Identificación de los<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Transposón inserciones en tumores sólidos utilizando vinculador mediada por PCR

Resumen

Un método de identificación de conductores desconocidos de la carcinogénesis utilizando un enfoque imparcial se describe. El método utiliza el La Bella Durmiente Transposón como un mutágeno aleatorio dirigido a tejidos específicos. Mapeo genómico de inserciones de transposones que impulsan la formación de tumores identifica nuevos oncogenes y genes supresores tumorales

Resumen

Los análisis genómicos, proteómicos, transcriptómica y epigenómico de tumores humanos indican que hay miles de anomalías dentro de cada genoma del cáncer en comparación con el tejido normal correspondiente. Sobre la base de estos análisis es evidente que hay muchos conductores no descubiertos genéticas del cáncer ^1. Lamentablemente, estos conductores están ocultos dentro de un número mucho mayor de anomalías de pasajeros en el genoma que no contribuyen directamente a la formación de tumores. Otro aspecto del genoma del cáncer es que hay una considerable heterogeneidad genética dentro de similares tipos de tumores. Cada tumor pueden albergar diferentes mutaciones que proporcionan una ventaja selectiva para la formación de tumor ^2. Realización de una pantalla hacia delante imparcial genética en ratones proporciona las herramientas para generar tumores y analizar su composición genética, mientras que la reducción del fondo de mutaciones de pasajeros. La Bella Durmiente (SB) transposón sistema es uno de esos métodos ^3. El sistema utiliza SB móvil vectores (transposones) que se pueden insertar en el genoma de la enzima transposasa. Las mutaciones se limitan a un tipo específico de célula mediante el uso de un alelo condicional transposasa que se activa por la recombinasa Cre. Muchas líneas de ratón que expresan existen recombinasa Cre en tejidos específicos. Al cruzar una de estas líneas con el alelo transposasa condicional (por ejemplo, Lox-stop-Lox-SB11), el sistema SB se activa sólo en las células que expresan la recombinasa Cre. La recombinasa Cre extirpará una casete de tope que bloquea la expresión del alelo de la transposasa, activando de este modo mutagénesis de transposones en el tipo de célula designada. Una pantalla SB es iniciada por la cría de tres cepas de ratones transgénicos para que los ratones experimentales llevar un alelo condicional transposasa, un concatémero de transposones, y un alelo específico de tejido de recombinasa Cre. Estos ratones se dejaron envejecer hasta que se forman los tumores y se convierten moribundo. Los ratones son luegoADN genómico practicó la necropsia y se aísla de los tumores. A continuación, el ADN genómico se somete a enlazador mediada-PCR (LM-PCR) que resulta en la amplificación de loci genómicos que contienen un transposón SB. LM-PCR realizada en un solo tumor se traducirá en cientos de amplicones diferentes que representan a los cientos de loci genómicos que contienen inserciones de transposones en un solo tumor ^4. Las inserciones de transposones en todos los tumores son analizados y los sitios comunes de inserción (IIC) se identifican usando un método estadístico adecuado ^5. Los genes dentro de la CEI es muy probable que sea oncogenes o genes supresores de tumores, y se consideran los genes candidatos cáncer. Las ventajas de utilizar el sistema de SB para identificar genes candidatos cáncer son: 1) el transposón puede ser fácilmente localizado en el genoma, ya que su secuencia es conocida, 2) transposición se puede dirigir a casi cualquier tipo de célula y 3) el transposón es capaz de introduciendo al mismo tiempo de ganancia y pérdida de función de las mutaciones ^6. El following protocolo describe cómo diseñar y ejecutar una pantalla hacia delante genético utilizando el sistema de transposón SB para identificar genes candidatos cáncer (Figura 1).

