の同定<em&gt;眠れる森の美女</emリンカ媒介PCRを用いた固形腫瘍&gt;トランスポゾン挿入

要約

公平なアプローチを用いて、発がんの未知のドライバを識別する方法が記載されている。この方法は、使用し眠れる森の美女トランスポゾン。腫瘍形成を駆動トランスポゾン挿入のゲノムマッピングは小説癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を特定

要約

ヒト腫瘍のトランスクリプトーム、プロテオーム、ゲノム、そしてepigenomic分析マッチさせた正常組織と比較してそれぞれの癌ゲノム内の異常の何千ものがあることを示している。これらの分析に基づいて、それが癌¹の多くの未知の遺伝子のドライバがあることは明らかである。残念なことに、これらのドライバは、直接腫瘍形成に寄与しないゲノムの乗客の異常数よりはるかに多くの中に隠されています。癌ゲノムの別の局面は、同様の種類の腫瘍内でかなりの遺伝的異質性があるということです。各腫瘍は、腫瘍形成²の選択的優位性を提供する様々な変異を抱くことができます。乗客変異の背景を削減しながら、マウスでの公平なフォワード遺伝子スクリーニングを実行すると、腫瘍を生成し、それらの遺伝子組成を分析するためのツールを提供します。 眠れる森の美女 （SB）トランスポゾンシステムは、そのような方法の一つは³である。 SBシステムは、携帯Vを利用トランスポザーゼ酵素によってゲノム全体に挿入することができectors（トランスポゾン）。突然変異は、Creリコンビナーゼによって活性化されている条件付きトランスポザーゼ対立遺伝子の使用によって特定の細胞型に限定されています。多くのマウス系統では、特定の組織に発現するCreリコンビナーゼが存在する 。条件トランスポザーゼ対立遺伝子（ 例えば LOX-ストップLOX-SB11）にこれらのいずれかの行を交配することにより、SBシステムのみ急行Creリコンビナーゼ細胞内で活性化されています。 Creリコンビナーゼは、消費税ストップカセットをすること、それによって指定されたセル·タイプ内トランスポゾン突然変異誘発を活性トランスポザーゼアレルのブロック式。実験用マウスは、条件付きトランスポザーゼ対立遺伝子、トランスポゾンのコンカテマー、組織特異的Creリコンビナーゼの対立遺伝子を運ぶようにSBの画面は、トランスジェニックマウスの3つの株を育種することによって開始される。これらのマウスは、腫瘍の形になるまで熟成させ、彼らは瀕死の状態になっています。マウスはその後アール解剖およびゲノムDNAは、腫瘍から分離されています。次に、ゲノムDNAは、SBトランスポゾンを含むゲノム遺伝子座の増幅の結果というリンカ媒介PCR（LM-PCR）に供される。単一の腫瘍に対して行わLM-PCRは、単一の腫瘍⁴トランスポゾン挿入を含むゲノム遺伝子座の数百を表す個別のアンプリコンの数百人になります。すべての腫瘍におけるトランスポゾンの挿入が分析され、共通の挿入部位（CISS）は、適切な統計的手法^5を使用^して識別されます。 CIS内の遺伝子は癌遺伝子や癌抑制遺伝子である可能性が高い、候補癌遺伝子と考えられている。候補の癌遺伝子を同定するためにSBシステムを使用する利点は次のとおりです、その配列は、2が知られているので、1）トランスポゾンを簡単に移調は、ほぼすべての細胞型に向け、3）トランスポゾンが可能であることができる）ゲノムに配置することができます利得および機能喪失型変異^6の両方を導入する。 followingのプロトコルが候補癌遺伝子（ 図1）を識別するために、SBトランスポゾンシステムを用いたフォワード遺伝子スクリーニングを考案し、実行する方法について説明します。

