Coleta e medição de mediadores bioquímicos feridas exsudato em feridas cirúrgicas

Resumo

Este artigo fornece uma descrição detalhada e visual de uma metodologia de coleta e medição bioquímicos mediadores inflamatórios e nociceptivos no local da ferida cirúrgica após cesariana. Este bioensaio humano tem sido usado para determinar a correlação entre a ferida e concentrações de citocinas no soro e de drogas mediadas mudanças na ferida citocinas, quimiocinas e neuropetides.

Resumo

Nós descrevemos uma metodologia pela qual somos capazes de recolher e medir bioquímicos mediadores inflamatórios e nociceptivos no local da ferida cirúrgica. Coleta de site-specific marcadores bioquímicos é importante para entender a relação entre os níveis de soro e ferida cirúrgica, determinar quaisquer associações entre a liberação do mediador, dor, uso de analgésicos e outros resultados de interesse, e avaliar o efeito da administração da droga sistêmica e periférica da ferida operatória bioquímica. Esta metodologia foi aplicada a mulheres saudáveis ​​submetidos a cesariana eletiva com raquianestesia. Nós medimos exsudato da ferida e mediadores séricos em intervalos de tempo iguais pontuações paciente da dor e consumo de analgésicos por até 48 horas pós-parto cesariana. Utilizando esta metodologia, foram capazes de detectar vários mediadores bioquímicos, incluindo factor de crescimento do nervo (NGF), a prostaglandina E2 (PG-E2) substância P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFa, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 e MIP-1β. Estudos que aplicam este bioensaio ferida cirúrgica humano foi encontrado nenhum correlações entre ferida e concentrações séricas de citocinas ou seu perfil de liberação de tempo (J Dor 2008;. 9 (7) :650-7) ¹ Nós também documentou a utilidade da técnica para identificar. drogas mediadas por alterações no conteúdo de citocinas ferida (Anesth Analg 2010; 111:1452-9). ²

Introdução

Depois de uma incisão cirúrgica, residente e migração de células inflamatórias liberam citocinas pró-e anti-inflamatórias, prostanóides, neuropéptidos e quimiocinas, que são importantes para a iniciação e manutenção da dor. ^3,4 A capacidade de recolher-site marcadores bioquímicos específicos é essencial para determinar o relação entre os níveis no soro e da ferida cirúrgica, compreender a complexa relação entre a libertação de mediadores e dor cirúrgica, e para ser capaz de avaliar o efeito de ambos sistémica e administração da droga periférica sobre a bioquímica da ferida cirúrgica. Estudos têm-se centrado em medidas sistêmicas de mediadores bioquímicos e não considerou site-specific lançamento. ^5,6 medições séricos de citocinas e quimiocinas podem não ser reflexo de eventos locais de feridas cirúrgicas bioquímicos e apenas indicam uma resposta sistémica global a lesão cirúrgica. Este artigo fornece uma descrição detalhada e visual único da metodologia que foi abetoSão referenciados em 2008 no Journal of Pain. ¹ O objetivo deste artigo JoVE é fornecer uma descrição única e visualmente melhor dos métodos.

Protocolo

1. Protocolo de estudo

• Obter a aprovação do Conselho de Revisão Institucional e consentimento informado por escrito.
• Selecione uma população adequada cirúrgico para condução do estudo. Esta metodologia tem sido somente aplicado em feridas cesarianas mas as feridas cirúrgicas seria mais apropriada.
• Considerar os critérios de inclusão e exclusão de sua participação no estudo. Pacientes e procedimentos com altas taxas de infecção da ferida cirúrgica não pode ser apropriado.
• Padronizar anestesia e pós-operatório para todos os pacientes, para evitar potenciais fatores de confusão.