Protocolo

1. Crianza y Envejecimiento de Animales Transgénicos

1. Seleccione las cepas de ratones transgénicos apropiados para su experimento. Un experimento típico se utilizan tres líneas transgénicas; una transposasa condicional del ratón, un ratón que alberga un concatémero de transposones, y un ratón que expresan la recombinasa Cre en las células que se cree que las células de origen para el cáncer deseada. Si el cáncer que está siendo modelado tiene una mutación conocida en un gran porcentaje de los pacientes puede ser deseable incluir esta mutación en el inicio. Ejemplos de estos "predisponentes" mutaciones incluyen Kras activados, TP53 dominantes negativos o un alelo Pten floxed. Mediante la adición de una mutación que predispone el modelo puede representar mejor el cáncer humano (véase 1.3). Transposasa Varios Bella Durmiente transposón y ratones están disponibles en el Instituto Nacional del Cáncer Ratón Repository ( http://mouse.ncifcrf.gov/ ).
2. Ratones raza transposasa condicionales con ratones portadores de los transposones de obtener eventualmente ratones homocigotos para ambos alelos si es posible. Raza descendencia homocigota para ratones que expresan la recombinasa Cre para generar sus triples ratones transgénicos experimentales (Figura 2). Nota: La obtención de ratones homocigotos no siempre es posible o ideal. Por ejemplo, p53 negativos ratones homocigotos dominantes son mucho más difíciles de criar que los ratones heterocigotos. Además, es útil para asegurarse de que las camadas seguir la genética mendeliana para confirmar que el método de obtención tiene éxito.
3. Si se utiliza un fondo predispuesto, ratones primera raza con la transposasa a ratones con el alelo de predisposición. Simultáneamente, los ratones de raza expresar Cre recombinasa a ratones portadores de los transposones. Crear ratones homocigotos para cada alelo, si es posible. Por último, criar la descendencia homocigota de los planes de mejoramiento dos anteriores para generar anim cuádruple transgénico experimentalals.
4. Además de los animales de experimentación, generar cohortes de control de ratones. El grupo de control normalmente consta de camada de la cría experimental que sólo heredan dos de los tres alelos (Figura 2). En el caso de un fondo predispuesto, ratones, incluyendo tres de los cuatro alelos también será necesario.
5. Monitorear los ratones experimentales y de control al día durante el desarrollo del tumor y / o moribundity. Sigue a tu animal de Atención Institucional y el empleo Comisión (IACUC) requisitos para la cría de animales. Además, es típico para determinar una edad en la que se va a sacrificar a un animal si no se ha convertido aún moribundo. Dieciocho meses es una edad típica en la que los ratones son sacrificados.

2. La necropsia de animales transgénicos

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Sure-Seal Inducción de Cámara	Brain Tree Científico	EZ-177
Criovial	BioExpress	C-3355-2
10% formalina tamponada	Sigma Aldrich	HT501128-4L

Reactivos Tabla 1. Necesario.

1. Cuando el ratón está moribundo o se ha llegado al final de la vida útil determinada, practicar la eutanasia en animales utilizando un CO ₂ cámara siguiendo las directrices de su IACUC. Generalmente, colocar al animal en una cámara de gas limpio, abrir el tanque de gas y ajustar el regulador a leer no más de 5 libras por pulgada cuadrada. Llene lentamente para minimizar la irritación nasal y ocular y la aversión al CO _2. Asegúrese de que el corazón del animal ya no late y no responde cuando se toca los ojos.
2. Vaporizador exterior de ratón sacrificado con 70% de etanol.
3. Coloque el ratón sobre una tabla necropsia y asegurar con pasadores de disección. Con unas tijeras und pinzas para abrir ratón y extraer los órganos. La determinación de los órganos que deben recogerse proyecto es dependiente. Sin embargo, se recomienda siempre para recoger el bazo y el hígado como estos órganos a menudo dar importante información sobre por qué el ratón estaba moribundo. También recoger el esternón para el análisis del potencial de médula ósea. Además, siempre es beneficioso para recoger cualquier órgano o tejido que parece anormal.
4. Tejidos y tumores que están recogidos deben ser dividida en cuatro secciones. Una sección se fija en 10% formalina tamponada durante 18 h seguido por 70% de etanol. Esta sección se puede utilizar para la tinción H & E y / o IHC. Las tres secciones restantes, que son generalmente de 50 a 100 mg de tamaño, son congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Éstos se pueden utilizar para el ADN, el ARN y el aislamiento de proteínas.
5. Tirar los pañuelos de la canal y el resto según las directrices de IACUC.

3. Aislamiento de ADN genómico de tumores

fuerte del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Proteína solución de precipitación	Qiagen	158910
Tampón de lisis celular	Qiagen	158906
Proteinasa K	Qiagen	158920
RNasa A	Qiagen	158924
Tampón TE	Promega	V6232

Reactivos Tabla 2. Necesario.

