Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

Zusammenfassung

Es wird ein Verfahren zur Manipulation der Aktivität der zerebralen kortikalen Pyramidenzellen optogenetically während das Elektroenzephalogramm, Elektromyogramm, und zerebrale Laktatkonzentration überwacht werden beschrieben. Experimentelle Aufnahmen werden auf Kabel-tethered Mäusen durchgeführt, während sie spontane Schlaf / Wach-Zyklen. Optogenetische Ausrüstung wird in unserem Labor zusammengebaut; Kontrollgerät ist kommerziell erhältlich.

Zusammenfassung

Obwohl das Gehirn macht weniger als 5% des Körpers Massenteile, nutzt sie etwa einem Viertel der Glucose durch den Körper in Ruhe ¹ verwendet. Die Funktion des non rapid eye movement sleep (NREMS), der größte Teil der Schlaf durch die Zeit, ist ungewiss. Allerdings ist ein herausragendes Merkmal der NREMS eine signifikante Reduktion der Rate der zerebralen Glucoseverwertungsstörungen relativ zu Wachheit ^2-4. Diese und andere Erkenntnisse haben zu der weit verbreiteten Meinung, dass der Schlaf eine Funktion im Zusammenhang mit zerebralen Metabolismus dient geführt. Dennoch bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen der Reduktion des zerebralen Glukosestoffwechsels während NREMS aufgeklärt werden.

Ein Phänomen, das mit NREMS zerebralen Stoffwechsel auswirken könnten einhergeht, ist das Auftreten der langsamen Wellen, Schwingungen mit Frequenzen von weniger als 4 Hz, im Elektroenzephalogramm ^5,6. Diese langsame Wellen auf der Ebene des Schädels oder zerebraler kortikalen Oberfläche detektiert spiegeln dieSchwingungen des zugrunde liegenden Neuronen zwischen einem depolarisiert / up Staat und einem hyperpolarisierten / down Zustand ^7. Während der ausgeschaltete Zustand, noch nicht erfahren Zellen Aktionspotentiale bei Intervallen von bis zu einigen hundert Millisekunden. Restaurierung von ionischen Konzentrationsgradienten im Anschluss an Aktionspotentiale stellt eine bedeutende metabolische Belastung der Zelle ^8, Fehlen von Aktionspotentialen während sich Staaten mit NREMS verbunden sein mit einem verminderten Metabolismus relativ zu wecken beitragen.

Zwei technische Herausforderungen mussten, damit diese hypothetische Beziehung zu testenden adressiert werden. Zuerst war es notwendig, cerebralen Metabolismus glykolytischen mit einer zeitlichen Auflösung reflektierenden der Dynamik des zerebralen EEG messen (das heißt über Sekunden statt Minuten). Dazu maßen wir die Konzentration von Lactat, das Produkt der aerobe Glycolyse und daher ein Auslesen der Geschwindigkeit des Glukosemetabolismus in den Gehirnen der Mäuse. Lactatgemessen mit einem Lactatoxidase basierte Echtzeit-Sensor im frontalen Kortex eingebettet. Der Sensormechanismus aus einem Platin-Iridium-Elektrode durch eine Schicht aus Lactatoxidase Moleküle umgeben. Metabolismus von Lactat von Lactatoxidase produziert Wasserstoffperoxid, die einen Strom erzeugt in der Platin-Iridium-Elektrode. So ein Hochfahren der zerebralen Glykolyse gibt einen Anstieg in der Konzentration des Substrats für Lactat-Oxidase, die dann in erhöhten Strom an der Meßelektrode reflektiert wird. Es war darüber hinaus notwendig, diese Variablen zu messen, während die Manipulation der Erregbarkeit der Hirnrinde, um diese Variable von anderen Facetten NREMS isolieren.

