Одновременное электроэнцефалография, в режиме реального времени измерения концентрации лактата и Optogenetic Манипуляция активности нейронов в коры головного мозга грызунов

William C. Clegern; Michele E. Moore; Michelle A. Schmidt; Jonathan Wisor

doi:10.3791/4328

АВТОРЫ

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Method Article

Одновременное электроэнцефалография, в режиме реального времени измерения концентрации лактата и Optogenetic Манипуляция активности нейронов в коры головного мозга грызунов

DOI:

10.3791/4328

⸱

December 19th, 2012

William C. Clegern¹, Michele E. Moore¹, Michelle A. Schmidt¹, Jonathan Wisor¹

¹Department of Veterinary & Comparative Anatomy, Pharmacology and Physiology, Sleep and Performance Research Center, WWAMI Medical Education Program, Washington State University

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Резюме

Процедура описана для управления деятельностью коры головного мозга пирамидальных нейронов optogenetically в то время как электроэнцефалограммы, электромиограммы, и церебральной концентрации лактата контролируется. Экспериментальные записи выполняются на кабельно-привязанный мышей, когда они подвергаются спонтанному сон / бодрствование циклы. Optogenetic сборки оборудования в нашей лаборатории; записывающее оборудование является коммерчески доступным.

Аннотация

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest¹. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness^2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.

One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram^5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state⁷. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell⁸; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.

Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.

We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

протокол

1. Хирургическая подготовка животных

1. Испытуемых

Используйте мышей B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J трансгенной линии ^9; JAX штамм # 7612) или других мышей, экспрессирующих синие светочувствительных катионов канал, Channelrhodopsin-2, в коры головного мозга нейроны. Применение синего света в коре головного мозга B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J линию трансгенных вызывает пирамидальные нейроны, экспрессирующие Channelrhodopsin-2 для деполяризации и пройти потенциалы действия ^9,10. Как следствие пирамидальной активации клеток, местные интернейроны будут активированы, и изменение потенциала распространяется на нейроны за пределами площадки стимуляции ^10. Выполнить операции в стерильных условиях в соблюдении применимых нормативных принципов: автоклаве хирургические инструменты и softpacks (операционного поля, марлевые прокладки); горячая борта стерилизовать все тепло терпимым имплантированных металлических устройств (канюли, винты и провода)для 30-сек; Лечить тепла непереносимостью имплантируемых устройств (волоконно-оптический кабель, пластиковый разъем) с 10-секундный провал в этанол; удар этанола ближнего пунктов сухой применением сжатым воздухом.

2. Анестезия, Стереотаксическая размещения и оформления черепа

Используйте IMPAC ^{6 Интегрированные} нескольких пациентов (Vet Если на персонаже Inc) системы, чтобы обезболить мыши. Используйте 5% Isoflurane/95% кислорода для индукции и 3% Isoflurane/97% кислорода для поддержания во время операции. Поместите животное на циркуляцией воды одеяло установлена на 37 ° С. Не нужно контролировать температуру тела, если одеяло выдерживают при этой температуре.

3. Подготовка черепа для имплантации

Подготовьте место разреза после бритья все меха из верхней части черепа. Побрился область должна проходят сбоку от уха до уха и передне-заднего от глаз к заднему концу черепа. Лечить открытые участки кожи с тремя consecutivэлектронной мазки бетадин следует этанола. Сделайте медиальный разрез в верхней части черепа, из промежутка между глазами к задней части черепа. Очистите череп с перекисью водорода и стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl). Управление кровотечения с прижигание инструмент. Найдите и отметьте брегмы и лямбда для определения стереотаксических координат. Стереотаксическая координаты для электрода / optogenetic стимул конфигураций, которые мы использовали представлены в таблице 1 и схематически показано на рисунке 1а.

