זיהוי<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; הוספות Transposon בגידולים מוצקים באמצעות PCR לינקר בתיווך

Summary

שיטה של ​​זיהוי נהגים לא ידועים של היווצרות הסרטן באמצעות גישה משוחדת מתוארת. השיטה משתמשת יפהפה נרדם Transposon כmutagen אקראי המכוונת לרקמות ספציפיות. מיפוי הגנום של הוספות transposon המניעות את היווצרות גידול מזהה אונקוגנים רומן וגני מדכאי סרטן

Abstract

ניתוח גנומי, proteomic, transcriptomic, וepigenomic של גידולים אנושיים מצביע על כך שיש אלף חריגות בתוך כל הגנום סרטן בהשוואה לרקמות מתאימות. בהתבסס על ניתוחים אלו ניתן לראות כי יש הרבה נהגים גנטיים ידועים של הסרטן ^1. למרבה צער הנהגים האלה חבויים בתוך מספר גדול בהרבה של אנומליות נוסע בגנום שלא תורם באופן ישיר להיווצרות גידול. היבט נוסף של הגנום של הסרטן הוא שקיימת הטרוגניות גנטית ניכרה בתוך סוגי גידולים דומים. כל גידול יכול נמל מוטציות שונות המעניקות יתרון סלקטיבי להיווצרות גידול ^2. ביצוע מסך גנטי קדימה משוחד בעכברים מספק את הכלים ליצירת גידולים ולנתח ההרכב הגנטי שלהם, תוך הפחתת רקע המוטציות נוסעות. היפיפייה נרדמת המערכת (SB) transposon היא שיטה אחת כזאת ^3. המערכת מנצלת SB הנייד vectors (transposons) שניתן להוסיף לאורך הגנום על ידי אנזים transposase. מוטציות מוגבלות לסוג תא מסוים באמצעות שימוש באלל transposase המותנה שמופעל על ידי Cre recombinase. קווי עכבר רבים קיימים שrecombinase המפורש Cre ברקמות ספציפיות. על ידי חצייה אחד מהקווים הללו לאלל transposase המותנה (למשל קס-stop-קס-SB11), מערכת SB מופעלת רק בתאים שמבטאים Cre recombinase. Cre recombinase יהיה בלו קלטת תחנה שחוסמת ביטוי של אלל transposase, הפעלת mutagenesis transposon בתוך סוג התא המיועד לכך. מסך SB הוא שיזם רביית שלושה זנים של עכברים מהונדסים כך שעכברי הניסוי לשאת אלל מותנה transposase, concatamer של transposons, ואלל recombinase Cre רקמות ספציפיות. עכברים אלה אפשרו לגיל ועד צורת גידולים והם הופכים גוססים. העכברים הם אזהדנ"א הגנומי necropsied ומבודד מהגידולים. בשלב הבא, הדנ"א הגנומי נתונת המקשר בתיווך-PCR (LM-PCR) כי תוצאות בהגברה של לוקוסים הגנומי המכילים SB transposon. LM-PCR בוצע על גידול חד יגרום למאה amplicons השונה המייצג את מאה לוקוסים הגנומי המכילים הוספות transposon ^ב4 גידול יחידים. הוספות transposon בכל הגידולים מנותחות ואתרי החדרה נפוצים (CISS) מזוהים באמצעות שיטה סטטיסטית מתאימה ^5. הגנים בתוך חבר העמים הם סבירים מאוד להיות אונקוגנים או גני מדכאי סרטן, והם נחשבים לגנים סרטניים מועמד. היתרונות של שימוש במערכת SB לזיהוי גנים סרטניים מועמדים הם: 1) transposon יכול בקלות להיות ממוקם בגנום בגלל הרצף שלו ידוע, 2) טרנספוזיציה יכולה להיות מופנה לכמעט כל סוג תא ו3) transposon מסוגל מציג גם רווח והפסד מוטציות-of-פונקצית ^6. Following הפרוטוקול מתאר כיצד לתכנן ולהוציא לפועל מסך קדימה גנטי באמצעות מערכת transposon SB לזיהוי גנים סרטניים מועמד (איור 1).