プロトコル

1。トランスジェニック動物の繁殖と老化

1. あなたの実験に適したトランスジェニックマウスの系統を選択します。条件トランスポザーゼマウス、トランスポゾンのコンカテマーを宿すマウス、および所望の癌の起源の細胞であると考えられて細胞でCreリコンビナーゼを発現するマウス、典型的な実験では、3つのトランスジェニック系統を使用します。モデル化されているがんが患者の大部分で、既知の変異を有している場合、それは起動時にこの変異を含むことが望ましい場合がある。これらの"素因"突然変異の例は、活性化KRAS、ドミナントネガティブTP53またはフロックス化PTEN対立遺伝子が含まれています。素因となる突然変異を追加することによってモデルが良い（1.3参照）、ヒトの癌を表すかもしれません。いくつかの眠れる森の美女のトランスポザーゼ及びトランスポゾンマウスは、米国国立がん研究所マウスリポジトリ（から入手可能であるhttp://mouse.ncifcrf.gov/ ）。
2. 最終的には可能であれば両方の対立遺伝子のホモ接合体マウスを得るために、トランスポゾンを宿すマウスと繁殖条件トランスポザーゼマウス。あなたの三重トランスジェニックマウスの実験（ 図2）を生成するためにCreリコンビナーゼを発現するマウスをホモ接合子孫を繁殖させる。注：ホモ接合体マウスを得るには、常に可能であるか、または理想的ではありません。たとえば、ホモ接合体p53のドミナントネガティブマウスははるかに困難ヘテロ接合体マウスより繁殖にしています。また、同腹の育種法が成功したことを確認するメンデル遺伝学に従っていることを確認しておくと便利です。
3. 素因の背景を使用している場合は、素因対立遺伝子を持つマウスにトランスポザーゼとの最初の品種マウス。同時に、品種マウスは、トランスポゾンを持つマウスにCreリコンビナーゼを発現している 。可能であれば、各アレルのホモ接合体マウスを作成します。最後に、四重トランスジェニック実験のanimを生成する前の2つの繁殖スキームからホモ接合性の子孫を繁殖させるALS。
4. 実験動物に加えて、マウスの対照コホートを生成します。対照群には通常、3つの対立遺伝子（ 図2）の2つを継承実験繁殖からの同腹子で構成されています。素因を背景の場合には、4対立遺伝子のうち3名を含むマウスも必要であろう。
5. 腫瘍の発生および/または瀕死の毎日の実験群と対照マウスを監視します。あなたの制度的動物のケアと畜産のための使用委員会（IACUC）の要件に従ってください。また、それはまだ瀕死になっていない場合は、動物を犠牲にする年齢を判断するのが一般的です。八ヶ月は、マウスを安楽死されるときの典型的な時代です。

2。トランスジェニック動物の剖検

試薬の名称	会社	カタログ番号
確実なシールインダクタンスる商工会議所	ブレインツリー·サイエンティフィック	EZ-177
クライオバイアル	Bioexpress	C-3355から2
10％緩衝ホルマリン	シグマアルドリッチ	HT501128-4L

表1に必要な試薬。

1. マウスが瀕死状態であるかを決定寿命の終わりに達したときは、動物実験委員会のガイドラインに従うと、CO ₂チャンバーを用いて動物を安楽死させる。一般的には、クリーンなガス室で動物を置くガソリンタンクを開き、平方インチ当たりのない高い5よりもポンドを読むためにレギュレータを調整します。 CO ₂に鼻および眼の刺激と嫌悪感を最小限に抑えるために、ゆっくりとご記入ください。動物の心臓が鼓動しなくなったし、目に触れたときに応答しないことを確認してください。
2. 70％エタノールで犠牲にマウススプレー外装。
3. 場所は剖検ボード上のマウスと解剖ピンで固定します。ハサミを使うdはピンセットマウスを開き、内臓を除去する。臓器を収集しなければならないかを決定することは、プロジェクトに依存しています。しかし、マウスが瀕死だった理由これらの臓器は、しばしば重要な洞察を与えるように常に脾臓と肝臓を収集することをお勧めします。また、骨髄の潜在的な分析のための胸骨を収集します。加えて、それは常に異常な表示される任意の臓器または組織を採取することは有益である。
4. 収集された組織と腫瘍は4つのセクションに分割する必要があります。 10％は70％エタノールに続く18時間緩衝ホルマリンで1つのセクションは固定されています。このセクションでは、H＆E染色および/またはIHCにも使用できます。一般的にサイズは50から100ミリグラムである残りの3つのセクションでは、液体窒素で瞬間凍結されています。これらは、DNA、RNAおよびタンパク質の単離のために使用することができます。
5. 動物実験委員会のガイドラインによると、カーカスと、残りの組織を廃棄してください。

3。腫瘍からゲノムDNAを単離する

<試薬のstrong>の名前	会社	カタログ番号
タンパク質沈殿ソリューション	キアゲン	158910
細胞溶解緩衝液	キアゲン	158906
プロテイナーゼK	キアゲン	158920
アーゼ	キアゲン	158924
TE緩衝液	プロメガ	V6232