Wir entwickelten ein experimentelles System zur gleichzeitigen Messung der neuronalen Aktivität über den elecetroencephalogram, Messung der glykolytischen Fluss über einen Biosensor Lactat, und Manipulation von zerebralen Kortex neuronale Aktivität über optogenetische Aktivierung pyraMIDAL Neuronen. Wir haben dieses System genutzt werden, um die Beziehung zwischen Schlaf-bezogenen EEG-Wellenformen und die Moment-zu-Moment Dynamik der Laktat-Konzentration in der Großhirnrinde zu dokumentieren. Das Protokoll kann für jeden einzelnen an einem Studium Interesse nützlich, in frei verhalten Nagetiere, die Beziehung zwischen neuronaler Aktivität bei der zellulären Ebene und elektroenzephalographischen Energetik innerhalb des Gehirns gemessen.

Protokoll

Ein. Chirurgische Vorbereitung der Tiere

Ein. Experimentelle Fächer

Verwenden Mäuse der B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J transgenen Linie ^9; JAX Stamm # 7612) oder andere Mäuse Exprimieren des blauen lichtempfindlichen Kationenkanal, Channelrhodopsin-2, des zerebralen kortikalen Neuronen. Anwendung von blauem Licht zur Hirnrinde des B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J transgenen Linie bewirkt, dass die pyramidalen Neuronen exprimieren Channelrhodopsin-2 zu depolarisieren und dort einer Aktionspotentiale ^9,10. Als Folge der pyramidenförmigen Zellaktivierung werden lokale Interneuronen aktiviert, und der Änderung des Potentials an Neuronen ausserhalb des Stimulation ¹⁰ propagiert. Durchführung von Operationen unter sterilen Bedingungen unter Einhaltung der gültigen Richtlinien: Autoklaven chirurgische Werkzeuge und Softpacks (OP-Feld, Gaze-Pads), heiße Perle sterilisieren alle hitzeverträglich implantierten Metall-Geräte (Kanülen, Schrauben und Drähte)für 30-sec; Desinfizieren Wärme-intolerant implantierbare Geräte (LWL-Kabel, Kunststoff-Stecker) mit einem 10-Sekunden-Dip in Ethanol; Schlag Ethanol getaucht Artikel trocken Anwendung von Druckluft aus der Dose.

2. Anästhesie, Stereotaktische Platzierung und Abstand von Skull

Verwenden Sie die IMPAC ⁶ Integrierte Multi Patient (Vet Equip Inc)-System, um die Maus zu betäuben. Verwenden Sie 5% Isoflurane/95% Sauerstoff für die Induktion und 3% Isoflurane/97% Sauerstoff für die Wartung während der Operation. Platzieren des Tieres auf einem Umluft-Wasser Decke eingestellt auf 37 C. Es ist nicht erforderlich, um die Körpertemperatur zu überwachen, wenn die Decke auf dieser Temperatur gehalten wird.

3. Vorbereiten der Schädel für Implantation

Bereiten Sie die Inzisionsstelle durch Rasieren alle Felle von der Oberseite des Schädels. Der rasierte Bereich sollte sich seitlich von einem Ohr zum anderen und anterior-posterior von den Augen bis zum hinteren Ende des Schädels. Desinfizieren Sie die unbedeckte Haut mit drei AUFEINANDEe Abstriche von betadine gefolgt von Ethanol. Machen Sie eine mediale Inzision auf der Oberseite des Schädels, von zwischen den Augen auf der Rückseite des Schädels. Reinigen Sie den Schädel mit Wasserstoffperoxid und sterile Kochsalzlösung (0,9% NaCl). Blutstillung mit einem Ausbrennen Werkzeug. Suchen und markieren bregma und Lambda zur Bestimmung stereotaktischen Koordinaten. Stereotaktischen Koordinaten für Elektrode / optogenetische Reizkonfigurationen dass wir verwendet haben, sind in Tabelle 1 dargestellt und schematisch in 1A gezeigt.

4. Vorbereitung der Implantation Seiten auf Skull

Verwenden Sie ein High-Speed-Dentalbohrer mit einem 0.5mm Ball Grat Bit auf jeden Implantationsstelle in den Schädel zu etablieren. Fasen die externe Marge von jedem Loch mit einem 0,7 mm Kugel Grat Bit Schraube Einführen zu erleichtern.

