Identificação de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Inserções de transposões em tumores sólidos utilizando Linker mediada por PCR

Resumo

Um método de identificação de condutores desconhecidos da carcinogénese, utilizando uma abordagem imparcial é descrito. O método utiliza o A Bela Adormecida Transposon como um mutagéneo aleatória dirigida a tecidos específicos. Mapeamento genómico de inserções de transposões que conduzem a formação de tumores identifica novos oncogenes e genes supressores tumorais

Resumo

Genômica, proteômica análises, transcriptomic, e epigenômico de tumores humanos indicam que existem milhares de anomalias dentro de cada genoma do câncer em comparação com o tecido normal combinado. Com base nessas análises, é evidente que há muitos condutores não descobertas genéticas do câncer ^1. Infelizmente esses drivers estão escondidos dentro de um número muito maior de anomalias de passageiros no genoma que não contribuem diretamente para a formação de tumor. Outro aspecto do genoma do cancro é que existe uma grande heterogeneidade genética considerável dentro semelhantes tipos de tumores. Cada tumor pode abrigar mutações diferentes que proporcionam uma vantagem seletiva para a formação do tumor ^2. Realizando uma tela para a frente imparcial genética em ratos fornece as ferramentas para gerar tumores e analisar sua composição genética, além de reduzir o fundo de mutações de passageiros. The Sleeping Beauty (SB) sistema transposon é um tal método ^3. O sistema utiliza o SB móvel vectors (transposons) que pode ser inserido por todo o genoma da enzima transposase. As mutações são limitados a um tipo de célula específico através da utilização de um alelo de transposase condicional que é activado pela recombinase Cre. Existem muitas linhas de ratinhos que expressa recombinase Cre em tecidos específicos. Ao cruzar uma dessas linhas para o alelo transposase condicional (por exemplo, pára--Lox Lox-SB11), o sistema de SB é activado apenas nas células que expressam Cre recombinase. A recombinase Cre vontade extirpar uma cassete de batente, que bloqueia a expressão do alelo de transposase, activando assim a mutagénese transposon dentro do tipo de célula designada. Uma tela de SB é iniciada por meio de cruzamento três estirpes de ratinhos transgénicos de modo a que os ratinhos experimentais portadores de um alelo transposase condicional, um concatamer de transposões, e um tecido específico de alelo recombinase Cre. Estes ratos são autorizados a idade até se formarem tumores e tornam-se moribundos. Os ratos são entãoDNA genómico necropsiados e é isolado a partir de tumores. Em seguida, o ADN genómico é submetido a linker mediada-PCR (LM-PCR), que resulta em amplificação de loci genómicos contendo um transposon SB. LM-PCR realizada sobre um único tumor vai resultar em centenas de amplicons distintas, representando as centenas de loci genómicos contendo inserções de transposões em um único tumor ^4. As inserções de transposões, em todos os tumores são analisados ​​e locais de inserção comuns (CIS) são identificadas usando um método estatístico adequado ^5. Genes dentro da CEI são altamente susceptíveis de ser oncogenes ou genes supressores de tumores, e são considerados genes de cancro candidatas. As vantagens de utilizar o sistema de SB para identificar genes candidatos cancerosas são: 1) o transposão pode ser facilmente localizado no genoma, porque a sua sequência é conhecida, 2) a transposição pode ser dirigido para quase qualquer tipo de célula e 3) o transposon seja capaz de introdução simultânea de ganho e perda de função-mutações ^6. O following protocolo descreve a forma de conceber e realizar uma tela para a frente utilizando a genética SB sistema transposon para identificar genes candidatos cancro (Figura 1).