Protocol

1. גידול והזדקנות של בעלי חיים מהונדסים

1. בחר את הזנים של עכברים מתאימים לניסוי שלך מהונדסים. ניסוי טיפוסי יהיה להשתמש בשלושה קווים מהונדסים; עכבר מותנה transposase, עכבר מחסה concatamer של transposons, ועכבר מבטא Cre recombinase בתאים שסברו שהתאים מהמוצא לסרטן הרצוי. אם הסרטן שעצב יש מוטציה ידועה באחוז גדול מהחולים זה יכול להיות רצוי לכלול מוטציה זו בהתחלה. דוגמאות של מוטציות אלה "predisposing" כוללות Kras מופעל, TP53 השלילי דומיננטי או אלל PTEN floxed. על ידי הוספה במוטצית predisposing המודל טוב יותר עשוי לייצג סרטן בבני האדם (ראה 1.3). transposase כמה יפהפה נרדם ועכברי transposon זמינים ממכון הסרטן המאוס המאגר הלאומי (http://mouse.ncifcrf.gov/).
2. עכברי גזע מותנים transposase עם עכברי חסת transposons סופו של דבר להשיג עכברים הומוזיגוטים לשני אללים אם ניתן. גזע צאצאי הומוזיגוטים לעכברים המבטאים Cre recombinase לייצר עכברים הטרנסגניים הניסיוניים המשולשים (איור 2). הערה: עכברים הומוזיגוטים קבלה הם לא תמיד אפשריים או אידיאליים. לדוגמה, עכברים שליליים דומיננטיים הומוזיגוטים p53 הם הרבה יותר קשה מאשר לגדל עכברים הטרוזיגוטיים. בנוסף, כדאי לוודא שהמלטות לעקוב גנטיקת מנדליים כדי לאשר שתכנית הרבייה מוצלחת.
3. אם אתם משתמשים ברקע נטייה, גזע העכברים ראשונים עם transposase לעכברים עם אלל predisposing. במקביל, עכברי גזע מבטאים Cre recombinase לעכברים הנושאים את transposons. יצירת עכברים הומוזיגוטים לכל אלל אם זה אפשרי. לבסוף, יתרבה צאצאי הומוזיגוטים משני תוכניות הרבייה הקודמות ליצירה ניסיונית ינעימו מהונדס מרובעals.
4. בנוסף בניסויים בעכברים, ליצור קבוצות בקרה של עכברים. קבוצת הביקורת בדרך כלל מורכבת מהמלטה מהגידול הניסיוני שיורשות שניים משלושת אללים (איור 2) בלבד. במקרה של רקע נטייה, עכברים, כולל שלושה מתוך ארבעה אללים יהיו גם צורך בכך.
5. פקח על עכברי ניסוי ובקרה יומיומיים להתפתחות גידול ו / או moribundity. בצע טיפולך המוסדי בעלי החיים ושימוש בדרישות ועדה (IACUC) לגידול בעלי חיים. כמו כן, הוא אופייני לקביעת גיל שבו אתה מוכן להקריב בעלי חיים אם זה עדיין לא הפך גוסס. שמונה עשרה חודשים הם גיל אופייני שבי עכברים מורדמים.

2. נתיחה לאחר מוות של בעלי חיים מהונדסים

שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים
בטח-חותם Inducלשכת tion	מוח מדעי עץ	EZ-177
Cryovial	Bioexpress	C-3355-2
10% Buffered פורמלין	סיגמה אולדריץ	HT501128-4L

לוח 1. ריאגנטים הנדרשים.