5. Einsetzen und Sichern von Kanülen, führt EMG-und EEG-Leads

Legen EEG Schrauben (0,8 mm in der Länge, mit 2 cm 3 unbeschichtete0-Gauge verzinnten Kupfer-Bus-wire pre-verlötet Zylinderschraube) in die Löcher und fahren sie mit einem geschlitzten Handschraubendreher ca. 4-5 Umdrehungen um die gewünschte Tiefe zu erhalten. Halten Guide Kanülen in Ort mit einer stereotaktischen Kanülenhalter und dann befestigen Sie sie am Schädel und Anker mit Acrylzement. Jedes Führungskanüle sollte eine Dummy Kanüle / Stilett (Plastics Eins, Teil # C312 DC \ 1) von der Zeit der Operation enthalten zur Zeit der Experimente (10-14 Tage), um die Durchgängigkeit aufrechtzuerhalten.

6. Schließen Surgical Website

Sobald EEGs und Führung Kanülen in den Schädel positioniert, sie miteinander verbinden mit zahnärztlichen Acrylzement (Lang Dental - Ortho-Jet Zement). Nach Zement-Sets, positionieren Sie den Kunststoff-Stecker (Pinnacle Technologie part # 8402) über dem getrockneten Zement Hügel. Lötmittel die Enden der Drähte, die aus EEG Zuleitungen zu den Kontakten auf der Kunststoff-Buchse. Encase die Drähte in Zement. Dann ziehen die EMG Kabel durch die Nackentransparenz Muskelns durch Einschieben in den Lauf einer 21ga Nadel durchbohrt Muskel. Binden Sie einen Doppel-Chirurgen Knoten 5-0 Nylonfaden um diese Adern nur distal, wo sie verlassen den Muskel. Naht wieder zusammen, die die Haut zurückgezogen, um das Muskelgewebe mit einzelnen Operateur unterbrochen Knoten zuzugreifen wurde, unter Verwendung einer reversen Schneiden P-3 und 5-0 Nadel Nylonnaht.

7. Postoperativen Analgesie und Recovery

Verabreichen als Analgetikum Buprenorphin (0,1 mg / kg, subkutan) und Flunixinmeglumin (0,1 mg / kg, subcutan) als einem entzündungshemmenden sofort nach dem Eingriff und täglich an den Tagen 1-2 nach der Operation. Damit sich die Tiere in Standard-Kolonie Wohnbedingungen für mindestens sieben Tage vor dem Experiment zu erholen. Ohne zusätzliche Betreuung über Standard-Kolonie Gehäuse, Kanülen erwartet Patent für mindestens zwei Wochen bleiben, mit dem innewohnenden Stilette in Platz gesichert sein. EEG-und EMG-Sensoren können auch zurückzuhalten erwartetFunktionen für diese Dauer.

2. Generation von Timed Lichtpulse

Ein. Programmierung von MC Stimulus Einheit

Schließen Sie den MC-Stimulus-Einheit (Multi-Channel Systems) über eine USB-Verbindung zu einem Desktop-Computer. Verwenden Sie die Tabellenkalkulation wie MC-Stimulus Benutzeroberfläche, um die MC Stimulus Gerät zu programmieren. Geben Sie die gewünschte TTL (Transistor-Transistor-Logik)-Spannung für die EIN-Periode, die Dauern der Stimulus-und Aus-Perioden, die Anzahl von Zyklen pro Sekunde gewünscht, und die Gesamtzahl der wiederholten Zyklen für den gesamten Stimulus Sitzung. Für weitere Details siehe MC-Stimulus technisches Handbuch:

3. Herstellung / Montage von Fiber Optic Probes für Light Lieferung an den Cerebral Cortex

1. Bedarfsartikel und Ausrüstung benötigt werden unter: http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
2. Schneiden und Polieren von LWL-Kabeln. http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf

4. Montage von Rodent optogenetische Stimulations-System

Ein. Schnittstelle des MC-Stimulus-Einheit und Laser

Sobald das MC-Stimulus-Einheit programmiert ist, führen sie als eigenständige Signalgenerator eines 5-Volt binären EIN / AUS-Signal. Schließen Sie den MC-Stimulus Gerät mit dem TTL-fähigen Netzteil des Lasers mit BNC-Buchsen.

