Recoger y medir los mediadores bioquímicos exudado de la herida en heridas quirúrgicas

Resumen

En este artículo se ofrece una descripción detallada y visual de una metodología para la recogida y medición de mediadores bioquímicos inflamatorios y nociceptivos en el sitio de la herida quirúrgica después de un parto por cesárea. Este bioensayo humano se ha utilizado para determinar las correlaciones entre la herida y las concentraciones séricas de citoquinas y fármaco mediada por los cambios en la herida citoquinas, quimioquinas y neuropetides.

Resumen

Se describe un método por el que somos capaces de recoger y medir bioquímicos mediadores inflamatorios y nociceptivos en el sitio de la herida quirúrgica. Recopilación de sitios específicos marcadores bioquímicos es importante entender la relación entre los niveles en suero y herida quirúrgica, determinar las posibles asociaciones entre la liberación de mediadores, dolor, uso de analgésicos y otros resultados de interés, y evaluar el efecto de la administración sistémica de fármacos y periférico en la herida quirúrgica bioquímica. Esta metodología se ha aplicado a las mujeres sanas sometidas a cesárea electiva con anestesia espinal. Hemos medido exudado de la herida y mediadores de suero en los intervalos de tiempo que las puntuaciones de dolor del paciente y el consumo de analgésicos por hasta 48 horas post-parto por cesárea. Usando esta metodología hemos sido capaces de detectar diferentes mediadores bioquímicos, incluyendo el factor de crecimiento nervioso (NGF), la prostaglandina E2 (PG-E2) sustancia P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFa, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 y MIP-1β. Los estudios que aplican este bioensayo humana herida quirúrgica no han encontrado correlaciones entre la herida y las concentraciones séricas de citoquinas o su perfil de tiempo de liberación (J Pain 2008;. 9 (7) :650-7) ¹ También documentado la utilidad de la técnica de identificar. mediadas por la droga cambios en el contenido herida citoquinas (Anesth Analg 2010; 111:1452-9). ²

Introducción

Después de una incisión quirúrgica, residente y migración de las células inflamatorias liberan citoquinas pro-y anti-inflamatoria, prostanoides, neuropéptidos y quimiocinas que son importantes para iniciar y mantener el dolor. ^3,4 La posibilidad de recopilar específicas del sitio marcadores bioquímicos es crítico para determinar la relación entre los niveles en suero de la herida quirúrgica y, comprender la compleja relación entre la liberación de mediadores y dolor quirúrgico, y para ser capaz de evaluar el efecto de tanto sistémica como la administración del fármaco periférico en la bioquímica de la herida quirúrgica. Los estudios se han centrado en las mediciones sistémicos de mediadores bioquímicos y no han considerado específica del sitio de liberación. ^5,6 mediciones séricos de citocinas y quimiocinas no puede ser el reflejo de los eventos locales de heridas quirúrgicas y bioquímicos sólo indican una respuesta sistémica global a la lesión quirúrgica. Este artículo proporciona una descripción visual detallada y única de esta metodología que fue first referencia en 2008 en el Journal of Pain. ¹ El objetivo de este artículo JoVE es proporcionar una descripción única y mejorada visualmente de los métodos.

Protocolo

1. Protocolo de estudio

• Obtener la aprobación del Comité de Revisión Institucional y el consentimiento informado por escrito.
• Seleccione una población apropiada para la conducta quirúrgica estudio. Esta metodología sólo se ha aplicado a las heridas de parto por cesárea, pero las heridas quirúrgicas más sería apropiado.
• Considerar los criterios de inclusión y exclusión para su participación en el estudio. Los pacientes y los procedimientos con altas tasas de infección de la herida quirúrgica no puede ser apropiado.
• Estandarizar anestesia y postoperatorio de los pacientes para evitar posibles factores de confusión.

