Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

William C. Clegern; Michele E. Moore; Michelle A. Schmidt; Jonathan Wisor

doi:10.3791/4328

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Method Article

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

DOI:

10.3791/4328

⸱

December 19th, 2012

William C. Clegern¹, Michele E. Moore¹, Michelle A. Schmidt¹, Jonathan Wisor¹

¹Department of Veterinary & Comparative Anatomy, Pharmacology and Physiology, Sleep and Performance Research Center, WWAMI Medical Education Program, Washington State University

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Summary

הליך מתואר למניפולציה של פעילות תאי עצב בקליפת מוח פירמידליים מוחיים optogenetically תוך אלקטרו, electromyogram, וריכוז חומצת חלב מוחות המנוטרים. הקלטות ניסיוניות מבוצעות על עכברי כבלים-כבולים בזמן שהם עוברים מחזורי שינה / בעקבות ספונטניים. Optogenetic ציוד מורכב במעבדה שלנו; ציוד הקלטה זמין מסחרי.

Abstract

למרות שהמוח מהווה פחות מ 5% מהגוף על ידי מסה, היא מנצלת כרבע מגלוקוז בשימוש על ידי הגוף במנוחה ^1. הפונקציה של שינה ללא תנועת עיניים מהירות (NREMS), החלק הגדול ביותר של שינה בזמן, אינה ודאית. עם זאת, מאפיין בולט אחד NREMS הוא ירידה משמעותית בשיעור ניצול הגלוקוז במוח ביחס לערות ^2-4. זה וממצאים אחרים הוביל לאמונה מרוויחה כי שינה ממלאת תפקיד הקשור לחילוף חומרים במוח. ובכל זאת, את המנגנונים בבסיס הירידה בחילוף חומרים של הגלוקוז במוח במהלך NREMS יישארו להובהרו.

תופעה אחת קשורה NREMS שעשוי להשפיע על קצב חילוף חומרים במוח היא המופע של גלים איטיים, תנודות בתדרים של פחות מ 4 רץ, באלקטרו ^5,6. גלים איטיים אלו שאותרו ברמה של הגולגולת או משטח קליפת מוח מוחות משקפיםתנודות של נוירונים בסיסיים בין מדינת depolarized / ומדינה hyperpolarized / למטה ^7. במהלך את המדינה, תאים אינם עוברים פוטנציאלי פעולה למרווחים של עד כמה אלפיות שניים 100. שיקום הדרגתי ריכוז יוני עוקבים לפוטנציאל פעולה מייצג עומס מטבולים משמעותי על התא ^8; העדר פוטנציאל פעולה במצבים למטה קשורים NREMS עשוי לתרום לחילוף חומרים יחסית להעיר מופחת.

שני אתגרים טכניים היו צריכים טיפול במסגרת מערכת היחסים ההיפותטי הזה כדי להיבדק. ראשית, היה צורך למדוד את חילוף חומרי glycolytic מוחות עם רזולוציה משקפת את הדינמיקה של EEG המוחי זמנית (כלומר, על שניות ולא דקות). כדי לעשות זאת, מדדה את הריכוז של חומצת חלב, התוצר של הגליקוליזה אירובית, ולכן readout של קצב חילוף חומרים של הגלוקוז במוחם של עכברים. קטט היהנמדד באמצעות חיישן קטט מונואמין מבוסס זמן אמת הגלומה בקליפת המוח הקדמית. מנגנון החישה מורכבת מאלקטרודה הפלטינה אירידיום המוקף בשכבה של מולקולות מונואמין קטט. חילוף חומרים של חומצת חלב על ידי מונואמין קטט מייצר מי חמצן, שמייצר זרם באלקטרודה הפלטינה אירידיום. אז ramping את הגליקוליזה המוח מספק עלייה בריכוזו של המצע למונואמין חומצת החלב, אשר לאחר מכן בא לידי ביטוי בעלייה נוכחית בהאלקטרודה החישה. זה היה בנוסף צורך למדוד המשתנים הללו תוך מניפולצית העירור של קליפת המוח, כדי לבודד את המשתנה הזה מהיבטים אחרים של NREMS.