2. Herstellung Laser Ausgabe über Fiber Optic Cable

Mit dem digitalen Display und variable Leistung Zifferblatt der Laserleistung Gerät auf manuellely regelt seine Leistung des Lasers. Schließen Sie die Laserleistung Gerät mit dem Laser über ein Flachbandkabel. Verbinden Sie den weiblichen FC (Ferrule Stecker) Glasfaser-Adapter des Lasers auf das männliche FC-Anschluss an der LWL-Patchkabel (a 3 m Länge, 200 Mikrometer Durchmesser Glas Wärmeleitung Faser Licht reflektierenden Acrylatpolymer Verkleidung ummantelt).

3. Fördern der Laser zum Tier: Rotary Kommutator

Verbinden Sie den Ursprung Glasfaserkabel (3 m Länge) und die Lieferung Glasfaserkabel (45 cm lang) an gegenüberliegenden Enden der optischen Drehgelenk umschließt zwei Kollimationslinsen (Doric Linsen). Faseroptischer Drehgelenk dient als Kommutator: als das Tier bewegt über dem Käfig dreht sich die Drehverbindung zum Bruch der Lichtwellenleiter verhindern. Verwenden Kunststoffkabelbindern zur Anbringung des Kommutators auf einem Metall stehen, die über dem zylindrischen Käfig, in dem das Tier aufgenommen ist.

4. Anbringen Lieferung Fiber OpticCable to Head

Restrain die Maus mit einer Hand die Maus unter einem gewölbten Handfläche Pin. Orient der Kopf zwischen den Experimentator Mittel-und Zeigefinger. Entfernen Sie die Dummy-Kanüle aus dem Führungskanüle für die LWL-Kanüle gelegt. Deaktivieren Sie das Führungskanüle von Schutt mit einer sterilen 25ga Nadel. Legen Sie die LWL-Kabel von Hand und befestigen Sie es an das Glasfasernetz Führungskanüle mit einem Gewinde Schraubverschluss aus einer Dummy-Kanüle geborgen. Steuern die Tiefe der Insertion des Glasfaserkabels im Gehirn durch eine Naht Knoten auf das faseroptische Kabel in einem festen Abstand von der flachen geschnittenen Ende gebunden. Das gesamte experimentelle Vorrichtung ist in 1B gezeigt.

5. Messung von EEG definierten Schlaf und Laktatkonzentration während optogenetische Stimulation

Ein. Vorkalibrierung des Lactate Sensor

Vorkalibrierung des Lactat-Sensor ist mit einer in vitro durchgeführtenKit (Pinnacle Technologie part # 7000-K1-T). Der Sensor ist äquilibriert in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4), dann belichtet bis drei Konzentrationen von L-Lactat in einer schrittweisen Weise pro Hersteller Protokolle.

2. Einsetzen des Lactate Sensor-und EEG-Kabel

Legen Sie die vorkalibrierten Sensors in den Schädel montiert Laktat Führungskanüle in einer Weise identisch mit dem Glasfaserkabel Einführvorgang (Abschnitt 4.4). Schließen Sie das Laktat Sensor zum Vorverstärker des Pinnacle 8.400 Biosensor mit bipolarer Steckverbindern. Bringen Sie diesen Vorverstärker an den 8-poligen Stecker auf der chirurgisch implantiert Headmount.

3. Gründung optogenetische Reizstärke

Bevor die Erhebung von Daten, verwenden Sie die Laserintensität Regler, um die Intensität des optogenetische Stimulus anzupassen. Die Amplitude des EEG-Antwort wird über Tiere variieren, aufgrund von Faktoren, die bisher systematisch untersucht, eine d muß durch visuelle Inspektion zu Beginn der Stimulation überprüft werden. In der Praxis wird eine Intensität von 80-120 μWatts typischerweise zu einem Anstieg der EEG-Amplitude von etwa 50% bei der Frequenz der Stimulation. Post-hoc schnelle Fourier-Analyse (siehe Abschnitt 5.5) ist notwendig, um die absolute Stärke der Reaktion zu quantifizieren.

4. Data Collection

Sammeln von Daten über die Pinnacle 8400 System: http://pinnaclet.com/pal-8400.html .