1. כאשר עכבר הוא גוסס או שהגיע לסוף תוחלת החיים שנקבע, להרדים בעלי חיים באמצעות ₂ CO קאמרי בעקבות הנחיות IACUC. באופן כללי, הנח את החיה בתא גזים נקי, לפתוח את מכל הדלק ולהתאים את הרגולטור לקרוא לא עולה על 5 ק"ג לסנטימטר רבוע. מלא לאט כדי למזער את גירוי ואף וסלידה עיני לCO _2. ודא שלבו של בעל החיים פועם כבר לא ואינו מגיב כאשר נגע בעיניים.
2. ריסוס של עכבר חיצוני הקריב עם אתנול 70%.
3. מקום עכבר על לוח נתיחה לאחר מוות ולאבטח עם סיכות מנתחים. השתמש במספרייםד פינצטה כדי לפתוח את העכבר ולהוציא איברים. קביעה אילו איברים יש לאסוף היא פרויקט תלוי. עם זאת, מומלץ תמיד לגבות את הטחול ובכבד כאיברים אלה לעתים קרובות לתת תובנה חשובה למה העכבר היה גוסס. גם לאסוף עצם החזה לניתוח הפוטנציאל של מוח עצם. בנוסף, זה תמיד מועיל לאיסוף כל איבר או רקמה שמופיע חריג.
4. רקמות וגידולים שנאספו צריכות להיות מחולקות לארבעה חלקים. סעיף אחד קבוע ב10% נאגרו פורמלין תמורת 18 שעות אחריו אתנול 70%. סעיף זה יכול לשמש לצביעת H & E ו / או IHC. שלושת הסעיפים הנותרים, שהם בדרך כלל 50-100 מ"ג בגודל, הם צמד הקפוא בחנקן נוזלי. אלה יכולים לשמש לDNA, RNA ובידוד חלבון.
5. השלך רקמות גווייה ונותר על פי הנחיות IACUC.

3. בידוד הדנ"א הגנומי מגידולים

<שם> חזק של ריאגנט	חברה	מספר קטלוגים
פתרון רטיבות חלבון	Qiagen	158910
חיץ תמוגה תא	Qiagen	158906
Proteinase K	Qiagen	158920
RNase	Qiagen	158924
TE המאגר	Promega	V6232

טבלה 2. ריאגנטים הנדרשים.

1. דק לרכך מדגם גידול הקפוא (50-100 מ"ג), תוך שימוש בסכין גילוח נקי.
2. מקום טחון הרקמה בצינור microcentrifuge מ"ל 1.5 ולהוסיף 1 מ"ל של חיץ תמוגה תא המכיל פתרון 5 μl proteinase K (20 מ"ג / מ"ל).
3. מערבולת ביסודיות.
4. דגירה ב55 ° C ייקר להגדיר ב 250 סל"ד לפחות 4 שעות, רצוי למשך הלילה.
5. הוסף RNase μl פתרון 1 (10 מ"ג / מ"ל) ולהפוך 25 פעמי צינור.
6. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
7. מצנן לטמפרטורת חדר על ידי נחת על קרח 3 דקות.
8. הוסף פתרון 333 μl חלבון רטיבות ומערבולת במרץ.
9. צנטריפוגה בסל"ד 14000 10 דקות. חלבונים צריכים גלולים. אם גלולה היא, מערבולת קטנה מאוד שוב, לדגור על קרח למשך 5 דקות, ולאחר מכן מחדש צנטריפוגה.
10. יוצק את DNA המכיל supernatant לתוך צינור צנטריפוגות נקיה 15 מ"ל.
11. הוסף נפח שווה של 100% isopropanol ולערבב בעדינות 50 פעמי היפוך.
12. צנטריפוגה בסל"ד 3500 עבור 3 דקות.
13. בטל supernatant.
14. הוסף 1 מ"ל של אתנול 70% ולהפוך כמה פעמים בצינור כדי לשטוף את הגלולה.
15. להעביר את הגלולה השטופה יחד עם אתנול לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
16. צנטריפוגה בסל"ד 14000 למשך 5 דקות ב 4 ° C.
17. יוצק את אתנול ולהפוך לצינור אוויר יבש (כ 5 עד 30 דקות).
18. Resuspend DNA עמellet ב50-500 μl של TE תלוי בגודל של ה-DNA הגלולה.
19. דגירה אופציונלית על 37 מעלות צלזיוס לresuspend-DNA.
20. חנות ב 4 ° C, או -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.