אנחנו פתחנו מערכת ניסיונית למדידה בו זמנית של פעילות עצבית דרך elecetroencephalogram, מדידת שטף glycolytic דרך biosensor חומצת חלב, והמניפולציה של פעילות עצבית בקליפת מוח מוח באמצעות הפעלת optogenetic של Pyraהנוירונים midal. יש לנו מנוצלים במערכת זו כדי לתעד את היחסים בין צורות גל שינה הקשורות electroencephalographic ואת הדינמיקה מהרגע לרגע של ריכוז חומצת חלב בקליפת המוח. הפרוטוקול עשוי להיות שימושי עבור כל אדם המעוניין ללמוד, במכרסמים מתנהגים בחופשיות, קשר בין הפעילות עצבית שנמדדה ברמת electroencephalographic והאנרגטיקה סלולרית בתוך המוח.

Protocol

1. הכנה כירורגית של בעלי חיים

1. נושאים ניסיוניים

השתמש עכברים של קו B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / י המהונדס ^9; מתח JAX # 7612) או עכברים אחרים המבטא את הערוץ הכחול הרגיש לאור קטיון, Channelrhodopsin-2, בנוירונים בקליפת המוח מוחיים. יישום של אור הכחול לקליפת המוח של קו B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / י המהונדס גורם לנוירונים פירמידליים מבטאים Channelrhodopsin-2 לdepolarize ולעבור פעולת פוטנציאלי ^9,10. כתוצאה מהפעלת התא פירמידלי, interneurons המקומי מופעלים, והשינוי בפוטנציאל מופץ לנוירונים מעבר לאתר של גירוי ^10. ביצוע ניתוח בתנאים סטריליים בעמידה בהנחיות הרגולטוריות החלות: כלים כירורגיים וחיטוי softpacks (שדה ניתוחי, פדה גזה); חם חרוז לעקר כל התקני חום הסובלני המושתלים המתכת (cannulas, ברגים וחוטים)עבור 30-שניות; לחטא מכשירים מושתלים חום סובלני (מחבר כבל סיב אופטי, פלסטיק) עם טבילה 10-שניות באתנול; פריטי מכת אתנול טבלו יבש על ידי יישום של אוויר משומר.

2. הרדמה, מיקום ועמילות של גולגולת Stereotaxic

השתמש החולה ⁶ המערכת מולטי המשולבת IMPAC (וטרינר הצייד Inc) כדי להרדים את העכבר. השתמש 5% חמצן Isoflurane/95% לזירוז וIsoflurane/97% חמצן 3% לתחזוקה במהלך ניתוח. מניח את החיה על שמיכה במחזור מים המוגדרים 37 ג אין זה הכרחי כדי לפקח על טמפרטורת גוף אם השמיכה נשמרה בטמפרטורה זו.

3. הכנת הגולגולת להשרשה

הכן את אתר החתך על ידי גילוח כל הפרווה מהחלק העליון של הגולגולת. האזור המגולח צריך להרחיב רוחבי מאוזן לאוזן וקדמית, אחורית מהעיניים לסוף האחורי של הגולגולת. לחטא את העור החשוף עם שלוש consecutivמטליות דואר של פולידין ואחריו אתנול. עושה חתך מדיאלי בחלק העליון של הגולגולת, מבין העיניים לחלק האחורי של הגולגולת. נקה את הגולגולת עם מי חמצן ותמיסת מלח סטרילית (0.9% NaCl). שליטה בדימום בכלי צריבה. האתר ולסמן גבחת ומבדה לקביעת קואורדינטות stereotaxic. קואורדינטות Stereotaxic לתצורות גירוי אלקטרודה / optogenetic שהשתמשנו בי מוצגות בטבלת 1 והראו סכמטי באיור 1 א.

4. הכנה של אתרי השתלות בגולגולת

השתמש תרגיל שיניים במהירות גבוהה עם קצת 0.5mm כדור Burr להקים כל אתר שיושתל בגולגולת. Chamfer שולים החיצוניים של כל חור באמצעות 0.7 מ"מ קצת Burr כדור כדי להקל על החדרת בורג.