5. Data Processing mit Neuroscore

Klassifizieren schlafen Staaten durch visuelle Inspektion der EEG-und EMG-Daten mit dem Neuroscore Schnittstelle (DataSciences, International: http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp ) oder Sirenia Schnittstelle (Pinnacle Technology:f = "http://www.pinnaclet.com/sirenia.html" target = "_blank"> http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). Prozeßdaten im Zehn-Sekunden-Epochen wake, non-rapid eye movement sleep oder rapid eye movement sleep auf EEG-und EMG-Basis. Daten speichern, wie Microsoft Excel zur weiteren Analyse und statistische Tests.

Ergebnisse

Wie in 2 gezeigt ist, eine Maus für optogenetische Stimulation und Laktat / EEG / EMG Datenerfassung ausgestattet erfuhr spontane Schlaf / Wach-Zustandsübergänge während EEG, EMG und zerebrale Laktatkonzentration kontinuierlich überwacht wurden. Strom am Lactat Sensors erhöht während Perioden niedriger Amplitude EEG und nahm während Perioden hoher Amplitude EEG. Wie in 3 gezeigt, sind beide Kanäle des EEG in Reaktion auf Reize optogenetische im frontale...

Diskussion

Die hier vorgestellten Methoden erlauben es, die Beziehung zwischen Schlaf und Veränderungen im Gehirn Konzentration des glykolytischen Zwischenprodukt Lactat auf einer Zeitskala bisher nicht möglich zu messen. Tiere eine spontane Übergänge zwischen wake, NREMS und REMS. Darüber hinaus sind wir in der Lage, optogenetische Reize gelten, während Tiere diese Übergänge zu unterziehen. Die gesammelten Daten bisher zeigen, dass sowohl spontanen und induzierten Wellen Auswirkungen auf das Auslesen von einem Lactat-Oxid...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komponente	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
BASi Maus Führungskanüle	Pinnacle Technology / BASi Inc	7032
Lactate Biosensor	Pinnacle Technologie	7004
Kopfmontage	Pinnacle Technologie	8402
Sleep / Biosensor Recording-System	Pinnacle Technologie	8400-K1-SL	2 EEG-Kanäle, 1 EMG-Kanal & 1 Biosensor
Tethered Mouse in-vitro Calibration Kit	Pinnacle Technologie	7000-K1-T
Fiber Optic Führungskanüle	Plastics One	C312G	21 Gauge Führungskanüle
Dummy Kanüle	Plastics One	C312DC	21 Gauge Dummy
Diamant Fiber Scribe	Thorlabs	S90W
Fiber Connector Crimp Tool	Thorlabs	CT042
Furcation Tubing	Thorlabs	FT030	03.0 mm
	Thorlabs	T10S13	Max Dia. 0,012
Furcation Rohr Stripper	Thorlabs	FTS3
Bare Harte Cladding Multimode Fiber	Thorlabs	BFL37-200	200 &mgr; Core, 0,37 NA
Draht Snips / Kevlar Schere	Thorlabs	T865
Fiber Optic Epoxy	Thorlabs	F112
Fiber Stripper-Tool	Thorlabs
Glass Polishing Platte	Thorlabs	CTG913
Rubber Polishing Pad	Thorlabs	NRS913
Eye Loupe	Thorlabs	JEL10
Kim Wipes	Thorlabs	KW32
Druckluft	Thorlabs	CA3
Polieren Puck	Thorlabs	D50-xx
Fiber Prüfumfang	Thorlabs	CL-200
Polieren Films	Thorlabs	LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P
FC / PC-Stecker Ende	Thorlabs	30126G2-240	240 um Bore, SS Ferrule
MC Stimulus Einheit	Multi-Channel Systems	STG-4002
MC Stimulus Software	Multi-Channel Systems	MC-Stimulus V 2.1.5
Blue Laser	CrystaLaser	CL473-050-0
Laser Power Supply	CrystaLaser	CL2005
Fiber Optic Rotary Joint	Doric Lenses	FRJ-v4
			Tabelle 2. Bedarfsartikel und Ausrüstung.