同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

要約

手順は脳波、筋電図、脳乳酸濃度が監視されながらoptogenetically大脳皮質錐体ニューロンの活動を操作するために記述されている。彼らは自発的睡眠/覚醒サイクルを受けながら、実験的な録音はケーブルつながマウスで実行されます。 Optogenetic機器は、我々の研究室で組み立てられている記録装置は市販されている。

要約

脳は質量体の5％未満を表しますが、それが残り¹でボディによって使用されるグルコースの約4分の1を利用しています。非レム睡眠（NREMS）、時間によって睡眠の最も大きい部分の機能は不明である。しかし、NREMSの一つ顕著な特徴は、覚醒^〜2-4相対脳グルコース利用率の大幅な削減が挙げられます。これと他の所見は、睡眠は脳代謝に関連する機能を果たすことを広く開かれた信念につながっている。まだ、NREMS時の脳グルコース代謝の減少のメカニズムは解明されていない。

脳代謝率に影響を与える可能性があるNREMSに関連付けられている一つの現象は、脳波^5,6で、徐波、4 Hz未満の周波数で振動の発生である。頭蓋骨や脳皮質表面のレベルで検出されたこれらの遅い波が反映脱分極/アップ状態とダウン/過分極状態⁷の間の基本的なニューロンの振動。ダウン状態の間、細胞は数百ミリ秒までの間隔で活動電位を受けない。活動電位への後続のイオン濃度勾配の復元はセル⁸に著しい代謝負荷を表す; NREMS伴うダウン状態の間の活動電位の欠如は目を覚ますと比較して減少代謝に寄与することができる。

二つの技術的な課題は、テストするこの架空の関係のために解決しなければならなかった。まず最初に、それは（秒ではなく分かけて）脳脳波のダイナミクスの反射時間分解能で脳の解糖代謝を測定する必要があった。そうするために、我々は、乳酸の濃度、好気的解糖の製品、したがって、マウスの脳内グルコース代謝率の読み出しを測定した。ラクだった前頭葉に埋め込まれた乳酸オキシダーゼベースのリアルタイムセンサを用いて測定。感知機構は、乳酸オキシダーゼ分子の層に囲まれた白金イリジウム電極で構成されています。乳酸オキシダーゼによる乳酸の代謝は、プラチナイリジウム電極に電流を生成する過酸化水素を生成します。だから脳糖のランプアップその後検出電極に電流を増加に反映されている乳酸酸化酵素の基質濃度の増加を提供しています。それはNREMSの他の側面からこの変数を単離するために、大脳皮質の興奮性を操作しながら、これらの変数を測定するために追加的に必要であった。

我々はelecetroencephalogram、乳酸バイオセンサーを経由して解糖流量の測定、PYRAのoptogeneticの活性化を介して大脳皮質神経活動の操作を介した神経細胞活動の同時測定のための実験系を考案midalニューロン。我々は、睡眠関連の脳波波形および大脳皮質における乳酸濃度の瞬間から瞬間の動態との関係を文書化するために、このシステムを利用してきた。プロトコルは、自由にげっ歯類を行動に、脳波レベルで測定された神経活動と脳内の細胞エネルギー代謝との関係の研究に興味を持って、個々の役に立つかもしれません。

プロトコル

1。動物の手術の準備

1。実験対象

大脳皮質ニューロンにおける青色光感受性陽イオンチャネル、チャネルロドプシン2を発現しているJAX株＃7612）または他のマウス; B6.Cg-TG（Thy1-COP4/eYFP）18Gfng / Jト ​​ランスジェニック線⁹のマウスを使用しています。 B6.Cg-TG（Thy1-COP4/eYFP）18Gfng / Jト ​​ランスジェニックラインの大脳皮質に水色のアプリケーションは^9,10電位^を脱分極し、アクションを起こすためにチャネルロドプシン2を発現する錐体細胞を引き起こす。錐体細胞の活性化の結果として、局所介在ニューロンが活性化され、潜在的な変化は、刺激¹⁰敷地外のニューロンに伝達されます。適用される規制ガイドラインの遵守における無菌条件下で手術を行います。オートクレーブ手術器具とsoftpacks（手術野、ガーゼパッド）;ホットビードはすべて熱トレラント移植金属デバイス（カニューレ、ネジ、ワイヤー）を殺菌する30秒のために、エタノールで10秒浸漬して、熱不寛容植込み型デバイス（光ファイバケーブル、プラスチックコネクタ）を駆除、打撃エタノールに浸した項目は、缶詰の空気によって乾燥した。

