 * 복제 T3.70
안티 - 마우스 CD4 eBioscience XX-0042-YY의 * 복제 RM4-5
nti 마우스 CD8α eBioscience XX-0081-YY의 * 복제 53-6.7
안티 - 마우스 CD24 eBioscience XX-0242-YY의 * 복제 M1/69
안티 - 마우스 TCRβ eBioscience XX-5961-YY의 * 복제 H57-597
안티 - 마우스 CD69는 Biotinylated eBioscience 13-0691-YY * 복제 H1.2F3
안티 - 마우스 CD5는 Biotinylated eBioscience 13-0051-YY * 복제 53-7.3
Streptavidin eBioscience XX-4217-YY의 *
흐름 cytometer BD Biosciences - FACS 캔토 338962
FACS 튜브 BD Biosciences 352052
유동 세포 계측법 분석 소프트웨어 TreeStar - Flowjo FlowJo V7 / 9
HyClone RPMI - 1640 미디어 열 과학 SH30027.01

fluorochrome와 YY는 유리 병의 크기에 따라 다릅니다에 의해 * XX는 다릅니다.

참고문헌

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