1. Finamente picada congelada la muestra de tumor (50 a 100 mg) utilizando una cuchilla de afeitar limpia.
2. Place picado tejido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 1 ml de tampón de lisis celular que contiene 5 l de proteinasa K solución (20 mg / ml).
3. Vortex a fondo.
4. Incubar en un 55 ° C agitador regulado a 250 rpm durante al menos 4 horas, preferentemente durante la noche.
5. Añadir 1 l de RNasa A una solución (10 mg / ml) y se invierte el tubo 25 veces.
6. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
7. Enfriar a temperatura ambiente colocando en hielo durante 3 min.
8. Añadir 333 l solución de precipitación de proteínas y agitar vigorosamente.
9. Centrifugar a 14.000 rpm 10 min. Las proteínas deben pellet. Si pellet es muy pequeña, de nuevo vórtice, incubar en hielo durante 5 min, y luego volver a centrifugar.
10. Vierta el ADN que contiene sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio 15 ml.
11. Añadir un volumen igual de isopropanol 100% y mezclar invirtiendo suavemente 50 veces.
12. Centrifugar a 3.500 rpm durante 3 min.
13. Desechar el sobrenadante.
14. Añadir 1 ml de etanol al 70% y se invierte tubo varias veces para lavar el sedimento.
15. Transferir el sedimento lavado junto con el etanol a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
16. Centrifugar a 14.000 rpm durante 5 min a 4 ° C.
17. Se retira etanol y se invierte el tubo se seque al aire (aproximadamente de 5 a 30 min).
18. Resuspender el ADN pellet en 50 a 500 l de TE dependiendo del tamaño del precipitado de ADN.
19. Opcional incubación a 37 ° C para resuspender el ADN.
20. Almacenar a 4 ° C, o -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo.

4. Enlazador mediada-PCR genómico utilizando ADN de los tumores

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
BFAI	New England Biolabs	R0568S
NlaIII	New England Biolabs	R0125S
MinElute placas de 96 pocillos	Qiagen	28051
QIAvac 96 Vacuum manifold	Qiagen	19504
Múltiples microplaca Genie, 120V	Scientific Industries, Inc.	SI-4000
ADN ligasa de T4 con tampón de ligación 5x	Invitrogen	15224-041
BamHI	New England Biolabs	R0136S
25 mM de dNTPs	BioExpress	C-5014-200
Platinum Taq	Invitrogen	10966-034
FastStart Taq ADN polimerasa	Roche	12032929001
Agarosa	Promega	V3121
Tampón TAE	Promega	V4271
Tampón TE	Promega	V6232
El bromuro de etidio	Promega	H5041

Reactivos Tabla 3. Necesario.

Secuencias de engarce

BFAI enlazador + 5 'GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC 3'

BFAI enlazador-5 'Phos-TAGTCCCTTAAGCGGAG 3'NH2

"> Enlazador NlaIII + 5'GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGACCATG 3 '

NlaIII enlazador-5 '-Phos GTCCCTTAAGCGGAGCC 3'

Primer secuencias

Primaria PCR directo lado derecho (NlaIII): Spl IRDR R1 1 GCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCC

Primaria PCR adelante del lado izquierdo (BFAI): Spl IRDR L1 1 CTGGAATTTTCCAAGCTGTTTAAAGGCACAGTCAAC

Primaria inversa PCR para el lado de la derecha y la izquierda: Spl Link1 1 GTAATACGACTCACTATAGGGC

Secundario lado derecho de PCR directo: Ejemplo de un código de barras secundario Illumina cebador 5 'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaGgtgtatgtaaacttccgacttcaa (la de la N representan el código de barras 12 pb, la secuencia en mayúsculas se requieren para la plataforma Illumina, y la secuencia en minúsculas se unirá al transposón.)

Secundaria PCR adelante del lado izquierdo: Ejemplo de un código de barras de segunda Illuminadary 5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaAgtgtatgtaaacttccgacttcaa cebador (la de la N representan el código de barras 12 pb, la secuencia en mayúsculas se requieren para la plataforma Illumina, y la secuencia en minúsculas se unirá al transposón.)