2。スカルの麻酔、定位配置とクリアランス

マウスを麻酔しIMPAC ⁶統合マルチ患者（VETイクイップ社）システムを使用してください。誘導および手術中のメンテナンスのために3パーセントIsoflurane/97％酸素の場合は5％Isoflurane/95％酸素を使用しています。それは毛布をこの温度に保たれている場合、本体の温度を監視する必要はありません37℃に設定した循環水の毛布の上に動物を置きます。

3。移植のためのスカルの準備

頭蓋骨の上からすべての毛皮を削って切開部位を準備します。剃毛面積が耳から目から頭蓋骨の後端に耳と前後に横方向に拡張する必要があります。 3连続露出した皮膚の消毒ベタジンのe綿棒は、エタノールが続く。目と目の間から頭蓋骨の後ろに、頭蓋骨の上に内側切開を行います。過酸化水素と滅菌生理食塩水（0.9％NaCl）で頭蓋骨をきれいにしてください。焼灼ツールで出血をコントロール。定位座標を決定するためブレグマとラムダの位置を確認し、マークします。我々が使用している電極/ optogenetic刺激構成に対する定位座標は、 表1に示すと図1（a）に模式的に示されている。

4。頭蓋骨に着床部位の調製

頭蓋骨内の各移植部位を確立するために0.5ミリメートルボールバリビットで高速歯科用ドリルを使用します。スクリューの挿入を容易にするために、0.7mmのボールバリビットを使用して、各ホールの外部余白を面取り。

5。カニューレ、EMGのリードおよびEEGリードの挿入と確保

脳波のねじ（長さが0.8ミリメートル、コーティングされていない3の2cmと挿入0ゲージの錫メッキ銅バスが穴に）頭をねじ込み、手でスロットにそれらを駆動するプリはんだ付けワイヤーは所望の深さを得るために約4-5回転を回し。アクリルセメントで頭蓋骨とアンカーに貼り付け後、定位カニューレホルダーのある場所で、ガイドカニューレを保持します。各ガイドカニューレは、開存性を維持するために、実験の時間（10〜14日）に手術の時からダミーカニューレ/スタイレットを（プラスチックの一つ、一部＃C312 DC \ 1）を含める必要があります。

6。手術部位を閉じる

一度脳波、ガイドカニューレは、頭蓋骨にある歯科アクリルセメント（ - オーソ·ジェットセメントラング歯科）と一緒になって結合して配置されている。セメントセットした後、乾燥したセメントマウンド上記プラスチックコネクタ（ピナクルテクノロジーの一部＃8402）を配置します。半田脳波リードからプラスチックコネクタの接点が発せられるワイヤの端。ワイヤー包むセメントにつながる。その後、項部筋肉をEMGの線を描くsは21ga針のバレルにそれらをスライドさせて筋肉を貫いた。彼らは筋肉を終了する場所のすぐ遠位これらのワイヤの周りに5から0ナイロン縫合糸の二重外科医の結び目を作る。逆カットP-3針と5から0ナイロン縫合糸を使用して、一緒に戻ってシングル割り込ま外科医の結び目と筋肉組織にアクセスするために撤回された皮膚を縫合。

7。術後鎮痛およびリカバリ

手術直後、抗炎症として（0.1 mg / kgの皮下）（0.1 mg / kgの皮下）鎮痛剤とフルニキシンメグルミンとしてブプレノルフィンを投与すると、毎日1から2日後に手術。動物は実験前に少なくとも7日間は標準のコロニーの住宅事情で回復することができます。標準コロニー住宅以外の追加の注意を払って、カニューレが所定の位置に固定留置スタイレットと、少なくとも2週間の特許を維持することが期待できる。脳波と筋電図センサも保持することが期待できるこの期間中に機能を提供します。