Protocolo

1. Reprodução e Envelhecimento de Animais Transgênicos

1. Selecione as linhagens de camundongos transgênicos adequadas para a sua experiência. Uma experiência típica vai usar três linhas transgénicas, um rato transposase condicional, um rato portador de um dos transposões concatamer, e um rato expressando recombinase Cre nas células crê serem as células de origem para o cancro desejado. Se o cancro a ser modelada tem uma mutação conhecida num grande percentagem dos pacientes, pode ser desejável incluir essa mutação no início. Exemplos desses "predisponentes" mutações incluem Kras ativados, dominantes TP53 negativas ou um alelo Pten floxed. Ao adicionar em uma mutação predisponente o modelo pode representar melhor o câncer humano (ver 1.3). Transposase Beleza vários ratos de dormir e de transposons estão disponíveis no Instituto Nacional de Câncer Rato Repository ( http://mouse.ncifcrf.gov/ ).
2. Camundongos da raça condicionais transposase com ratos, contendo os transposons para, eventualmente, obter camundongos homozigotos para ambos os alelos se possível. Breed descendência homozigótica para ratinhos que expressam Cre recombinase para gerar os seus triplos transgénicos ratinhos experimentais (figura 2). Nota: Obtenção de camundongos homozigotos nem sempre é possível ou ideal. Por exemplo, p53 homozigotos dominantes negativos ratos são muito mais difíceis de produzir do que os ratos heterozigotos. Além disso, é útil para assegurar que ninhadas seguir genética mendeliana para confirmar que o sistema de criação de animais é bem sucedido.
3. Se usar um fundo predispostos, os ratos da raça primeiro com a transposase de camundongos com o alelo de predisposição. Simultaneamente, os ratos da raça expressando a recombinase Cre ratinhos que transportam os transposons. Criar ratos homozigotos para cada alelo, se possível. Finalmente, produzir a prole homozigótica dos últimos dois esquemas de melhoramento para gerar quadruplicar anim experimental transgênicoals.
4. Além dos animais experimentais, gerar coortes de controlo de ratos. O grupo de controlo é normalmente constituída por ninhada do que apenas a reprodução experimental herdam dois dos três alelos (Figura 2). No caso de um fundo predispostos, incluindo ratos, três dos quatro alelos será também necessário.
5. Monitorar ratinhos experimentais e de controlo por dia durante o desenvolvimento do tumor e / ou moribundity. Siga o seu cuidado com os animais institucional e de uso da comissão (IACUC) requisitos para a criação de animais. Além disso, é típico para determinar uma idade em que você vai sacrificar um animal, se ele ainda não se tornou moribundo. Dezoito meses é uma idade típica em que os ratos são sacrificados.

2. Necropsia de Animais Transgênicos

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Sure-Seal InducCâmara ção	Cérebro Árvore Científico	EZ-177
Criotubo	Bioexpress	C-3355-2
Formol tamponado 10%	Sigma Aldrich	HT501128-4L

Reagentes Tabela 1. Necessário.

1. Quando um rato está moribundo ou atingiu o fim da vida útil determinado, eutanásia animal, usando uma câmara de ₂ CO seguindo suas diretrizes IACUC. Geralmente, colocar o animal em uma câmara de gás limpo, abrir o tanque de gás e ajustar o regulador de ler não superior a 5 libras por polegada quadrada. Encher lentamente para minimizar a irritação nasal e ocular e aversão ao CO _2. Certifique-se de que o coração do animal já não é bater e não responde quando tocado no olho.
2. Pulverização exterior de rato sacrificados com etanol a 70%.
3. Lugar do mouse em uma placa de necropsia e prenda com alfinetes de dissecação. Use a tesoura umd pinças para abrir o mouse e remover órgãos. Determinar que os órgãos devem ser coletados é o projeto dependente. No entanto, recomenda-se sempre coletar o baço e do fígado, como esses órgãos muitas vezes, dar uma visão importante porque o mouse estava moribunda. Também recolher o esterno para a análise de potencial de medula óssea. Além disso, é sempre vantajoso para recolher qualquer órgão ou tecido que aparece anormal.
4. Tecidos e tumores que são coletados deve ser dividido em quatro seções. Uma secção é fixado em formalina tamponada a 10% durante 18 horas seguido de 70% de etanol. Esta secção pode ser usada para coloração de H & E e / ou IHC. Os restantes três secções, as quais são geralmente 50 a 100 mg de tamanho, são de encaixe congelados em azoto líquido. Estes podem ser usados ​​para DNA, RNA e isolada de proteínas.
5. Dispor de tecidos da carcaça e restante de acordo com as diretrizes IACUC.

3. Isolar o ADN genómico a partir de tumores

<> Nome forte do reagente	Companhia	Número de catálogo
Solução Protein Precipitation	Qiagen	158910
Tampão de lise celular	Qiagen	158906
Proteinase K	Qiagen	158920
RNase A	Qiagen	158924
Tampão TE	Promega	V6232

Reagentes Tabela 2. Necessário.