4. Подготовка к имплантации сайтов на череп

Используйте высокую скорость бормашины с 0,5 бит мяч заусенцев установить каждом участке имплантации в черепе. Фаска внешнего края каждого отверстия с помощью 0,7 мм мяч заусенцев немного для облегчения винта.

5. Вставка и крепления канюли, ЭМГ и ЭЭГ снабжении покупателей

Вставьте ЭЭГ винтов (0,8 мм в длину, 2 см без покрытия 30-калибровочного луженой медной шины провода предварительно припаяны к головке винта) в отверстия и вести их через прорези руки отвертку примерно на 4-5 оборотов для получения желаемой глубины. Держите руководство канюли на месте с помощью стереотаксической держателя канюли, а затем прикрепите их к черепу и якоря с акриловым цементом. Каждый канюли должны содержать фиктивные канюлю / Стилет (пластмассы One, часть # C312 DC \ 1) с момента операции до момента эксперимента (10-14 дней) для поддержания проходимости.

6. Хирургическое закрытие сайта

После ЭЭГ и руководство канюли расположены в черепе, объединить их с зубным цементом акриловые (Lang Dental - Орто-Jet цемента). После цемент наборы, установите пластиковый разъем (Pinnacle Технология части № 8402) над сушеные курган цемента. Припой концы проводов, исходящих из ЭЭГ приводит к контактам на пластиковый разъем. Encase провода приводит в цементе. Затем нарисуйте EMG провода через затылочных мышцы, сдвинув их в ствол 21ga иглой пронзил мышцы. Завяжите узлом двойной хирург из нейлона 5-0 шва вокруг этих проводах только дистально, где они выходят мышц. Шовный вместе кожу, которая была втянута доступ к мышечной ткани с одной прервал узлов хирург, используя обратную резки P-3 иглы и 5-0 нейлоновые нити.

7. Послеоперационное обезболивание и восстановление

Администрирование бупренорфина в качестве обезболивающего средства (0,1 мг / кг, подкожно) и Flunixin меглумина (0,1 мг / кг, подкожно) в качестве противовоспалительного сразу после операции, и ежедневно на 1-2 дней после операции. Разрешить животных, чтобы восстановить в стандартном жилищные условия колонии, по крайней мере за семь дней до эксперимента. При отсутствии дополнительного ухода за стандартный корпус колонии, канюли может быть как ожидается, останется патент, по крайней мере, двух недель с внутренним стилеты закреплены на месте. ЭЭГ и ЭМГ датчики можно ожидать сохраненияфункциональностью для этого срок.

2. Генерация Timed световых импульсов

1. Программирование блока Стимул MC

Подключите MC-Стимул блок (Multi-Channel Systems) через соединение USB к настольному компьютеру. Использование электронной таблицы как MC-Стимул пользовательский интерфейс для программирования MC блок стимул. Введите желаемое TTL (транзисторно-транзисторной логики) напряжения для на период, длительность стимула и выключать периодов, число циклов в секунду лучшего, а общее число повторяющихся циклов в течение всей сессии стимул. Для получения дополнительной информации см. MC-Стимул технического руководства:

3. Производство / Сборка волоконно-оптических PrOBEs для легкой доставки к коре головного мозга

Расходные материалы и оборудование, необходимые находятся по адресу: http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
Огранки и полировки волоконно-оптических кабелей. http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf

4. Собрание грызунов системы стимулирования Optogenetic

1. Интерфейс MC-Стимул группы и лазерная

После MC-Стимул устройство запрограммировано, запустить его в качестве автономного генератора сигналов 5-ти вольт двоичной ON / OFF сигнала. Подключите MC-Стимул устройства к TTL включен блок лазера с BNC разъемами.

2. Производство лазерных Выход через волоконно-оптический кабель

С помощью цифрового дисплея и переменной набора мощности силового агрегата на ручной лазерныйют регулировать выходную мощность лазера. Подключите устройство мощность лазера для лазерной помощью ленточного кабеля. Подключите женщины FC (наконечник разъема) волоконно-оптического адаптера лазера на разъем FC на волоконно-оптический патч-кабель (3 м длиной, диаметром 200 мкм стекла проводимости волокна, заключенного в свет, отраженный акрилатный полимер оболочки).