Secundaria inversa PCR para el lado derecho e izquierdo: conector cebador anidado inversa 5 'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTAGGGCTCCGCTTAAGGGAC

1. Recocer el + y - enlazadores para ambos enlazadores bfai y enlazadores NlaII mediante la mezcla de 50 l de enlazador + (100 mM) con 50 l de enlazador-(100 M) y añadir 2 l de NaCl (5 M) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Lugar en 95 ° C del bloque de calor durante 5 min. Apagar bloque de calentamiento y dejar enfriar lentamente a temperatura ambiente (esto tarda una hora o más). Después de enfriar, los enlazadores recocidas puede ser almacenado en un congelador a -20 ° C hasta que se necesite.
2. Preparar dos alícuotas de la ADN del tumor, cada parte alícuota que contenía 1 mg de ADN. Una alícuota será digerido ingenioha enzima de restricción que corte cerca de la "derecha" fin del transposón. La segunda alícuota se digiere con una enzima de restricción que corta cerca de la "izquierda" fin del transposón. Esto se hace para maximizar las posibilidades de amplificar cada sitio de inserción del transposón.
3. Digerir el ADN del tumor en una alícuota con el "derecho" NlaII enzima lado, y digerir el ADN del tumor en la parte alícuota que utilice el lado "izquierdo" enzima BFAI: mezcle 1 l de enzima, 5 l Buffer 10x NEB # 4, ADN ( 1 g) y ddH ₂ O hasta un volumen total de 50 l. Digerir el ADN durante la noche a 37 ° C en baño de agua o incubadora.
4. Calentar inactivar enzimas (BFAI = 80 ° C durante 20 min, NlaIII = 65 ° C durante 20 min).
5. Limpiar las muestras digeridas por la colocación de muestras en MinElute placa de 96 pocillos, en lugar placa de colector de vacío y el vacío durante aproximadamente 15 min hasta que los pozos aspecto seco.
6. Retire la placa del distribuidor de vacío e inferior blot de placa de 96 pocillos con una toalla de papel para eliminar todo liquid
7. Añadir 30 l ddH ₂ O a cada pocillo y agitar en un conjunto agitador orbital a temperatura alta durante 2 min, o pipetear arriba y abajo de 20 a 40 veces.
8. Traslado volumen total en los pozos (30 l) de MinElute placa de 96 pocillos en placas de 96 pocillos limpios.
9. Realizar reacciones de ligación enlazador con el ADN digerido de la etapa 4,8 y enlazadores de paso 4,1. Mezclar 10 l de ADN digerido, 4 l tampón de ligación 5x, 5,5 enlazadores mu l recocido (950 g / l), 0,5 l ligasa de T4 (5 U / l).
10. Incubar durante 4 horas a toda la noche a 16 ° C.
11. Calentar inactivar la ligasa de ADN de T4 a 65 ° C durante 10 min.
12. Limpie la ligadura con MinElute placas de 96 pocillos y un colector de vacío como se describe en los pasos 4,5 hasta 4,6.
13. Resuspender en 30 l H ₂ O y traslado a un lugar limpio placa de 96 pocillos.
14. Realizar una segunda digestión del ADN con el fin de destruir restos concatémero transposones. Esto se consigue cortando el DNA una segunda vez usando una enzima que corta el plásmido vector ADN que se utilizó para crear los ratones transgénicos que contienen el transposón concatémero.
15. Digerir el ADN utilizando BamHI (lado izquierdo y derecho): Mezcla de 25 l de enlazador-ligated ADN de paso 4,13, 5 l tampón NEB 10x # 3, 0,5 l BamHI (20 U / l), 0,5 l de BSA (10 mg / ml ) y 19 l ddH ₂ O.
16. Recopilación de 3-6 horas o durante la noche a 37 ° C.
17. Realizar primaria PCR utilizando un cebador específico para el transposón y un cebador específico para el enlazador. Estos pueden variar dependiendo de lo que transposón y el enlazador está utilizando. Los cebadores enumerados en la tabla por encima de cebador de trabajo para el T2/Onc y transposones T2/Onc2.
18. PCR primaria: 5 l tampón 10x, 2,0 l de MgCl2 (50 mM), 4 dNTPs mu l (2,5 nM), 1 l Cebador 1 (20 mM), 1 l Cebador 2 (20 mM), 0,25 l Platinum Taq (5 U / l), 3 l de ADN digerido con enlazadores (cantidad puede variar), hasta 50 l ddH ₂ O.
19. Programa de PCR: 94 ° C durante 5 min, 30 ciclos de 94 ° C por 30 seg, 60 y dpor ejemplo, C por 30 seg, 72 ° C durante 90 sec. Extensión final a 72 ° C durante 5 min.
20. Limpiar producto de PCR usando MinElute placas de 96 pocillos y un colector de vacío como se describió anteriormente.
21. Resuspender en 30 l H ₂ O y traslado a un lugar limpio placa de 96 pocillos.
22. Hacer una dilución 1:75 de la 1 ° PCR mediante la dilución de 2 l de ADN de la etapa 148 en 4,21 l ddH O ₂
23. Realizar PCR secundaria utilizando versiones de los cebadores anidados que también tienen la secuencia requerida para la máquina Illumina GAIIx así como un código de barras de base 12 par que es única para cada muestra de tumor de procesado (véase la tabla anterior cebador para ejemplos de estos cebadores).
24. PCR secundaria: 10 l Tampón 10x con MgCl2, 8 mu l dNTPs (2,5 mM), 1 l Illumina código de barras cebador secundario (20 mM), 1 Nest Illumina 1 l cebador secundario (20 mM), 0,25 l de Taq FastStart (5 U / l ), 2 l de ADN primarios 1:75 PCR diluido, hasta 100 l ddH ₂ O.
25. Programa de PCR: 94 °; C durante 2 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 53 ° C durante 45 segundos, 72 ° C durante 90 segundos. Extensión final a 72 ° C durante 5 min.
26. Ejecutar 45 l de esta reacción de PCR en un gel de agarosa al 1% que contiene bromuro de etidio (0,5 mg / ml). Debe haber una "mancha" de los productos de PCR que representan a los amplicones de inserciones de transposones muchos diferentes en el tumor (Figura 3).
27. Limpiar restante 50 l de producto de PCR utilizando MinElute placas de 96 pocillos y un colector de vacío como se describió anteriormente. Lavar una vez utilizando 50 l ddH ₂ O en los pocillos y aspirar de nuevo.
28. Resuspender en 30 l de TE y transferir a una placa de 96 pocillos limpia.
29. Determinar la concentración de ADN en cada muestra. Combinar cantidades iguales de ADN en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Esta será la biblioteca que se secuenciaron en un solo carril de una máquina Illumina HiSeq 2000. Es posible secuencia de varios cientos de tumores en un solo carril de una ejecución de Illumina.
30. Presentarel único tubo que contiene cantidades iguales de ADN de todos los tumores para la secuenciación. Esto se puede hacer por su institución o comercialmente.

