Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Resumen

Se describe un procedimiento para la manipulación de la actividad de las neuronas piramidales corticales cerebrales optogenetically mientras que el electroencefalograma, electromiograma, y ​​la concentración de lactato cerebral son monitoreados. Grabaciones experimentales se realizaron en ratones de cable-atados mientras se someten espontáneas de sueño / vigilia ciclos. Optogenético equipo es ensamblado en nuestro laboratorio; aparato de control está disponible comercialmente.

Resumen

Aunque el cerebro representa menos del 5% del cuerpo en masa, utiliza aproximadamente un cuarto de la glucosa utilizada por el cuerpo en reposo ^1. La función del sueño no REM (NREMS), la mayor parte de sueño por el tiempo, es incierto. Sin embargo, una característica sobresaliente de NREMS es una reducción significativa en la tasa de utilización de la glucosa cerebral relativo a la vigilia ^2-4. Esta y otras conclusiones han dado lugar a la creencia generalizada de que el sueño tiene una función relacionada con el metabolismo cerebral. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la reducción del metabolismo cerebral de la glucosa durante NREMS aún no se han dilucidado.

Un fenómeno asociado con NREMS que podrían afectar la tasa metabólica cerebral es la aparición de ondas lentas, oscilaciones en frecuencias de menos de 4 Hz, en el electroencefalograma ^5,6. Estas ondas lentas detectadas en el nivel de la superficie del cráneo o cortical cerebral reflejar laoscilaciones de las neuronas subyacentes entre un estado despolariza / arriba y un estado hiperpolarizado / abajo ^7. Durante el estado de abajo, las células no se someten a los potenciales de acción para los intervalos de hasta varios milisegundos cien. Restauración de los gradientes de concentración iónica posteriores a los potenciales de acción representa una carga significativa metabólico de la célula ^8; ausencia de potenciales de acción durante los estados asociados a abajo NREMS pueden contribuir al metabolismo reducido en relación a despertar.

Dos retos técnicos que había que abordar para que esta relación hipotética a probar. En primer lugar, era necesario para medir el metabolismo glicolítico cerebral con una resolución temporal reflectante de la dinámica de la cerebral EEG (es decir, más de segundos en lugar de minutos). Para ello, se midió la concentración de lactato, el producto de la glicolisis aerobia, y por lo tanto, una lectura de la tasa de metabolismo de la glucosa en el cerebro de los ratones. El lactato fuemedido usando un sensor basado en lactato oxidasa tiempo real incorporado en la corteza frontal. El mecanismo de detección consta de un electrodo de platino-iridio, rodeado por una capa de moléculas de lactato oxidasa. Metabolismo de lactato por la lactato oxidasa produce peróxido de hidrógeno, que produce una corriente en el electrodo de platino-iridio. Así, un aumento gradual de la glucólisis cerebral proporciona un aumento en la concentración de sustrato para la lactato oxidasa, que a continuación se refleja en corriente aumentó en el electrodo sensor. Era necesario adicionalmente para medir estas variables, mientras que la manipulación de la excitabilidad de la corteza cerebral, a fin de aislar esta variable a partir de otras facetas de NREMS.

Hemos ideado un sistema experimental para la medición simultánea de la actividad neuronal a través de la elecetroencephalogram, medición de flujo glucolítico a través de un biosensor de lactato, y la manipulación de la actividad cerebral neuronal cortical través de la activación de optogenético PyraMIDAL neuronas. Hemos utilizado este sistema para documentar la relación entre el sueño relacionado con formas de onda electroencefalográfica y la dinámica de momento a momento de la concentración de lactato en la corteza cerebral. El protocolo puede ser útil para cualquier individuo interesado en estudiar, comportarse libremente en roedores, la relación entre la actividad neuronal medida a nivel electroencefalográfico y la energética celular en el cerebro.

Protocolo

1. Preparación quirúrgica de Animales

1. Los sujetos experimentales

Utilice ratones de la B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J línea transgénica ^9; tensión JAX # 7612) o los otros ratones que expresan el azul crepuscular canal catiónico, canalrodopsina-2, en las neuronas corticales cerebrales. La aplicación de luz azul a la corteza cerebral de la B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J línea transgénica provoca que las neuronas piramidales que expresan canalrodopsina-2 para despolarizar y se someten a los potenciales de acción ^9,10. Como consecuencia de la activación de células piramidales, interneuronas locales se activan, y el cambio en el potencial se propaga a las neuronas más allá del sitio de estimulación ^10. Realizar cirugía en condiciones estériles en la adhesión a las directrices reguladoras aplicables: autoclave herramientas quirúrgicas y softpacks (campo quirúrgico, gasas); caliente cordón esterilizar todos tolerantes al calor implantados dispositivos metálicos (cánulas, tornillos y cables)por 30-segundos; Desinfectar calor intolerantes a los productos implantables (cable de fibra óptica conector de plástico) con un dip de 10 segundos en etanol; golpe de cruce de etanol artículos seca mediante la aplicación de aire comprimido.