2。時限光パルスの生成

1。 MCの刺激ユニットのプログラミング

デスクトップコンピュータとのUSB接続を経由して、MC-刺激ユニット（マルチチャネル·システム）を接続します。 MCの刺激ユニットをプログラムするためのスプレッドシートのようなMC-刺激ユーザー·インターフェースを使用しています。上の期間のための望ましいTTL（トランジスタ·トランジスタ·ロジック）は、電圧、ピリオドオンとオフの刺激の持続時間は、目的の秒あたりのサイクル数と、全体の刺激セッションのための繰り返しサイクルの総数を入力します。詳細については、MC-刺激テクニカルマニュアルを参照してください：

3。光ファイバPrの製造/組立大脳皮質に光送達のためのOBE

1. 必要な物資や機器は、次のURLで参照されています： http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf
2. 切断および光ファイバケーブルの研磨。 http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdfは

4。げっ歯類のOptogenetic刺激システムの組み立て

1。 MC-刺激ユニットとレーザーのインターフェース

MC-刺激ユニットがプログラムされると、ON / OFF信号を5ボルトバイナリのスタンドアロン信号発生器としてそれを実行します。 BNCコネクタを備えたレーザーのTTL対応のパワーユニットに、MC-刺激ユニットを接続します。

2。光ファイバケーブルを介してレーザ出力を生成

マニュアルをデジタルディスプレイやレーザパワー·ユニットの変数出力ダイヤルを使ってLYは、レーザーの出力を調整します。リボンケーブルを介してレーザーにレーザー電源ユニットを接続します。女性のFC（フェルールコネクタ）光ファイバパッチケーブル（200μmの直径のガラス伝導繊維はアクリルポリマークラッド光反射に包まれた長さ3 m）のオスFCコネクタにレーザーの光ファイバアダプタを接続します。

3。ロータリーコミュテータ：動物にレーザーを伝える

2コリメートレンズ（ドーリア式レンズ）を包む光ファイバーロータリージョイントの両端に発信される光ファイバケーブル（長さ3m）と配信の光ファイバケーブルを（長さ45 cm）の接続します。光ファイバーロータリージョイントは、整流子としての役割を果たします。そのケージ約動物が移動すると、ロータリージョイントは、光ファイバケーブルの断線を防ぐため、回転させる。金属に貼付整流子にプラスチック·ケーブル·タイを使用して動物が収容された円筒状のケージの上に置か立つ。

4。配達光ファイバの取り付けヘッドへのケーブル

カップ状の手のひらの下にマウスをピン片手でマウスを抑制。オリエント実験の中間と人差し指で頭。光ファイバーカニューレのために配置ガイドカニューレからダミーカニューレを外します。無菌25ga針を用いてデブリのガイドカニューレをクリアします。手で光ファイバーケーブルを挿入して、ダミーカニューレから引き揚げスレッドスクリューキャップ付き光ファイバガイドカニューレに固定します。フラット切断端から一定の距離に、光ファイバケーブルで結ば縫合糸の結び目によって、脳内の光ファイバケーブルの挿入の深さを制御します。全体の実験装置は、 図1Bに示されています。

5。 Optogenetic刺激時の脳波に定義されたスリープと乳酸濃度の測定

1。乳酸センサのPrecalibration

乳酸センサの航海は 、 インビトロで行われるキット（ピナクルテクノロジー一部＃7000-K1-T）。センサーは、製造元のプロトコルごとに段階的にL-乳酸塩の3つの濃度にさらされて、液（pH7.4）リン酸緩衝生理食塩水で平衡化されています。

2。乳酸センサおよびEEGケーブルの挿入

光ファイバケーブルの挿入手順（セクション4.4）と同じ方法で、頭蓋骨に取り付けられた乳酸ガイドカニューレに事前に較正されたセンサを挿入します。バイポーラプラグコネ​​クタ付きピナクル8400バイオセンサのプリアンプに乳酸センサを接続します。外科的に埋め込まれたheadmountの8ピンコネクタにこのプリアンプを取り付けます。

3。 Optogenetic刺激強度を確立

データを収集する前に、optogenetic刺激の強度を調整するため、レーザ強度​​コントロールノブを使用しています。脳波応答の振幅は、体系的に研究されていない要因のために、動物の向こう側に異なるでしょう dは、刺激の開始時に目視により確認しなければなりません。実際には、80から120μWattsの強度は一般的に刺激の周波数で約50％の脳波の振幅の増加を生成します。事後高速フーリエ変換解析（5.5節を参照してください）​​応答の絶対的な大きさを定量化することが必要である。

