手術創内に創傷滲出液生化学メディエーターの収集と測定

要約

この記事では、帝王切開後に手術創傷部位での炎症性および生化学的な侵害受容性メディエーターを収集し、測定するための方法論の詳細と視覚的な説明を提供しています。この人間のバイオアッセイは、創傷および血清サイトカイン濃度および創傷サイトカイン、ケモカインおよび神経ペプチドにおける薬剤性の変化との相関関係を決定するために使用されています。

要約

我々は、我々が手術創傷部位での炎症性および生化学的な侵害受容性メディエーターを収集し、測定することができますそれによって方法論を記述する。部位特異的な生化学的マーカーを収集すると、血清中および手術創内のレベル間の関係を理解するメディエーター放出、痛み、鎮痛剤の使用および関心のある他の転帰との関連付けを決定し、手術創に全身および末梢薬物投与の効果を評価することは重要である生化学。この手法は、脊椎麻酔による選択的帝王切開分娩を受けて健康な女性に適用されています。私たちは、患者の疼痛スコアと最大48時間後に帝王切開分娩のための鎮痛剤の消費量と同じ時間間隔で創傷滲出液および血清メディエーターを測定した。この方法論を使用して我々は、神経成長因子（NGF）、プロスタグランジンE2（PG-E2）のサブスタンスPは、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7など、様々な生化学メディエーターを検出することができましたIL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、TNFα、INFγ、G-CSF、GM-CSF、MCP-1およびMIP-1β。この人間の手術創バイオアッセイを適用した研究は、創傷および血清サイトカイン濃度またはその時間の放出プロファイルの間には相関関係は認められません（J疼痛^{2008;。9（7）:650-7）1}我々はまた、識別する手法の有用性を文書化した。薬剤媒介創傷サイトカイン量の変化（Anesth Analg 2010; ^{111:1452-9）。2}

概要

外科的切開した後、常駐し、移行炎症細胞が痛みを開始および維持するために重要であるプロと抗炎症性サイトカイン、プロスタノイド、神経ペプチドとケモカインを放出する^。3,4、サイト固有の生化学的マーカーを収集する能力を決定することが重要です血清および手術創内のレベル間の関係は、メディエーター放出と術後疼痛との間の複雑な関係を理解し​​、手術創生化学上の両方​​の全身および末梢薬剤投与の効果を評価できるようにする。研究は、生化学的メディエーターの全身測定に焦点を当てていると、サイト固有のリリースは考慮していません。サイトカインおよびケモカインの^5,6血清測定値が局所手術創生化学的事象を反映するものとだけ外科的損傷へのグローバルな全身反応を示さないことがあります。この記事では、モミだったこの方法論の詳細とユニークな視覚的な説明を提供しています痛みのジャーナルで2008年に参照聖^1は、このJoveの記事の目的は、メソッドのユニークで視覚的に強化された説明を提供することです。

プロトコル

1。研究プロトコル

• 治験審査委員会の承認と書面によるインフォームドコンセントを取得します。
• 研究実施のための適切な外科的集団を選択します。この方法論は、帝王切開の傷に適用されているが、ほとんどの手術の傷は適切でしょう。
• あなたの研究参加のための包含と除外の基準を考慮してください。手術創感染率の高い患者と手順は適切でないかもしれません。
• 潜在的な交絡因子を避けるために、すべての患者のための麻酔および術後管理を標準化します。