1. Finamente tritura a amostra de tumor congeladas (50 a 100 mg), utilizando uma lâmina de barbear limpa.
2. Colocar o tecido triturado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 1 ml de tampão de lise de células, contendo 5 ul de solução de proteinase K (20 mg / ml).
3. Vortex completamente.
4. Incubar em 55 ° C Agitador ajustado a 250 rpm durante pelo menos 4 horas, de preferência durante a noite.
5. Adicionar 1 ml de RNase A solução (10 mg / ml) e inverter o tubo 25 vezes.
6. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
7. Arrefecer até à temperatura ambiente, colocando em gelo durante 3 min.
8. Adicionar 333 ul solução de precipitação de proteínas e vortex vigorosamente.
9. Centrifugar a 14.000 rpm 10 min. As proteínas devem pellet. Se é muito pequeno pellet de vórtice, de novo, incubadas em gelo durante 5 min, e em seguida, re-centrífuga.
10. Decantar o sobrenadante contendo ADN num tubo limpo de centrífuga de 15 ml.
11. Adicionar um volume igual de isopropanol a 100% e misturar suavemente por inversão 50 vezes.
12. Centrifugar a 3500 rpm durante 3 min.
13. Elimine o sobrenadante.
14. Adicionar 1 ml de etanol a 70% e inverter tubo várias vezes para lavar o sedimento.
15. Transferir o sedimento lavado juntamente com o etanol, para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
16. Centrifugar a 14.000 rpm durante 5 min a 4 ° C.
17. Verter o etanol e inverter o tubo de ar seco (cerca de 5 a 30 min).
18. Ressuspender DNA pEllet em 50 a 500 ul de TE, dependendo do tamanho do DNA de ressuspensão.
19. Incubação opcional a 37 ° C para voltar a suspender o DNA.
20. Armazenar a 4 ° C, ou -20 ° C para armazenamento a longo prazo.

4. Linker Mediada por PCR usando DNA genômico de Tumores

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
BfaI	New England Biolabs	R0568S
NlaIII	New England Biolabs	R0125S
MinElute placas de 96 poços	Qiagen	28051
QIAvac colector de vácuo 96	Qiagen	19504
Multi-microplaca Genie, 120V	Scientific Industries, Inc.	SI-4000
DNA-ligase de T4 com tampão de ligação 5x	Invitrogen	15224-041
BamHI	New England Biolabs	R0136S
25 mM de dNTPs	Bioexpress	C-5014-200
Taq Platinum	Invitrogen	10966-034
FastStart DNA polimerase Taq	Roche	12032929001
Agarose	Promega	V3121
Tampão TAE	Promega	V4271
Tampão TE	Promega	V6232
O brometo de etídio	Promega	H5041

Reagentes Tabela 3. Necessário.

Seqüências Linker

BfaI linker + 5 'GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC 3'

BfaI vinculador-5 'Phos-TAGTCCCTTAAGCGGAG 3'NH2

"> Linker NlaIII + 5'GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGACCATG 3 '

NlaIII linker-5 '-Phos GTCCCTTAAGCGGAGCC 3'

Seqüências de primers

Primária PCR frente lado direito (NlaIII): Spl IRDR R1 1 GCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCC

Primária PCR frente do lado esquerdo (BfaI): Spl IRDR L1 1 CTGGAATTTTCCAAGCTGTTTAAAGGCACAGTCAAC

Reversa PCR primário para o lado direita e esquerda: SPL Link1 um GTAATACGACTCACTATAGGGC

PCR secundário lateral direito para a frente: Exemplo de um iniciador de código de barras Illumina secundário 5 'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaGgtgtatgtaaacttccgacttcaa (A de N representa o código de barras 12 bp, a sequência em letras maiúsculas são necessários para a plataforma Illumina, e a sequência em letras minúsculas se ligará ao transposão.)

PCR secundário frente do lado esquerdo: Exemplo de um código de barras secon Illuminainiciador dary 5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaAgtgtatgtaaacttccgacttcaa (A de N representa o código de barras 12 bp, a sequência em letras maiúsculas são necessários para a plataforma Illumina, e a sequência em letras minúsculas se ligará ao transposão.)