4。データ収集

ピナクル8400システムを使用してデータを収集します。 http://pinnaclet.com/pal-8400.html 。

5。 Neuroscoreとデータ処理

：Neuroscoreインタフェース（DataSciences、インターナショナルと脳波と筋電図データの目視検査によってスリープ状態を分類http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.aspまたは海牛インタフェース（ピナクル技術）：F = "http://www.pinnaclet.com/sirenia.html"ターゲット= "_blank"> http://www.pinnaclet.com/sirenia.html）。覚醒、ノンレム睡眠、または脳波と筋電図に基づいて、レム睡眠のように10秒エポックのプロセスデータ。追加の分析と統計的検定のためにMicrosoft Excelスプレッドシートなどのデータを保存します。

結果

図2に示すように、 脳波、筋電図や脳乳酸濃度を連続的に監視している間optogenetic刺激と脳波/乳酸/ EMGデータ収集のために装備マウスは自発的睡眠/覚醒状態遷移を行った。乳酸センサーの電流は脳波の低振幅の期間中に増加し、脳波の高振幅の期間中に減少した。 図3に示すように、EEGの両方のチャネルが前頭皮質で配信optogenetic刺激に応答する。 <...

ディスカッション

方法は、1つは、以前は不可能タイムスケールで解糖中間体の乳酸の脳内濃度の睡眠と変化との関係を測定することができますここで紹介する。動物は、ウェイク、NREMSとレムの間で自然発生的な変遷を経る。さらに、我々は動物がこれらの遷移を経る間optogenetic刺激を適用することができます。データは、乳酸オキシダーゼベースのバイオセンサーの読み出しにその自発および誘発両波の影?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
コンポーネント	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
バシマウスガイドカニューレ	ピナクル技術/バシ株式会社	7032
乳酸バイオセンサー	ピナクルテクノロジー	7004
ヘッドマウント	ピナクルテクノロジー	8402
スリープ/バイオセンサー録画システム	ピナクルテクノロジー	8400-K1-SL	2チャネル脳波、筋電図バイオセンサ1チャネル、＆1
テザーマウスのin vitroキャリブレーションキット	ピナクルテクノロジー	7000-K1-T
光ファイバガイドカニューレ	プラスチック一	C312G	21ゲージガイドカニューレ
ダミーカニューレ	プラスチック一	C312DC	21ゲージのダミー
ダイヤモンドファイバースクリーブ	Thorlabs	S90W
光ファイバコネクタの圧着工具	Thorlabs	CT042
分岐チューブ	Thorlabs	FT030	03.0ミリメートル
	Thorlabs	T10S13	最大径。 0.012
分岐チューブストリッパー	Thorlabs	FTS3
裸のハードクラッドマルチモードファイバ	Thorlabs	BFL37-200	200μmコア、0.37 NA
ワイヤー切れ端/ケブラーばさみ	Thorlabs	T865
光ファイバエポキシ	Thorlabs	F112
ファイバーストリッパーツール	Thorlabs
ガラス研磨板	Thorlabs	CTG913
ゴム製研磨パッド	Thorlabs	NRS913
アイルーペ	Thorlabs	JEL10
キムワイプ	Thorlabs	KW32
圧縮空気	Thorlabs	CA3
研磨パック	Thorlabs	D50-XX
ファイバースコープ検査	Thorlabs	CL-200
研磨フィルム	Thorlabs	LFG5P、LFG3P、LFG1P、LFG03P
FC / PCコネクタ·エンド	Thorlabs	30126G2-240	240μmの内径は、SSフェルール
MCの刺激部本体	マルチチャネル·システム	STG-4002
MCのスティミュラス·ソフトウェア	マルチチャネル·システム	MC-スティミュラスV 2.1.5
青色レーザー	CrystaLaser	CL473-050から0
レーザ電源	CrystaLaser	CL2005
光ファイバーロータリージョイント	ドリス式レンズ	FRJ-V4
			表2消耗品と備品。