5. כניסה ואבטחה של cannulas, EMG הובלות והובלות EEG

הכנס ברגי EEG (0.8mm באורך, עם 2 סנטימטר של 3 ללא ציפוי0-מד נחושת משומר אוטובוס מראש חוט מולחם-לדפוק את הראש) לתוך החורים ולהסיע אותם ביד עם המברג מחורר מהפכות כ 4-5 להשיג את העומק הרצוי. החזק cannulas מדריך במקום עם בעל stereotaxic צינורית ואז להדביק אותם לגולגולת ועוגנים במלט אקרילי. כל מדריך צינורית צריכה להכיל קנולה / stylet דמה (פלסטיק אחד, חלק # C312 DC \ 1) ממועד הניתוח לזמן של ניסויים (10-14 ימים) כדי לשמור על patency.

6. סגירת אתר כירורגי

ברגע אא"ג וcannulas מדריך ממוקמים בגולגולת, האג"ח יחד עם מלט אקריליק שיניים (שיני לאנג - Ortho-Jet מלט). לאחר סטי בטון, למקם את מחבר הפלסטיק (חלק טכנולוגית Pinnacle # 8402) מעל תלולית הבטון היבשה. את הקצוות של חוטים הנובעים מהפניות EEG למגעים במחבר פלסטיק הלחמה. עוטף את החוט מוביל במלט. ואז למשוך את חוטי EMG דרך השריר העורפיעל ידי זזה שלהם לתוך החבית של מחט 21ga פלח שריר. לקשור הקשר של תפר ניילון 5-0 של מנתח כפול סביב חוטים אלה רק דיסטלי למקום שבו הם יוצאים לשריר. לתפור בחזרה את העור שבוטל כדי לגשת לרקמת השריר עם קשרי מנתח נקטעו בודדים, באמצעות חיתוך הפוך מחט P-3 ותפר הניילון 5-0.

7. שיכוך כאבים שלאחר הניתוח והתאוששות

לנהל עצירות כמשכך כאבים (0.1 מ"ג / ק"ג, תת עורי) וflunixin meglumine (0.1 מ"ג / ק"ג, תת עורי) כאנטי דלקתי מייד לאחר ניתוח, ומדי יום בימים 1-2 אחרי הניתוח. אפשר חיות להתאושש בתנאי דיור מושבה רגילים לפחות שבעה ימים לפני הניסויים. ללא טיפול נוסף מעבר לדיור מושבה הסטנדרטי, cannulas ניתן צפוי להישאר פטנט על לפחות שבועות עם stylets השכינה מובטחת במקום. חיישני EEG ו EMG צפוי גם לשמור עלפונקציונלי למשך זמן זה.

2. דור של אור מתוזמן קטניות

1. תכנות של יחידת Stimulus MC

חבר את יחידת MC-Stimulus (מערכות רבי ערוצים) באמצעות חיבור USB למחשב שולחני. השתמש בגיליון אלקטרוני, כגון ממשק משתמש MC-Stimulus לתכנת את יחידת Stimulus MC. הזן את מתח TTL הרצוי (היגיון טרנזיסטור טרנזיסטור) לתקופה ב, את משך זמן הגירוי לסירוגין תקופות, במספר המחזורים בשניים רצויים, והמספר הכולל של מחזורים חוזרים ונשנים לגירוי המפגש כולו. לפרטים נוספים עיינו במדריך טכני MC-Stimulus:

3. ייצור / הרכבה של הסיבים האופטיים Prתוארי למשלוח אור לקליפת המוח

האספקה וציוד הדרוש נמצאות ב: http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
חיתוך וליטוש של כבלי סיבים אופטיים. Http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf

4. הרכבה של מערכת גירוי Optogenetic מכרסמת

1. ממשק של יחידת MC-Stimulus וליזר

ברגע שיחידת MC-Stimulus מתוכנת, להריץ אותו כמחולל אותות עצמאי של ינארי 5-Volt / כיבוי האות. חבר את יחידת MC-Stimulus ליחידת הכח מופעל TTL של הליזר עם מחברי BNC.

2. הפקת פלט ליזר באמצעות כבל סיב אופטי

השתמש בתצוגה הדיגיטלית וחיוג הספק משתנה של יחידת כוח הליזר לידניly להתאים את תפוקת החשמל של הליזר. חבר את יחידת כוח הליזר לליזר דרך כבל סרט. חבור את מתאם סיבים של הליזר למחבר FC זכר על כבל תיקון הסיבים האופטי (3 מ 'אורך, 200 מיקרומטר קוטר סיבי זכוכית הולכה עטופה באור משקף חיפוי פולימר Acrylate) נקבת FC (מחבר כובעון מתכת).