3. Транспортировка лазера на животных: Роторный Коммутатор

Подключите происходящих волоконно-оптический кабель (3 м в длину) и доставки волоконно-оптический кабель (45 см длиной), чтобы противоположных концах зрительного поворотные совместной упаковывая две коллиматорные линзы (линзы дорического). Волоконно-оптических поворотные совместной служит в качестве коммутатора: как животное движется вокруг своей клетке, поворотные совместной вращается, чтобы предотвратить поломку волоконно-оптического кабеля. Использование пластиковых стяжек для прикрепления коммутатор на металлической подставке расположены над цилиндрической клетке, в которой находится животное.

4. Присоединение доставки волоконно-оптическихКабельные Главы

Сдерживать мыши с помощью одной руки, чтобы прикрепить мышь под сложенные ладони. Orient голову между средним экспериментатора и указательным пальцем. Удалить манекен канюлю из канюли размещены на волоконно-оптические канюли. Очистите направляющие канюли космического мусора с помощью стерильной иглой 25ga. Вставьте волоконно-оптического кабеля от руки и прикрепите ее к волоконно-оптической канюли руководство с резьбовой крышкой винта спасти от манекена канюли. Контролировать глубину введения волоконно-оптического кабеля в мозге шва узел, завязанный на волоконно-оптический кабель на фиксированном расстоянии от плоского расщепленного конца. Весь экспериментальной установки показана на рисунке 1b.

5. Измерение ЭЭГ определенных сна и концентрации лактата во время стимуляции Optogenetic

1. Precalibration из лактата датчика

Предварительная калибровка датчика лактата осуществляется с в пробиркеКомплект (Pinnacle Технология части № 7000-K1-T). Датчик уравновешенную фосфатным буферным раствором (рН 7,4), а затем подвергается трех концентраций L-лактата в скачком на производителя протоколов.

2. Размещение лактата датчиков и ЭЭГ кабельные

Вставьте предварительно откалибровать датчик в череп монтажа лактата канюли руководство таким образом, идентична волоконно-оптического кабеля процедуру введения (раздел 4.4). Подключите лактата датчик предусилитель Pinnacle 8400 биосенсора с биполярным разъемы. Прикрепите этот предусилитель к 8-контактному разъему на хирургически имплантированных headmount.

3. Создание Optogenetic интенсивности стимула

До начала сбора данных, использование контроля интенсивности лазерного излучения регулятором интенсивности раздражителя optogenetic. Амплитуды ЭЭГ ответ будет варьироваться в зависимости от животных, в связи с факторами, которые не изучались систематически, D должна быть проверена при визуальном осмотре в начале стимуляции. На практике, интенсивность 80-120 μWatts, как правило, приводят к увеличению амплитуды ЭЭГ примерно на 50% на частоте стимуляции. После специальной быстрого преобразования Фурье анализ (см. раздел 5.5) является необходимым для количественного определения абсолютной величины ответа.

4. Сбор данных

Сбор данных с помощью Pinnacle 8400 Система: http://pinnaclet.com/pal-8400.html .

5. Обработка данных с Neuroscore

Оцените состояние сна путем визуального осмотра ЭЭГ и ЭМГ данных с Neuroscore интерфейс (DataSciences, International: http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp ) или Sirenia интерфейс (Pinnacle технологии:F = "http://www.pinnaclet.com/sirenia.html" целевых = "_blank"> http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). Обработка данных в десять секунд эпох, как следа, без быстрого движения глаз сон, или быстрого сна движения глаз на основе ЭЭГ и ЭМГ. Сохранить данные в таблицы Microsoft Excel для дополнительного анализа и статистических испытаний.