5. Análisis de inserciones de transposones

1. Software para el análisis de transposón inserción de datos está disponible para su descarga gratuita a través de SourceForge ( http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/ ). El programa, llamado Tapdance, requiere que el archivo de secuencia de la plataforma Illumina y un código de barras a un archivo de texto plano biblioteca.

Resultados

Después de que el método de obtención se ha establecido, los criadores deben producir una camada cada 19-21 días. Tamaño de la camada puede variar entre 5 y 12 crías, dependiendo de la edad de los criadores y el fondo genético. Además, asegúrese de que el genotipo de la camada siguiente genética mendeliana como una manera de confirmar que el método de obtención es a la vez correcta y exitosa.

Para el experimento para tener éxito, la incidencia de tumores en los animales experime...

Discusión

Una pantalla hacia delante genética utilizando la Bella Durmiente transposón sistema proporciona un método para la identificación de las mutaciones que causan cáncer. Mediante la selección del promotor apropiado para controlar la recombinasa Cre en adición a cualquier mutaciones que predisponen, la pantalla SB identificará conocidos y nuevos genes candidatos cáncer.

El éxito de una pantalla SB depende en gran medida de los ratones seleccionados para la creación d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Sure-Seal inducción Cámara	Brain Tree Científico	EZ-177
Criovial	BioExpress	C-3355-2
10% formalina tamponada	Sigma Aldrich	HT501128-4L
Proteína solución de precipitación	Qiagen	158910
Tampón de lisis celular	Qiagen	158906
Proteinasa K	Qiagen	158920
RNasa A	Qiagen	158924
Tampón TE	Promega	V6232
BFAI	New England Biolabs	R0568S
NlaIII	New England Biolabs	R0125S
MinElute placas de 96 pocillos	Qiagen	28051
QIAvac 96 Vacuum manifold	Qiagen	19504
Múltiples microplaca Genie, 120V	Scientific Industries, Inc.	SI-4000
ADN ligasa de T4 con tampón de ligación 5x	Invitrogen	15224-041
BamHI	New England Biolabs	R0136S
DNTPs 25 mM	BioExpress	C-5014-200
Platinum Taq	Invitrogen	10966-034
FastStart Taq ADN polimerasa	Roche	12032929001
Agarosa	Promega	V3121
Tampón TAE	Promega	V4271
Tampón TE	Promega	V6232
El bromuro de etidio	Promega	H5041