3. שינוע הליזר לבעלי החיים: מחלף רוטרי

חבר את כבל הסיב האופטי שמקורו (3 מ 'אורך) וכבל הסיב האופטי המשלוח (45 סנטימטר אורך) להתנגדות לקצוות של המפרק הסיבובי האופטי encasing שתי עדשות collimating (עדשות דוריים). המפרק הסיבובי הסיבים האופטי משמש כמחלף: כחיה נעה על הכלוב שלו, המפרק הסיבובי מסתובב כדי למנוע שבירה של כבלי הסיבים האופטיים. השתמש בקשרי כבל פלסטיק כדי להצמיד למחלף מתכת עומד להציב מעל הכלוב הגלילי שבחיה נמצא.

4. מצרף משלוח סיב אופטיכבלים לראש

לרסן את העכבר באמצעות יד אחת כדי להצמיד את העכבר בכף יד. אוריינט הראש בין אמצעו של הנסיין ואצבע המורה. הסר את צינורית הדמה ממדריך הצינורית הציבה לצינורית הסיבים האופטיות. נקה את צינורית המדריך של פסולת באמצעות מחט סטרילית 25ga. הכנס את כבל הסיב האופטי ביד ולהצמיד אותו לצינורית מדריך הסיבים האופטיות עם כובע בורג הליכים הוצלו מצינורית דמה. לשלוט בעומק ההחדרה של כבל הסיב האופטי במוח על ידי פקעת תפר הקשור בכבל הסיב האופטי במרחק קבוע מהקצה שטוח בקע. המנגנון הניסיוני כולו מוצג בתרשים 1B.

5. מדידה של שינה EEG מוגדר וריכוז לקטט במהלך גירוי Optogenetic

1. Precalibration של חיישן קטט

טרום כיול של חיישן קטט מבוצע עם במבחנההערכה (חלק Pinnacle טכנולוגיה # 7000-K1-T). החיישן הוא מתאזן בנאגר מלוח פוספט (pH 7.4), ואז נחשף לשלושה ריכוזים של L-חומצת חלב באופן הדרגתי לפרוטוקולי יצרן.

2. החדרת חיישן קטט וכבלי EEG

הכנס את החיישן מראש המכויל לצינורית הגולגולת הרכובה קטט המדריך באופן זהה להליך החדרת הסיב האופטי הכבל (סעיף 4.4). חבר את החיישן לקטט קדם המגבר של 8400 biosensor Pinnacle עם מחברי תקע דו קוטביים. צרף קדם המגבר הזה למחבר 8-PIN בheadmount המושתל-ניתוח.

3. הקמת עוצמת גירוי Optogenetic

לפני איסוף נתונים, השתמש בכפתור בקרת עוצמת הליזר כדי להתאים את עוצמת גירוי optogenetic. המשרעת של תגובת EEG תשתנה פני בעלי חיים, בשל גורמים שלא נחקרו באופן שיטתי, ד חייב להיות מאומת על ידי בדיקה חזותית בתחילת הגירוי. בפועל, עוצמת 80-120 μWatts תהיה בדרך כלל לייצר גידול במשרעת EEG של כ 50% בתדירות של גירוי. -Post hoc ניתוח מהיר התמרה (ראה סעיף 5.5) יש צורך לכמת את הבהירות המוחלטת של התגובה.

4. איסוף נתונים

איסוף נתונים באמצעות מערכת 8400 Pinnacle: http://pinnaclet.com/pal-8400.html.

5. עיבוד נתונים עם Neuroscore

לסווג לישון מדינות על ידי בדיקה ויזואלית של נתוני EEG וEMG עם Neuroscore הממשק (DataSciences, בינלאומי: http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp) או Sirenia הממשק (Pinnacle הטכנולוגיה:f = היעד "http://www.pinnaclet.com/sirenia.html" = "_blank"> http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). נתוני תהליך בתקופות של עשר שניות, בעקבות שינה, ללא תנועת עיניים מהירות, או שנת תנועות עיניים מהירות המבוססת על EEG וחברת EMG. שמור את הנתונים כגיליונות אלקטרוניים של Microsoft Excel לניתוח נוסף ובדיקה סטטיסטית.