4. DNA לינקר המתווך-PCR שימוש הגנום מגידולים

שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים
BfaI	ניו אינגלנד Biolabs	R0568S
NlaIII	ניו אינגלנד Biolabs	R0125S
MinElute 96 גם צלחות	Qiagen	28051
סעפת אבק QIAvac 96	Qiagen	19504
Multi-microplate Genie, 120V	תעשיות מדע, בע"מ	SI-4000
ligase DNA T4 עם מאגר הקשירה 5x	Invitrogen	15224-041
BamHI	ניו אינגלנד Biolabs	R0136S
25 מ"מ dNTPs	Bioexpress	C-5014-200
Taq פלטינום	Invitrogen	10966-034
DNA פולימראז תקי FastStart	רוש	12032929001
Agarose	Promega	V3121
TAE המאגר	Promega	V4271
TE המאגר	Promega	V6232
Ethidium רומיד	Promega	H5041

לוח 3. ריאגנטים הנדרשים.

רצפי לינקר

BfaI מקשר + 5 'GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC 3'

BfaI מקשר-5 'Phos-TAGTCCCTTAAGCGGAG 3'NH2

"> NlaIII מקשר + 5'GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGACCATG 3 '

NlaIII מקשר-5 'Phos-GTCCCTTAAGCGGAGCC 3'

רצפי פריימר

העיקרי PCR קדימה צד ימין (NlaIII): SPL IRDR R1 1 GCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCC

העיקרי PCR קדימה השאיר צד (BfaI): SPL IRDR L1 1 CTGGAATTTTCCAAGCTGTTTAAAGGCACAGTCAAC

הפך עיקרי PCR לצד ימין ושמאל: SPL Link1 1 GTAATACGACTCACTATAGGGC

PCR צד ימין קדימה משני: דוגמה לפריימר המשני המינימרקטים Illumina 5 'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaGgtgtatgtaaacttccgacttcaa (N מייצג את הברקוד של 12 נ"ב, רצף במקרה העליון נדרשים לפלטפורמת Illumina, והרצף באותיות קטנות יהיה לאגד את transposon.)

המשני PCR קדימה השאיר צד: דוגמה לsecon המינימרקטים Illuminaפריימר 5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaAgtgtatgtaaacttccgacttcaa dary (N מייצג את הברקוד של 12 נ"ב, רצף במקרה העליון נדרשים לפלטפורמת Illumina, והרצף באותיות קטנות יהיה לאגד את transposon.)

הפך משני PCR לצד ימין ושמאל: פריימר ההפוך המקונן מקשר 5 'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTAGGGCTCCGCTTAAGGGAC

1. Anneal + ו - linkers עבור שתי linkers BfaI וlinkers NlaII על ידי ערבוב של 50 μl מקשר + (100 מיקרומטר) עם 50 μl של מקשר-(100 מיקרומטר) ולהוסיף 2 NaCl μl (5 M) בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. מקום בבלוק 95 מעלות חום צלזיוס למשך 5 דקות. בטל בלוק חימום ולתת לאט מגניב לטמפרטורת חדר (זה לוקח כשעה או יותר). לאחר קירור, linkers annealed ניתן לאחסן במקפיא -20 ° C עד צורך.
2. להכין שני aliquots של ה-DNA, גידול כל aliquot המכיל 1 מיקרוגרם של ה-DNA. aliquot אחד יהיה מתעכל שנינותאנזים הגבלה חה שחתך קרוב לקצה "הנכון" של transposon. Aliquot השני יהיה מעוכל עם אנזים הגבלה שחותך קרוב לסוף "השמאלי" של transposon. הדבר זה נעשה על מנת למקסם את הסיכויים של הגברה כל אתר הכנסת transposon.
3. לעכל את ה-DNA הגידול בaliquot אחד באמצעות NlaII "הנכון" צד האנזים, ולעכל את ה-DNA הגידול בaliquot האחר באמצעות צד אנזים BfaI "השמאל": לשלב μl 1 של אנזים, # 4 הצפת NEB 10x μl 5, ה-DNA ( מיקרוגרם 1) וDDH ₂ O להיקף כולל של 50 μl. דנ"א דייג'סט הלילה על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים או חממה.
4. מחמם להשבית אנזימים (BfaI = 80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, NlaIII = 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות).
5. נקה את הדגימות מתעכלות על ידי נחת דגימות בצלחת גם MinElute 96, צלחת מקום בסעפת ואקום וואקום לכ 15 דקות עד שבארות להיראות יבשה.
6. הסרת צלחת מסעפת ואקום ותחתון כתם של צלחת גם 96 עם מגבת נייר כדי להסיר את כל LIQUIד
7. הוסף 30 μl DDH ₂ O לכל באר וללחוץ על סט מסלולית ייקר על גבוה עבור 2 דקות, או פיפטה מעלה ומטה 20-40 פעמים.
8. להעביר את כל נפח בבארות (30 μl) מהצלחת גם MinElute 96 ל96 גם צלחות נקיות.
9. לביצוע תגובות קשירה מקשרות עם דנ"א מתעכל מצעד 4.8 וlinkers מ שלב 4.1. מערבב 10 דנ"א μl מתעכל, 4 חיץ μl 5x קשירה, 5.5 linkers annealed μl (950 מיקרוגרם / μl), ligase T4 0.5 μl (5 U / μl).
10. דגירה במשך 4 שעות ללילה בגיל 16 ° C.
11. מחמם להשבית ligase DNA T4 על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
12. לנקות באמצעות קשירת MinElute 96 גם צלחות וסעפת ואקום כמתואר בשלבים 4.5-4.6.
13. Resuspend ב30 μl H ₂ O ולהעביר לצלחת גם נקיה 96.
14. בצע עיכול ה-DNA שני כדי להשמיד נותר transposons concatamer. זו מושגת על ידי חיתוך ה-DNA בפעם שנייה באמצעות אנזים שחותך v פלסמידדנ"א Ector ששמש כדי ליצור את העכברים הטרנסגניים מכילים transposon concatamer.
15. דייג'סט דנ"א באמצעות BamHI (צד ימין ומשמאל): מערבבים 25 μl של DNA מקשר-גבעול מצעד 4.13, חיץ 5 μl 10x NEB # 3, 0.5 BamHI μl (20 U / μl), 0.5 BSA μl (10 מ"ג / מ"ל ), ו 19 μl DDH ₂ O.
16. דייג'סט 3-6 שעות או לילה בשעת 37 ° C.
17. לבצע PCR הראשוני באמצעות פריימר ספציפי לtransposon וספציפי פריימר למקשר. אלה ישתנו בהתאם למה transposon ומקשר אתה משתמש. את פריימרים מפורטים בטבלה לעיל פריימר לעבודה T2/Onc וT2/Onc2 transposons.
18. PCR העיקרי: 5 החיץ μl 10x, 2.0 MgCl2 μl (50 מ"מ), 4 dNTPs μl (2.5 ננומטר), פריימר 1 μl 1 (20 מיקרומטר), פריימר 1 μl 2 (20 מיקרומטר), 0.25 μl פלטינום תקי (5 U / μl), 3-DNA μl מתעכל עם linkers (סכום עשוי להשתנות), עד 50 μl DDH ₂ O.
19. PCR תכנית: שניות 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורים של 94 ° C למשך 30, 60 & dלדוגמה: C למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות. סיומת סופית ב 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
20. לנקות את המוצר באמצעות PCR MinElute 96 גם צלחות וסעפת ואקום כמתואר לעיל.
21. Resuspend ב30 μl H ₂ O ולהעביר לצלחת גם נקיה 96.
22. הפוך דילול 1:75 של 1 ° PCR על ידי דילול 2 μl של דנ"א מהצעד 4.21 ל148 DDH ₂ O μl
23. לבצע PCR המשני באמצעות גרסות מקוננות של פריימרים שמכילים גם את הרצף הנדרש למכונת GAIIx Illumina כמו גם ברקוד זוג בסיס 12 שהוא ייחודי לכל דגימת גידול מעובד (ראה טבלה לעיל פריימר לדוגמאות של פריימרים האלה).
24. המשני PCR: 10 המאגר μl 10x עם MgCl2, 8 dNTPs μl (2.5 מ"מ), 1 Illumina μl המינימרקטים פריימר המשני (20 מיקרומטר), קן 1 μl Illumina 1 פריימר המשני (20 מיקרומטר), 0.25 μl FastStart Taq (5 U / μl ), 2-DNA μl מ1:75 מדוללים עיקריים PCR, עד 100 μl DDH ₂ O.
25. PCR תכנית: 94 מעלות, C עבור 2 דקות, 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 53 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 72 ° C למשך 90 שניות. סיומת סופית ב 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
26. הפעלת 45 μl תגובת PCR זה ב% agarose ג'ל המכיל 1 ethidium רומיד (0.5 מיקרוגרם / מ"ל). לא צריך להיות "כתם" של מוצרי PCR מייצגים amplicons של הוספות הרבות והשונות transposon בגידול (איור 3).
27. לנקות 50 μl הנותר של המוצר באמצעות PCR MinElute 96 גם צלחות וסעפת ואקום כמתואר לעיל. לשטוף פעם אחת על ידי הצבת 50 DDH ₂ O μl בבארות ולשאוב שוב.
28. Resuspend ב30 TE μl ולהעביר לצלחת גם נקיה 96.
29. לקבוע את הריכוז של ה-DNA בכל דגימה. שלב כמויות שווות של דנ"א בצינור microfuge אחת 1.5 מ"ל. זה יהיה הספרייה שמיצתה בנתיב יחיד של מכונת Illumina HiSeq 2000. ניתן רצף כמה מאה גידולים בנתיב אחד של ריצת Illumina.
30. להגישצינור יחיד המכיל כמויות שווות של DNA מכל הגידולים לריצוף. ניתן לעשות זאת על ידי המוסד שלך או באופן מסחרי.