2. Anestesia, colocación estereotáxica y Liquidación de cráneo

Utilice el IMPAC ⁶ Integrada Paciente Multi (Vet Equip Inc) sistema para anestesiar el ratón. Utilice un 5% Isoflurane/95% de oxígeno para la inducción y el oxígeno del 3% Isoflurane/97% para el mantenimiento durante la cirugía. Colocar el animal sobre una manta de circulación de agua ajustado a 37 º C. No es necesario controlar la temperatura del cuerpo si la manta se mantiene a esta temperatura.

3. Preparación de la Calavera de Implantación

Prepare el sitio de la incisión por el afeitado todo piel de la parte superior del cráneo. El área de afeitado debe extenderse lateralmente de oreja a oreja y antero-posterior de los ojos con el extremo posterior del cráneo. Desinfecte la piel expuesta con tres CONSECUTIVOSe hisopos de Betadine seguido por etanol. Hacer una incisión medial en la parte superior del cráneo, de entre los ojos a la parte posterior del cráneo. Limpiar el cráneo con peróxido de hidrógeno y solución salina estéril (0,9% NaCl). Controlar la hemorragia con una herramienta de cauterización. Localizar y marcar bregma y lambda para determinar las coordenadas estereotáxica. Las coordenadas estereotáxicas para las configuraciones de los electrodos de estímulo / optogenético que hemos utilizados se presentan en la Tabla 1 y se muestra esquemáticamente en la Figura 1A.

4. Preparación de los lugares de implantación en el cráneo

Use un taladro dental de alta velocidad con una bola de 0,5 mm bit fresa para establecer cada sitio de implantación en el cráneo. Bisele el borde externo de cada hoyo con una bola de 0,7 mm poco fresa para facilitar la inserción del tornillo.

5. Inserción y fijación de cánulas, EMG conduce y conduce EEG

Inserte los tornillos de EEG (0,8 mm de longitud, con 2 cm de 3 sin recubrimiento0-medidor de cobre estañado autobús alambre pre-soldado a la cabeza del tornillo) en los orificios y los llevan en una mano con un destornillador ranurado revoluciones aproximadamente 4-5 para obtener la profundidad deseada. Mantenga cánulas guía en su lugar con un soporte de cánula estereotáxico y luego péguelas en el cráneo y anclajes con cemento acrílico. Cada cánula guía debe contener un maniquí de cánula / estilete (Plastics One, parte # C312 DC \ 1) desde el momento de la cirugía para el tiempo de experimentación (10-14 días) para mantener la permeabilidad.

6. Cierre del sitio quirúrgico

Una vez que los EEG y cánulas de guía se coloca en el cráneo, unirlos juntos con cemento acrílico dental (Dental Lang - Ortho-Jet cemento). Después de fraguar el cemento, colocar el conector de plástico (parte Pinnacle Tecnología # 8402) por encima del montículo de cemento seco. Soldar los extremos de los cables procedentes de derivaciones de EEG para los contactos del conector de plástico. Encajar los conectores del cable en el cemento. A continuación, dibuje los cables de EMG a través del músculo nucals deslizándolas en el barril de una aguja 21gA perforado a través del músculo. Ate un nudo de cirujano doble sutura de nylon 5-0 alrededor de estos cables justo distal a donde sale el músculo. Sutura de nuevo juntos de la piel que se retrae para acceder al tejido muscular con un solo cirujano nudos interrumpidas, con un retroceso de corte P-3 y 5-0 aguja de sutura de nylon.

7. Analgesia postoperatoria y recuperación

Administrar buprenorfina como analgésico (0,1 mg / kg, subcutánea) y flunixina meglumina (0,1 mg / kg, subcutánea) como un anti-inflamatorio inmediatamente después de la cirugía, y diariamente en los días 1-2 después de la cirugía. Deje que los animales puedan recuperarse en condiciones estándar de colonias de vivienda durante al menos siete días antes de la experimentación. Con ninguna atención adicional más allá de la vivienda de colonias estándar, las cánulas se puede esperar que permanecen patente durante al menos dos semanas, con los estiletes permanentes asegurado en su lugar. Sensores EEG y EMG también se puede esperar que retenerfuncionalidad de esta duración.

