Collecte et de mesure des médiateurs biochimiques exsudat de la plaie Dans Plaies chirurgicales

Résumé

Cet article fournit une description détaillée et visuelle d'une méthodologie de collecte et de mesure biochimiques médiateurs inflammatoires et nociceptifs au site de la plaie chirurgicale suite à une césarienne. Ce bio-essai humain a été utilisé pour déterminer les corrélations entre la plaie et les concentrations de cytokines sériques et médicaments médiées par des changements dans la plaie cytokines, des chimiokines et neuropetides.

Résumé

Nous décrivons une méthode par laquelle nous sommes en mesure de recueillir et de mesurer biochimiques médiateurs inflammatoires et nociceptifs au site de la plaie chirurgicale. Collecte spécifiques au site marqueurs biochimiques est important de comprendre la relation entre les niveaux de sérum de blessure et chirurgicaux, déterminer les associations entre la libération des médiateurs, la douleur, l'utilisation d'analgésiques et d'autres résultats d'intérêt, et d'évaluer l'effet de l'administration systémique de médicaments et périphérique sur la plaie chirurgicale biochimie. Cette méthodologie a été appliquée à des femmes en bonne santé subissant une césarienne élective sous rachianesthésie. Nous avons mesuré l'exsudat et les médiateurs de sérum dans les mêmes intervalles de temps que les scores de douleur du patient et de la consommation des analgésiques pour un maximum de 48 heures après l'accouchement par césarienne. Grâce à cette méthodologie, nous avons été capables de détecter divers médiateurs biochimiques, y compris le facteur de croissance des nerfs (NGF), la prostaglandine E2 (PG-E2) de la substance P, l'IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNF, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 et MIP-1β. Les études appliquant le présent essai biologique plaie chirurgicale humaine n'ont trouvé aucune corrélation entre la plaie et les concentrations de cytokines sériques ou de leur temps de diffusion du profil (J Pain 2008;. 9 (7) :650-7) ¹ Nous avons également documenté l'utilité de la technique à identifier. médicament à médiation changements dans le contenu des cytokines plaie (Anesth Analg 2010; 111:1452-9). ²

Introduction

Après une incision chirurgicale, résidents et migrateurs cellules inflammatoires libèrent des cytokines pro-et anti-inflammatoires, prostanoïdes, les neuropeptides et de chimiokines qui sont importants pour l'initiation et le maintien de la douleur. ^3,4 La capacité de recueillir spécifiques au site marqueurs biochimiques est essentiel de déterminer la relation entre le niveau de la plaie chirurgicale et le sérum, de comprendre la relation complexe entre la libération de médiateurs et de la douleur chirurgicale, et d'être en mesure d'évaluer l'effet à la fois systémique et l'administration du médicament périphérique sur la biochimie des plaies chirurgicales. Les études ont porté sur des mesures systémiques de médiateurs biochimiques et n'ont pas tenu compte spécifique au site de libération. ^5,6 mesures sériques de cytokines et de chimiokines peuvent ne pas refléter des événements locaux plaies chirurgicales biochimiques et indiquent seulement une réponse systémique globale d'une blessure chirurgicale. Cet article fournit une description détaillée et visuelle unique de cette méthodologie qui a été sapinst référencé en 2008 dans le Journal of Pain. ¹ Le but de cet article est JoVE de fournir une description unique et visuellement amélioré des méthodes.

Protocole

1. Protocole d'étude

• Obtenir l'approbation du Conseil institutionnel Donnez votre avis et consentement éclairé écrit.
• Choisissez une population chirurgicale appropriée pour la conduite des études. Cette méthodologie a été appliquée qu'à des plaies d'accouchement par césarienne, mais la plupart des blessures chirurgicales serait approprié.
• Tenir compte des critères d'inclusion et d'exclusion pour votre participation à l'étude. Les patients et les procédures des taux élevés d'infection de la plaie chirurgicale peut ne pas être approprié.
• Normaliser l'anesthésie et prise en charge postopératoire pour tous les patients à éviter les facteurs de confusion potentiels.