Reversa PCR secundário para o lado direita e esquerda: primer aninhada vinculador reverso 5 'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTAGGGCTCCGCTTAAGGGAC

1. Hibridar a + e - ligantes para ambos os ligantes e linkers BfaI NlaII pela mistura de 50 ul de linker + (100 uM) com 50 ul de linker (100 uM) e adicionar 2 ul de NaCl (5 M), num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Lugar no bloco de aquecimento de 95 ° C durante 5 min. Desligue o bloco de aquecimento e deixar arrefecer lentamente até à temperatura ambiente (isto demora uma hora ou mais). Após o arrefecimento, os ligantes recozido pode ser armazenado num congelador a -20 ° C até ser necessário.
2. Preparar duas alíquotas do ADN do tumor, cada um contendo alíquotas de 1 ug de DNA. Uma alíquota será digerido witha enzima de restrição que vai cortar perto do fim "direito" do transposon. A segunda alíquota será digerido com uma enzima de restrição que corta perto da extremidade "esquerda" do transposão. Isto é feito para maximizar as chances de ampliar cada local de inserção do transposon.
3. Digerir o ADN do tumor em uma alíquota usando o "direito" NlaII enzima lado, e digerir o ADN do tumor no outro alíquota usando o "lado esquerdo" do lado enzima BfaI: combinar 1 ul de enzima, 5 ul de tampão NEB 10x # 4, DNA ( 1 ug) e DDQ ₂ O para um volume total de 50 ul. Digest de ADN durante a noite a 37 ° C em banho-maria ou incubadora.
4. Aquecer inactivar enzimas (BfaI = 80 ° C, durante 20 min, NlaIII = 65 ° C durante 20 min).
5. Limpar as amostras digeridas colocando as amostras em placas de 96 poços MinElute, colocar a placa no distribuidor de vácuo e de vácuo durante cerca de 15 min até poços aparência seca.
6. Retire a placa do colector de vácuo e inferior blot de placa de 96 poços com uma toalha de papel para remover todo o liquid
7. Adicionar 30 ul de DDH ₂ O a cada poço e agitar num agitador orbital em conjunto elevado durante 2 minutos, ou pipetar para cima e para baixo, 20 a 40 vezes.
8. Transferir volume total em poços (30 ul) de MinElute placa de 96 poços em placas de 96 poços limpos.
9. Realizar reacções de ligação com ligantes de ADN digerido a partir do passo 4.8 e ligantes a partir do passo 4.1. Misturar 10 uL de ADN digerido, 4 uL de tampão de ligação 5x, 5,5 ul de linkers recozido (950 ug / ul), 0,5 ul de ligase de T4 (5 U / uL).
10. Incubar durante 4 horas a durante a noite a 16 ° C.
11. Aquecer inactivar a ligase de ADN de T4 a 65 ° C durante 10 min.
12. Limpar ligadura MinElute usando placas de 96 poços e um colector de vácuo, tal como descrito nos passos 4,5-4,6.
13. Ressuspender em 30 ul _de H2O e transferir para uma placa de 96 limpa bem.
14. Realizar uma digestão do DNA segundo para destruir restante transposons concatamer. Isto é conseguido cortando o DNA de uma segunda vez usando uma enzima que corta o plasmídeo vector de ADN que foi usado para criar os ratinhos transgénicos que contêm o concatamer transposon.
15. Digest de DNA usando BamHI (lado esquerdo e direito): Mistura de 25 ul de DNA linker-ligado a partir do passo 4.13, 5 uL de tampão NEB 10x # 3, 0,5 ul BamHI (20 U / ul), 0,5 ul de BSA (10 mg / ml ), e 19 ul de DDH ₂ O.
16. Digest 3-6 horas ou durante a noite a 37 ° C.
17. Realizar PCR primário, utilizando um iniciador específico para o transposão específico e um iniciador para o linker. Estes irão variar dependendo do que transposon e vinculador você está usando. Os iniciadores indicados na tabela acima iniciador de trabalho para o T2/Onc e T2/Onc2 transposons.
18. Primário PCR: 5 ul de tampão 10x, 2,0 ul de MgCl2 (50 mM), 4 uL dNTPs (2,5 nM), 1 ul de iniciador 1 (20 uM), 1 ul de iniciador 2 (20 mM), 0,25 ul de Platinum Taq (5 U / ul), 3 uL de ADN digerido com ligantes (quantidade pode variar), até 50 ul DDH ₂ O.
19. Programa de PCR: 94 ° C por 5 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 60 & dpor exemplo, C durante 30 seg, 72 ° C durante 90 seg. Extensão final a 72 ° C durante 5 min.
20. Limpar PCR MinElute produto utilizando placas de 96 poços e um colector de vácuo, tal como descrito acima.
21. Ressuspender em 30 ul _de H2O e transferir para uma placa de 96 limpa bem.
22. Fazer uma diluição 1:75 do 1 ° PCR por diluição de 2 ul de DNA a partir do passo 4,21 em 148 uL DDH ₂ O
23. Realizar PCR secundária utilizando versões aninhados dos iniciadores que têm também a sequência necessária para a máquina GAIIx Illumina, bem como um código de barras 12 pares de bases que é único para cada amostra de tumor transformadas (ver tabela de primer acima para exemplos desses iniciadores).
24. Secundário PCR: 10 ul de tampão 10x com MgCl2, 8 uL dNTP (2,5 mM), 1 ul de código de barras Illumina iniciador secundário (20 uM), 1 ul Nest Illumina um iniciador secundário (20 uM), 0,25 ul FastStart Taq (5 U / uL ), 2 uL de ADN a partir de 1:75 primários de PCR diluído, até 100 ul DDH ₂ O.
25. Programa de PCR: 94 °; C durante 2 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 53 ° C durante 45 seg, 72 ° C durante 90 seg. Extensão final a 72 ° C durante 5 min.
26. 45 ul de executar esta reacção de PCR num gel de agarose a 1% contendo brometo de etídio (0,5 ug / ml). Deve haver uma "mancha" de produtos de PCR que representam amplicons das inserções de transposões muitos diferentes no tumor (Figura 3).
27. Limpar restante 50 ul de produto de PCR MinElute usando placas de 96 poços e um colector de vácuo, tal como descrito acima. Lavar uma vez colocando 50 ul DDH ₂ O nos poços e aspirar de novo.
28. Ressuspender em 30 ul de TE e transferido para uma placa de 96 limpa bem.
29. Determinar a concentração de ADN em cada amostra. Combinar iguais quantidades de DNA de um único tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Este será o da biblioteca que é sequenciado em uma única pista de um Illumina HiSeq 2000 máquina. É possível sequência de várias centenas de tumores em uma única pista de uma execução de Illumina.
30. Submetero único tubo que contém quantidades iguais de DNA de todos os tumores de sequenciação. Isto pode ser feito pela sua instituição ou comercialmente.