2. Colecção Mediador nociceptiva e inflamatória Bioquímica

• Inserir o PainBuster ON-Q com ON-Q SilverSoaker (I-Flow, de Lake Forest, CA) para dentro da camada subcutânea imediatamente antes de fecho de feridas (camadas de tecido podem ser consideradas outras). O ON-Q PainBuster sistema proporciona o alívio da dor continuamente solução salina normal a uma taxa de 2 ml / h. O transportador pode ser penteINED ou comparado com medicamentos de interesse, tais como um anestésico local e não-esteróides anti-inflamatórios.
• Incorporar uma torneira de três vias padrão para este sistema para permitir a aspiração de exsudado da ferida em pontos de tempo especificados. A infusão contínua impede que o cateter de coagulação e melhora a fiabilidade do sistema para a produção de amostras de exsudato. Se a aspiração de exsudado é difícil (a cerca de 5% dos casos), considere empurrando suavemente acima da ferida, alterando a posição do sujeito (por exemplo, o paciente sentado ou deitado eles se plana), utilizando uma descarga 0,5-1 ml de solução salina normal ou a retirar o centímetros cateter 1-2.
• Em pontos de tempo especificados pelo protocolo (por exemplo, 1, 4, 6, 24, e 48 h após a cesariana), aspirar e retirar 1 ml de exsudado da ferida. Transferir o exsudado dentro de um copo de polietileno contendo 30 ul de inibidor de proteinase. Temos usado inibidor de protease completa (Roche Bioscience, Palo Alto, CA) para nossos propósitos.
• Nos mesmos intervalos de tempo especificados pelo protocolo do estudo, recolher 10 ml de sangue. Nós usamos um tubo de coleta de sangue contendo heparina de lítio, em nossa instituição é um tubo de vidro verde com tampo. Adicionar um adicional de 300 ul de inibidor de proteinase em amostras de sangue.
• Dentro de 1 hora de recolha, colocar as amostras em gelo e centrifugar a 3000 rpm durante 10 min.
• Remover sobrenadante soro e ferida e colocar num tubo de microcentrífuga de padrão e armazenar a -20 ° C.

3. Análise ensaio

• Uma vez que todo o exsudado o estudo e as amostras de soro são colhidas e armazenadas, descongelar e análise das amostras ao mesmo tempo.
• Medimos as citocinas e quimiocinas, utilizando um imunoensaio multiplex. A técnica de multiplex de imuno-ensaio permite ensaio analitos a partir de numerosas pequenas amostras (50 ul) do volume. O multiplex produzir resultados comparáveis ​​com aqueles obtidos com ELISA. Temos utilizado o sistema de 17-Plex Bio-PlexTM (BioRad, HercEGRAS, CA) para nossa análise. Este ensaio é capaz de medir o factor de necrose tumoral α (TNFa), interferon α (INFα), interleucina 1β (IL-1β), interleucina 2 (IL-2), interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5 ), interleucina 6 (IL-6), interleucina 7 (IL-7), interleucina 8 (IL-8), interleucina (IL-10), interleucina 12 (IL-12), interleucina 13 (IL-13), interleucina 17 (IL-17), factor estimulante de colónias de granulócitos (G-CSF), de granulócitos-macrófagos factor estimulador de colónias (GM-CSF), proteína quimioatractiva de monócitos 1 (MCP-1) e uma proteína inflamatória de macrófagos (MIP-1β). Factor de crescimento do nervo foi medida com NGF anticorpo DY256 adicionando-o da placa de 17-plex com o kit de acoplamento de amina Bio-Plex.
• Para garantir a análise de boa qualidade, cada medição deve ser feita em duplicata. As curvas padrão para cada analito são gerados usando os analitos de referência fornecidos pelo fabricante (em concentrações de 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3200 pg / ml, maisum padrão de zero para a solução salina normal). As curvas padrão são incluídos em cada ensaio e as concentrações de amostra são calculadas com Bio-Plex Manager.
• A substância P e de prostaglandina E2 foram medidos utilizando kits de sensibilidade altamente ELISA. Temos usado Ensaio Designs, Inc. (Ann Arbor, Michigan) para esta análise. Realizar a análise em duplicado, de acordo com a especificação do fabricante.

Resultados

Utilizando esta metodologia, foram capazes de detectar todos os mediadores bioquímicos descritos acima com a excepção de IL-5 no exsudado da ferida e plasma. ^1,2 Algumas citocinas adicionais não foram detectados no plasma (IL-4, IL-17, TNFa, INFγ , GM-CSF). ¹ curso O tempo de citocinas e quimiocinas, medidos em estudos relatados foram consistentes, atingindo um patamar dentro das primeiras horas que foi mantida durante o período de observação de 24 horas .. ^1,2 No entanto, NGF au...

Discussão

Esta metodologia descrita acima foi encontrado para ser suficientemente sensível para detectar bioquímicos mediadores inflamatórios e nociceptiva no exsudado da ferida. A amostragem em vários pontos de tempo também permitiu observar mudanças de tais mediadores com o tempo. ^1,2 Não temos conhecimento de qualquer ensaio outra ferida cirúrgica humana que pode série medir o perfil de liberação de mediadores inflamatórios e nociceptivos em exsudato da ferida cirúrgica. Os resultados da nossa metodolog...