2. Generación de Pulsos de luz temporizado

1. Programación de la Unidad de Estímulo MC

Conecte la unidad MC-estímulo (Multi-Channel Systems) a través de una conexión USB a una computadora de escritorio. Utilice la hoja de cálculo similar a la interfaz de usuario MC-Estímulo para programar la unidad de Estímulo MC. Introduce el deseado TTL (lógica transistor-transistor) de tensión para el periodo en adelante, las duraciones de estímulo y fuera de períodos, el número de ciclos por segundo deseados, y el número total de ciclos repetidos para la sesión de estímulo entero. Para más detalles, véase el MC-Estímulo manual técnico:

3. Fabricación / Montaje de Fibra Óptica Probes para la prestación de Luz a la corteza cerebral

1. Suministros y equipos necesarios se encuentran en: http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
2. Corte y pulido de los cables de fibra óptica. http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf

4. Asamblea del Sistema de Estimulación roedores optogenético

1. Interfaz de unidad MC-Estímulo y Laser

Una vez que la unidad MC-estímulo está programado, correr como un generador de señal independiente de un sistema binario de 5 voltios ON / OFF de la señal. Conecte la unidad MC-Estímulo a la unidad de potencia TTL enabled del láser con conectores BNC.

2. Producción de la salida láser a través de cable de fibra óptica

Utilice la pantalla digital y el dial variable de la potencia de salida de la unidad de potencia del láser en el manualLy ajustar la potencia de salida del láser. Conectar la unidad de potencia del láser en el láser a través de un cable de cinta. Conectar el conector hembra FC (férula de conector) adaptador de fibra del láser para el conector macho de FC en el cable de conexión de fibra óptica (una longitud de 3 m, 200 m de diámetro de fibra de vidrio recubierto de conducción en la luz que refleja acrilato de revestimiento de polímero).

3. Transmitir el láser para el animal: Conmutador giratorio

Conectar el cable de fibra óptica originario (3 m de longitud) y el cable de fibra óptica de entrega (45 cm de longitud) a los extremos opuestos de la junta óptica giratoria que encierra dos lentes (lentes de colimación dóricas). La fibra óptica de la junta rotativa sirve como un conmutador: como el animal se mueve alrededor de su jaula, la junta giratoria gira para evitar la rotura de los cables de fibra óptica. Use lazos de cable de plástico para fijar el conmutador, a un soporte metálico colocado por encima de la jaula cilíndrica en la que se aloja el animal.

4. Colocación de Entrega de fibra ópticaCable de Enfrentamientos

Prohibir al ratón con una sola mano a la clavija del ratón debajo de una palma ahuecada. Oriente la cabeza entre medio del experimentador y el dedo índice. Extraer la cánula de maniquí de la cánula guía colocada por la cánula de fibra óptica. Desactive la cánula guía de escombros con una aguja estéril 25GA. Inserte el cable de fibra óptica a mano y fijarlo a la cánula de fibra óptica de guía con una tapa roscada rescatado de una cánula maniquí. Controlar la profundidad de inserción del cable de fibra óptica en el cerebro mediante un nudo de sutura atada en el cable de fibra óptica a una distancia fija desde el extremo plano-troceados. El aparato experimental entera se muestra en la Figura 1B.

5. Medición del EEG del sueño definido y la concentración de lactato durante la estimulación optogenético

1. Precalibración del sensor de lactato

Pre-calibración del sensor de lactato se realiza con un in vitrokit (parte Pinnacle Tecnología # 7000-K1-T). El sensor se equilibra en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4), luego se expuso a tres concentraciones de L-lactato de manera escalonada por los protocolos del fabricante.

2. La inserción del sensor de lactato y el cable EEG

Insertar el sensor de pre-calibrada en el cráneo montado en la cánula guía de lactato de una manera idéntica a la fibra óptica procedimiento de inserción de cable (sección 4,4). Conecte el sensor de lactato al preamplificador del Pinnacle 8.400 biosensor con conectores bipolares. Conecte este preamplificador en el conector de 8-pin en el headmount implantado quirúrgicamente.