2. Nociceptive et inflammatoires Collection médiateur biochimique

• Insérez le PainBuster ON-Q avec ON-Q SilverSoaker (I-Flow, Lake Forest, CA) dans la couche sous-cutanée juste avant de refermer la plaie (d'autres couches de tissu peut être considéré). Le Système ON-Q PainBuster Pain Relief délivre en continu une solution saline normale à un débit de 2 ml / h. Le support peut être peigneminé avec ou par rapport à des médicaments d'intérêt comme un anesthésique local et un non-stéroïdiens anti-inflammatoires.
• Intégrer une norme robinet à trois voies dans ce système pour permettre l'aspiration des exsudats de la plaie à des moments spécifiés. La perfusion continue empêche la coagulation du cathéter et améliore la fiabilité du système pour produire des échantillons d'exsudat. Si l'aspiration de l'exsudat est difficile (environ 5% des cas), pensez à pousser doucement au-dessus de la plaie, en changeant la position du sujet (par exemple, le patient assis ou allongé jusqu'à leur plat), en utilisant un chasse 0,5-1 ml sérum physiologique ou le retrait de la cathéter 1-2 cm.
• À des moments spécifiés par le protocole (par exemple, 1, 4, 6, 24, et 48 h après l'accouchement par césarienne), aspirer et retirer 1 ml de exsudat de la plaie. Transfert de l'exsudat dans une cupule en polyéthylène contenant 30 pl d'inhibiteur de protéinase. Nous avons utilisé protéinase complet (Bioscience Roche, Palo Alto, CA) pour nos besoins.
• Aux mêmes intervalles de temps spécifiés par le protocole de l'étude, de recueillir 10 ml de sang. Nous avons utilisé un tube de prélèvement sanguin contenant de l'héparine de lithium; dans notre établissement il s'agit d'un tube de verre vert au sommet. Ajouter un supplément de 300 pl d'inhibiteur de la protéinase dans les échantillons de sang.
• Dans 1 heure de la collecte, mettre des échantillons sur la glace et centrifuger à 3000 tours par minute pendant 10 minutes.
• Retirer le sérum et le surnageant de la plaie et dans un microtube standard et conserver à -20 ° C.

3. Analyse test

• Une fois que toutes les exsudats étude et des échantillons de sérum sont collectées et stockées, décongeler et analyser les échantillons en même temps.
• Nous avons mesuré les cytokines et de chimiokines en utilisant un immunodosage multiplexe. Le multiplex immuno-essai technique nous permet de doser des analytes multiples à partir de petits échantillons de volume (50 pi). Le multiplex produire des résultats comparables à ceux obtenus avec la méthode ELISA. Nous avons utilisé le 17-plex bio-PlexTM système (BioRad, Herculesdules, CA) pour notre analyse. Ce dosage est capable de mesurer le facteur de nécrose tumorale α (TNF), l'interféron α (INFα), l'interleukine 1β (IL-1β), interleukine 2 (IL-2), l'interleukine 4 (IL-4), l'interleukine 5 (IL-5 ), l'interleukine 6 (IL-6), l'interleukine 7 (IL-7), l'interleukine 8 (IL-8), l'interleukine (IL-10), l'interleukine 12 (IL-12), l'interleukine 13 (IL-13), interleukine 17 (IL-17), le facteur stimulant les colonies de granulocytes (G-CSF), le facteur de colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF), protéine chimio-attractive des monocytes 1 (MCP-1) et protéine inflammatoire des macrophages 1 (MIP-1β). Facteur de croissance nerveuse a été mesurée avec le NGF DY256 anticorps en l'ajoutant à la plaque 17-plex avec le kit Bio-Plex amine couplage.
• Pour garantir une analyse de bonne qualité, chaque mesure doit être effectuée en double. Courbes d'étalonnage pour chaque analyte sont générées en utilisant des analytes de référence fournis par le fabricant (à des concentrations de 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3.200 pg / ml plusune norme zéro pour la solution saline normale). Les courbes d'étalonnage sont inclus dans chaque série et concentrations des échantillons sont calculées avec le logiciel de gestion de placements Bio-Plex.
• La substance P et la prostaglandine E2 ont été mesurées à l'aide de sensibilité hautement Kits ELISA. Nous avons utilisé Assay Designs, Inc (Ann Arbor, Michigan) pour cette analyse. Effectuer l'analyse en double exemplaire selon les spécifications du fabricant.

Résultats

Grâce à cette méthodologie, nous avons été en mesure de détecter tous les médiateurs biochimiques décrites ci-dessus, à l'exception de l'IL-5 dans exsudat de la plaie et le plasma. ^1,2 Certaines cytokines supplémentaires n'ont pas été détectés dans le plasma (IL-4, IL-17, TNF, INFγ , GM-CSF). ¹ L'évolution dans le temps de cytokines et de chimiokines mesurées dans les études signalés correspondaient, pour atteindre un plateau dans les premières heures qui ont ét...

Discussion

Cette méthodologie décrite ci-dessus a été jugée suffisamment sensibles pour détecter biochimiques médiateurs inflammatoires et nociceptifs dans exsudat de la plaie. L'échantillonnage à divers points de temps nous a également permis d'observer l'évolution de ces médiateurs au fil du temps. ^1,2 Nous ne sommes pas au courant d'aucun autre essai blessure humaine chirurgicale qui peut en série mesurer le profil de libération de médiateurs inflammatoires et nociceptifs dans exsudat d...