2。侵害受容性および炎症性メディエータ生化学コレクション

• 閉鎖（他の組織層が考えられる）を巻か直前に皮下層に、ON-Q SilverSoaker（I-フロー、レイクフォレスト、カリフォルニア州）でON-Q PainBusterを挿入します。 ON-Q PainBusterの痛みを軽減するシステムが継続的に2ミリリットル/ hの速度で生理食塩水を提供します。キャリアは櫛することができますとinedまたはそのような局所麻酔薬および非ステロイド性抗炎症薬のような目的の薬に比べて。
• 指定された時点で創傷滲出液の吸引を可能にするためにこのシステムに標準の三方活栓を組み込んでいる。連続注入、凝固からカテーテルを防止し、滲出液サンプルを生成するために、システムの信頼性を向上させます。滲出液の吸引が困難な場合（例約5％）、傷の上にそっと押す（ 例えば 、患者が座ったりが平らに横たわって）被写体の位置を変え、0.5〜1ミリリットル生理食塩水フラッシュを使用するか、撤退を検討カテーテル1〜2センチメートル。
• プロトコル（ 例えば 、1、4、6、24、帝王切開分娩48時間後）で指定された時点で、創傷滲出液の1ミリリットルを吸引し、撤退する。プロテイナーゼインヒビターの30μlを含むポリエチレンカップに滲出液を移す。我々は、我々の目的のために完全なプロテイナーゼ阻害剤（バイオサイエンスロシュ、パロアルト、CA）を使用しています。
• 治験実施計画書で指定された同じ時間間隔で、血液の10ミリリットルを収集します。我々は、リチウムヘパリンを含む採血管を使用していた、我々の施設で、これは緑で覆われたガラス管である。血液サンプルにプロテイナーゼ阻害剤の追加の300μlを添加する。
• コレクションの1時間以内に、10分間3,000 rpmで氷と遠心分離機にサンプルを置く。
• -20℃での標準的なマイクロ遠心チューブや店舗における血清および創傷清と場所を削除する

3。アッセイ分析

• 一度すべての研究滲出および血清試料を収集し、保存、解凍し、同時にサンプルを分析しています。
• 我々は、マルチプレックスイムノアッセイを用いてサイトカインやケモカインを測定した。多重免疫アッセイ技術は、私たちは小さい（50μl）をボリュームサンプルから多数の検体をアッセイすることができます。マルチプレックスは、ELISA法を用いて得られたものと同等の結果を生成します。我々は17プレックスバイオPlexTMシステム（バイオラッド、ハークを使用していた我々の分析のためにULES、カリフォルニア州）。このアッセイは、腫瘍壊死因子α（TNFα）、インターフェロンα（INFα）、インターロイキン1β（IL-1β）、インターロイキン2（IL-2）、インターロイキン4（IL-4）、インターロイキン-5（IL-5を測定することが可能である）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン7（IL-7）、インターロイキン-8（IL-8）、インターロイキン（IL-10）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン13（IL-13）、インターロイキン17（IL-17）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、単球走化性タンパク質-1（MCP-1）、マクロファージ炎症性タンパク質（MIP-1β）。神経成長因子は、Bio-Plexのアミンカップリングキットと17-プレックスのプレートを追加することで、NGF DY256抗体を用いて測定した。
• 良い品質の分析を確実にするために、各測定が重複してなされるべきである。各分析対象成分の標準曲線は（0.20の濃度で、0.78、3.13、12.5、50、200、800、3200 pg / mlのプラスメーカーによって供給される基準の検体を使用して生成され生理食塩水はゼロ標準）。標準曲線は、各ランに含まれており、試料濃度は、Bio-Plexのマネージャーソフトウェアで計算されます。
• サブスタンスPおよびプロスタグランジンE2は非常に感度のELISAキットを用いて測定した。我々は、この分析のためにアッセイデザイン社（アナーバー、ミシガン州）が使用されています。メーカーの仕様によると、二重に分析を実行します。

結果

この方法論を使用して、我々は、創傷滲出液および血漿中のIL-5の例外を除いて上記のすべての生化学メディエーターを検出することができました^。1,2いくつかの追加のサイトカインが（TNFα、IL-4、IL-17、、血漿中では検出されなかったINFγ 、GM-CSF）。報告された研究で測定されたサイトカインおよびケモカインの¹時間コースでは、24時間の観察期間持続した最初の数時間以内...

ディスカッション

上記のこの方法は、創傷滲出液生化学的炎症と侵害受容性メディエーターを検出するのに十分な感度であることが判明している。各種の時点でのサンプリングはまた、私たちは時間をかけてこれらのメディエーターの変化を観察することができました^。1,2は、我々 ^は逐次外科創傷滲出液における炎症と侵害受容性メディエーターの放出プロファイルを測定する他のどの人間?...