5. Análise de inserções de transposões

1. Software para análise de transposon inserção de dados está disponível para download gratuito através do SourceForge ( http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/ ). O programa, chamado TapDance, requer o arquivo de seqüência a partir da plataforma Illumina e um código de barras para biblioteca de arquivo de texto mapa.

Resultados

Após o regime de reprodução tiver sido estabelecida, os criadores devem produzir uma ninhada a cada 19-21 dias. Tamanho da ninhada pode variar entre 5 e 12 filhotes, dependendo da idade dos reprodutores e a base genética. Além disso, certifique-se de que o genótipo da ninhada segue genética mendeliana como uma forma para confirmar que o sistema de criação de animais é tanto correcta e bem sucedida.

Para a experiência de ser bem sucedido, a incidência do tumor nos animais experime...

Discussão

Uma tela para a frente genética utilizando o sistema Sleeping Beauty transposon fornece um método para identificar mutações que causam câncer. Ao seleccionar o promotor adequado para controlar a recombinase Cre para além de quaisquer mutações de predisposição, a tela SB identificará conhecidos e novos genes de cancro candidatas.

O sucesso de uma tela de SB é largamente dependente dos ratos seleccionados para criar a tela. Para o transposon, recomendamos o uso de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Seal-Claro Câmara de Indução	Cérebro Árvore Científico	EZ-177
Criotubo	Bioexpress	C-3355-2
Formol tamponado 10%	Sigma Aldrich	HT501128-4L
Solução Protein Precipitation	Qiagen	158910
Tampão de lise celular	Qiagen	158906
Proteinase K	Qiagen	158920
RNase A	Qiagen	158924
Tampão TE	Promega	V6232
BfaI	New England Biolabs	R0568S
NlaIII	New England Biolabs	R0125S
MinElute placas de 96 poços	Qiagen	28051
QIAvac colector de vácuo 96	Qiagen	19504
Multi-microplaca Genie, 120V	Scientific Industries, Inc.	SI-4000
DNA-ligase de T4 com tampão de ligação 5x	Invitrogen	15224-041
BamHI	New England Biolabs	R0136S
DNTPs 25mM	Bioexpress	C-5014-200
Taq Platinum	Invitrogen	10966-034
FastStart DNA polimerase Taq	Roche	12032929001
Agarose	Promega	V3121
Tampão TAE	Promega	V4271
Tampão TE	Promega	V6232
O brometo de etídio	Promega	H5041