5. ניתוח של הוספות Transposon

1. תוכנה לניתוח transposon הכנסת נתונים זמינה להורדה בחינם דרך SourceForge (http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/). התכנית, הנקראת TapDance, דורשת את קובץ הרצף מפלטפורמת Illumina וברקוד לקובץ טקסט מפת ספרייה.

תוצאות

לאחר תכנית הרבייה כבר נקבע, מגדלים צריכים לייצר המלטה כל 19-21 ימים. גודל המלטה משתנה בין 5 ל 12 גורים, בהתאם לגילו של המגדלים והרקע הגנטי. בנוסף, ודא שהגנוטיפ של ההמלטה כדלקמן גנטיקה המנדלית כדרך לאשר כי תכנית הרבייה היא גם נכונה ומוצלחת.

Discussion

מסך קדימה גנטי באמצעות המערכה היפיפייה הנרדמת transposon מספק שיטה לזיהוי מוטציות הגורמת לסרטן. על ידי בחירת האמרגן המתאים לשלוט Cre recombinase בנוסף לכל מוטציות predisposing, מסך SB יזהה ידוע וגנים סרטניים מועמד חדש.

ההצלחה של מסך SB היא ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
לשכת אינדוקציה-חותם בטוח	מוח מדעי עץ	EZ-177
Cryovial	Bioexpress	C-3355-2
10% Buffered פורמלין	סיגמה אולדריץ	HT501128-4L
פתרון רטיבות חלבון	Qiagen	158910
חיץ תמוגה תא	Qiagen	158906
Proteinase K	Qiagen	158920
RNase	Qiagen	158924
TE המאגר	Promega	V6232
BfaI	ניו אינגלנד Biolabs	R0568S
NlaIII	ניו אינגלנד Biolabs	R0125S
MinElute 96 גם צלחות	Qiagen	28051
סעפת אבק QIAvac 96	Qiagen	19504
Multi-microplate Genie, 120V	תעשיות מדע, בע"מ	SI-4000
ligase DNA T4 עם מאגר הקשירה 5x	Invitrogen	15224-041
BamHI	ניו אינגלנד Biolabs	R0136S
dNTPs 25mm	Bioexpress	C-5014-200
Taq פלטינום	Invitrogen	10966-034
DNA פולימראז תקי FastStart	רוש	12032929001
Agarose	Promega	V3121
TAE המאגר	Promega	V4271
TE המאגר	Promega	V6232
Ethidium רומיד	Promega	H5041