2. Colección Bioquímica mediador inflamatorio y nociceptivo

• Inserte el PainBuster ON-Q con ON-Q SilverSoaker (I-Flow, Lake Forest, CA) en la capa subcutánea justo antes de cierre de la herida (las otras capas de tejido puede ser considerado). El ON-Q Pain PainBuster de alivio del sistema suministra continuamente solución salina normal a una velocidad de 2 ml / h. El vehículo puede ser peineINED o con respecto a los medicamentos de interés, tales como un anestésico local y no esteroides antiinflamatorios.
• Incorporar un estándar de llave de tres vías en este sistema para permitir la aspiración de exudado de la herida en puntos de tiempo especificados. La infusión continua impide que el catéter se coagule y se mejora la fiabilidad del sistema para producir muestras de exudado. Si la aspiración de exudado es difícil (aproximadamente 5% de los casos), considere empujando suavemente encima de la herida, el cambio de la posición del sujeto (por ejemplo, el paciente sentado o acostado ellos plana), utilizando un 0.5-1 ml de solución salina al ras normal o la retirada de la catéter 1-2 cm.
• En los puntos de tiempo especificados por el protocolo (por ejemplo, 1, 4, 6, 24, y 48 horas después del parto por cesárea), aspirar y retirar 1 ml de exudado de la herida. Transferir el exudado en un vaso de polietileno que contiene 30 l de inhibidor de la proteinasa. Hemos utilizado inhibidor de proteinasa Complete (Roche Bioscience, Palo Alto, CA) para nuestros propósitos.
• En los mismos intervalos de tiempo especificados por el protocolo de estudio, recoger 10 ml de sangre. Hemos utilizado un tubo de recogida de sangre que contiene heparina de litio, en nuestra institución se trata de un tubo de vidrio con tapa de color verde. Añadir un adicional de 300 l de inhibidor de proteinasa en las muestras de sangre.
• Dentro de 1 hora de la recogida, poner las muestras en hielo y centrifugar a 3.000 rpm durante 10 min.
• Retire el suero y sobrenadante herida y colocar en un tubo de microcentrífuga estándar y almacenar a -20 ° C.

3. Ensayo de análisis

• Una vez que todo el exudado estudio y las muestras de suero se recogen y almacenan, descongelar y analizar las muestras al mismo tiempo.
• Hemos medido las citocinas y quimiocinas usando un inmunoensayo múltiplex. El múltiplex inmunoensayo técnica nos permite ensayo de analitos numerosas pequeñas muestras de volumen (50 l). El múltiplex producir resultados comparables con los obtenidos con ELISA. Hemos utilizado el 17-plex Bio-PlexTM sistema (BioRad, Hercdulos, CA) para nuestro análisis. Este ensayo es capaz de medir el factor de necrosis tumoral α (TNF), interferón α (INFα), interleucina 1β (IL-1β), interleucina 2 (IL-2), interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5 ), interleucina 6 (IL-6), interleucina 7 (IL-7), interleucina 8 (IL-8), interleucina (IL-10), interleucina 12 (IL-12), interleucina 13 (IL-13), interleucina 17 (IL-17), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), granulocitos y macrófagos, factor estimulante de colonias (GM-CSF), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1) y la proteína inflamatoria de macrófagos 1 (MIP-1β). Factor de crecimiento nervioso se midió con NGF DY256 anticuerpo mediante la adición a la placa de 17-plex con el kit de amina Bio-Plex acoplamiento.
• Para garantizar el análisis de buena calidad, cada medición debe hacerse por duplicado. Las curvas de calibración para cada analito se generan mediante el uso de analitos de referencia suministrados por el fabricante (en concentraciones de 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3.200 pg / ml, másun nivel cero para la solución salina normal). Las curvas de calibración se incluyen en cada ejecución y concentraciones de la muestra se calculó con el software de Administrador de Bio-Plex.
• La sustancia P y la prostaglandina E2 se midieron usando kits de ELISA altamente sensibilidad. Hemos utilizado Ensayo Designs, Inc. (Ann Arbor, Michigan) para este análisis. Realizar el análisis por duplicado de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

Resultados

Usando esta metodología hemos sido capaces de detectar todos los mediadores bioquímicos descritos anteriormente con la excepción de IL-5 en el exudado de la herida y plasma. ^1,2 Algunos citoquinas adicionales no se detectaron en plasma (IL-4, IL-17, TNFa, INFγ , GM-CSF). ¹ El curso temporal de citocinas y quimiocinas medidos en los estudios informados fueron consistente, alcanzando una meseta dentro de las primeras horas que se mantuvo durante el período de observación de 24 horas .. ^1,2...

Discusión

Esta metodología esbozada se ha encontrado para ser lo suficientemente sensible como para detectar bioquímicas mediadores inflamatorios y nociceptivos en el exudado de la herida. El muestreo en diferentes puntos de tiempo también nos ha permitido observar los cambios de estos mediadores en el tiempo. ^1,2 No tenemos conocimiento de ningún otro ensayo humano herida quirúrgica que en serie puede medir el perfil de liberación de mediadores inflamatorios y nociceptivos en exudado de la herida quirúrgica. Lo...