3. El establecimiento de la intensidad del estímulo optogenético

Antes de recoger los datos, usar la intensidad del láser mando de control para ajustar la intensidad del estímulo optogenético. La amplitud de la respuesta del EEG varía en los animales, debido a factores que no se han estudiado de forma sistemática, una d debe ser verificada mediante inspección visual en el inicio de la estimulación. En la práctica, una intensidad de 80-120 μWatts típicamente producirá un incremento en la amplitud EEG de aproximadamente 50% en la frecuencia de estimulación. Post-hoc rápido análisis de Fourier de transformación (ver sección 5.5) es necesario cuantificar la magnitud absoluta de la respuesta.

4. Recopilación de datos

Recopilar datos utilizando el sistema Pinnacle 8400: http://pinnaclet.com/pal-8400.html .

5. Procesamiento de Datos con Neuroscore

Clasificar los estados de suspensión por inspección visual de los datos de EEG y EMG con la interfaz Neuroscore (DataSciences, International: http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp ) o la interfaz de Sirenia (Pinnacle Technology:f = "http://www.pinnaclet.com/sirenia.html" target = "_blank"> http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). Los datos de proceso en diez segundos épocas como consecuencia, no rápido movimiento de los ojos de sueño, o sueño de movimientos oculares rápidos basados ​​en el EEG y EMG. Guardar datos en hojas de cálculo Microsoft Excel para análisis adicional y pruebas estadísticas.

Resultados

Como se muestra en la Figura 2, un ratón que disponga para la estimulación optogenético y lactato / EEG / EMG colección de datos se sometieron espontáneas de sueño / vigilia transiciones de estado mientras EEG, EMG y la concentración de lactato cerebral fueron monitoreados continuamente. Actual en el sensor de lactato se incrementó durante los períodos de baja amplitud EEG y disminuyó durante los períodos de alta amplitud EEG. Como se muestra en la Figura 3,

Discusión

Los métodos aquí presentados permiten medir la relación entre el sueño y los cambios en la concentración cerebral de la lactato intermediario glicolítico en una escala de tiempo no era posible anteriormente. Los animales experimentan transiciones espontáneas entre vigilia, NREMS y REMS. Además, estamos en condiciones de aplicar estímulos optogenético mientras que los animales se someten a estas transiciones. Los datos recogidos hasta la fecha demuestran que las ondas de impacto tanto espontánea e inducida en ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Componente	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Basi Ratón cánula guía	Pinnacle Tecnología / Inc Basi	7032
Biosensor de lactato	Pinnacle Tecnología	7004
Montado en el cabezal	Pinnacle Tecnología	8402
Sleep / Sistema de grabación Biosensor	Pinnacle Tecnología	8400-K1-SL	2 canales de EEG, EMG canal 1, y biosensor 1
Ratón Tethered in vitro kit de calibración	Pinnacle Tecnología	7000-K1-T
Fibra óptica cánula guía	Plastics One	C312G	21 Medidor de guía para cánula
Cánula Maniquí	Plastics One	C312DC	21 Gauge Maniquí
Diamond Scribe fibra	Thorlabs	S90W
Conector de fibra Crimp Tool	Thorlabs	CT042
Bifurcación tubo	Thorlabs	FT030	03,0 mm
	Thorlabs	T10S13	Max Dia. 0,012
Bifurcación Stripper Tube	Thorlabs	FTS3
La fibra multimodo Bare Revestimiento Duro	Thorlabs	BFL37-200	200 micras Core, 0,37 NA
Alambre Tijeras / Tijeras de Kevlar	Thorlabs	T865
Epoxy de fibra óptica	Thorlabs	F112
Fibra de herramientas Stripper	Thorlabs
Placa de cristal pulido	Thorlabs	CTG913
Pulido Pad Rubber	Thorlabs	NRS913
Ojo de lupa	Thorlabs	JEL10
Kim Wipes	Thorlabs	KW32
Aire comprimido	Thorlabs	CA3
Pulido Puck	Thorlabs	D50-xx
Fibra alcance de Inspección	Thorlabs	CL-200
Películas de pulir	Thorlabs	LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P
FC / PC conector del extremo	Thorlabs	30126G2-240	Diámetro 240 m, SS virola
MC Unidad Estímulo	Sistemas multicanal	STG-4002
MC Software Estímulo	Sistemas multicanal	MC-Estímulo V 2.1.5
Láser azul	CrystaLaser	CL473-050-0
Laser Fuente de alimentación	CrystaLaser	CL2005
Fiber Optic junta rotativa	Lentes dóricas	FRJ-v4
			Tabla 2. Suministros y equipo.