表2に必要な試薬。

1. 細かくきれいにカミソリの刃を使って、フリーズした腫瘍サンプル（50〜100mg）をミンチ。
2. 場所は、1.5 mlのマイクロチューブに組織を細切し、5μlのProteinase K溶液（20 mg / ml）を含む細胞溶解緩衝液1mlを加える。
3. 徹底的にボルテックス。
4. ℃のシェーカーは、好ましくは一晩、少なくとも4時間、250rpmで55セットでインキュベートする。
5. 1μlのRNase溶液（10 mg / ml）を追加し、チューブを25回転倒。
6. 30分間37℃でインキュベートする。
7. 3分間氷上に配置することにより、室温まで冷却する。
8. 333μlのタンパク質沈殿溶液を、激しくボルテックスする。
9. 14,000 rpmで10分間遠心する。タンパク質は、ペレットべき。ペレットは再び非常に小さく、渦の場合は、5分間、再遠心し、氷上でインキュベートする。
10. 新しい15 ml遠心チューブに上清を含むDNAをオフに注ぐ。
11. 100パーセント等量のイソプロパノールを加え、穏やかに反転50倍に混ぜる。
12. 3分間3,500 rpmで遠心分離します。
13. 上清を捨てる。
14. 70％エタノール1 mlを加え、ペレットを洗浄するチューブを数回転倒。
15. 1.5 mlのマイクロ遠心チューブにエタノールと一緒に洗浄したペレットを転送します。
16. 4℃で5分間、14,000 rpmで遠心
17. エタノールを捨て、風乾（約5〜30分）にチューブを反転させる。
18. 再懸濁したDNA電話DNAペレットの大きさに応じてTEの50から500μl中エレト。
19. 37℃でインキュベーションオプショナル℃のDNAを再懸濁する。
20. 長期保存のため4℃または-20℃で保存。

4。腫瘍からのゲノムDNAを用いてリンカーを介する-PCR法

試薬の名称	会社	カタログ番号
BfaI	ニューイングランドバイオラボ	R0568S
NlaIII	ニューイングランドバイオラボ	R0125S
96ウェルプレートをMinElute	キアゲン	28051
QIAvac 96吸引マニホールド	キアゲン	19504
マルチマイクロプレート魔神、120V	サイエンティフィックインダストリーズ	SI-4000
5xのライゲーションバッファーでT4 DNAリガーゼ	インビトロジェン	15224-041
BamHIで	ニューイングランドバイオラボ	R0136S
25mMのdNTPを	Bioexpress	C-5014-200
プラチナTaqポリメラーゼ	インビトロジェン	10966-034
ファストスタートTaq DNAポリメラーゼ	ロッシュ	12032929001
アガロース	プロメガ	V3121
TAEバッファー	プロメガ	V4271
TE緩衝液	プロメガ	V6232
臭化エチジウム	プロメガ	H5041

表3に必要な試薬。

リンカー配列

BfaIリンカー+ 5 'GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC 3'

BfaIリンカ-5 'フォス-TAGTCCCTTAAGCGGAG 3'NH2

"> NlaIIIリンカー+ 5'GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGACCATG 3 '

NlaIIIリンカ-5 'フォス-GTCCCTTAAGCGGAGCC 3'

プライマー配列

一次PCR前方右側（NlaIII）：SPL IRDR R1 1 GCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCC

一次PCR前方左側（BfaI）：SPL IRDR L1 1 CTGGAATTTTCCAAGCTGTTTAAAGGCACAGTCAAC

左右両側のための一次PCRリバース：SPLリンク1 1 GTAATACGACTCACTATAGGGC

二次PCRフォワード右側：イルミナバーコード二次プライマー5 'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaGgtgtatgtaaacttccgacttcaaの例（Nさんは12 bpのバーコードを表し、大文字の中のシーケンスはイルミナのプラットフォームに必要であり、小文字のシーケンスは、トランスポゾンにバインドされます。）

イルミナseconのバーコードの例：二次PCRは、前方側を残したDARYプライマー5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaAgtgtatgtaaacttccgacttcaa（Nさんは12 bpのバーコードを表し、大文字の中のシーケンスはイルミナのプラットフォームに必要であり、小文字のシーケンスは、トランスポゾンにバインドされます。）

左右両側のための二次PCRの逆：リンカ入れ子になったリバースプライマーの5 'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTAGGGCTCCGCTTAAGGGAC

1. +をアニールすると - BfaIリンカーとNlaIIリンカーのリンカーリンカー - （100μM）50μlとリンカを50μl+（100μM）を混合することにより、1.5 mlのマイクロチューブに2μlのNaClを（5M）を追加します。 5分間95℃のヒートブロックに入れます。加熱ブロックをオフにして、（これは時間以上かかります）室温までゆっくり冷ます。必要になるまで冷却した後、アニールされたリンカーは、-20℃の冷凍庫で保存してもよい。
2. 腫瘍DNAの2つのアリコート、1μgのDNAを含む各アリコートを準備します。 1つのアリコートウィットを消化されるトランスポゾンの "右"端に近いカットされヘクタールの制限酵素。第二のアリコートは、トランスポゾンの "左"端に近い切断する制限酵素で消化されます。これは、すべてのトランスポゾン挿入部位を増幅する可能性を最大にするために行われます。
3. "右"側酵素NlaIIを使用して、1つのアリコート中の腫瘍DNAを消化し、 "左"側酵素BfaIを使用して他のアリコート中の腫瘍DNA消化：酵素を1μl、5μlの10×NEBバッファー＃4、DNAを（結合を1μg）を全量50μlにddH ₂ Oを。 37℃で一晩ダイジェストDNA℃の水浴またはインキュベーターのC。
4. 酵素を不活性化熱（BfaI = 80°Cで20分間、NlaIII = 65°Cで20分間）。
5. 井戸がドライに見えるまで約15分間吸引マニホールドと真空にMinElute 96ウェルプレート、場所プレートにサンプルを配置することによって、消化サンプルを清掃してください。
6. 真空マニホールドからプレートを取り外し、すべてのリキを削除するには、ペーパータオルで96ウェルプレートの底を吸い取るD
7. 各ウェルに30μlの蒸留H ₂ Oを加え、2分間でハイオービタルシェーカーセットに振る、または20〜40回ピペッティングします。
8. きれいな96ウェルプレートにMinElute 96ウェルプレートからウェル内のボリューム全体（30μl）を。
9. ステップ4.8そしてステップ4.1からリンカーから消化されたDNAを有するリンカーライゲーション反応を行う。 10μlの消化されたDNA、4μlの5Xライゲーションバッファー、5.5μlのアニールされたリンカー（950μg/μLの）、0.5μlのT4リガーゼ（5 U /μl）を混合します。
10. 16℃で一晩に4時間インキュベート℃、
11. 10分間65℃でT4 DNAリガーゼを不活性化する加熱。
12. 4.6 - 手順4.5で説明されるようにMinElute 96ウェルプレートと真空マニホールドを用いてライゲーションをクリーンアップします。
13. 30μlのH ₂ Oに再懸濁し、きれいな96ウェルプレートに移す。
14. 残りコンカテマートランスポゾンを破壊するために、第2のDNA消化を行います。このプラスミドvを切断する酵素を用いてDNAをもう一度切断することによって達成されるトランスポゾンコンカテマーを含有するトランスジェニックマウスを作成するために使用されたエクターのDNA。
15. ステップ4.13からリンカーライゲーションしたDNAのミックス25μlを、5μlの10×NEBバッファー＃3、0.5μlのBamHI部位（20 U /μl）を、0.5μlのBSA（10 mg / mlの：をBamHI（左右両側）を使用してダイジェストのDNA ）、19μlの蒸留H _{2 O}
16. 37℃ダイジェスト3から6時間または一晩℃、
17. トランスポゾンとリンカに特異的なプライマーに特異的なプライマーを用いて一次PCRを実行します。これらは、あなたが使っているトランスポゾンとリンカに応じて変化するであろう。プライマーはT2/OncとT2/Onc2トランスポゾンの作業上記プライマーの表に示します。
18. 一次PCR：5μlの10×バッファー、2.0μLのMgCl2（50mM）を、4μlのdNTPを（2.5 nM）を、1μlのプライマー1（20μM）、1μLのプライマー2（20μM）、0.25μlのプラチナTaqポリメラーゼ（5 U /リンカーと3μlの消化し ​​たDNA（金額は異なる場合があります）、最大50μlの蒸留H _{2 O）、}液
19. PCRプログラム：94℃で5分間、94を30サイクル℃で30秒間、60＆D例えば、30秒の場合はC、90秒間72℃。 72の最終伸長℃で5分間。
20. 上記のようにMinElute 96ウェルプレートと真空マニホールドを用いてPCR産物をクリーンアップします。
21. 30μlのH ₂ Oに再懸濁し、きれいな96ウェルプレートに移す。
22. 148μlの蒸留H ₂ Oにステップ4.21からDNA2μlを希釈することにより、1の1:75希釈度PCRを行う
23. またイルミナGAIIxマシンだけでなく、（これらのプライマーの例については、上記のプライマーの表を参照）処理された各腫瘍サンプルに一意である12塩基対のバーコードに必要な配列を有し、プライマーのネストされたバージョンを使用して二次PCRを行う。
24. 二次PCR：MgCl2を持つ10μlの10×バッファー、8μlのdNTPsを（2.5 mM）を、1μlのイルミナバーコード二プライマー（20μM）、1μlのイルミナ巣1二次プライマー（20μM）、0.25μlのファストスタートTaq（5 U /μlと）、一次PCR希釈1:75から2μlのDNA、最大100μlの蒸留H _{2 O}
25. PCRプログラム：94℃; 2分間℃、90秒45秒、72℃で30秒、53℃で94℃の30サイクル。 72の最終伸長℃で5分間。
26. 臭化エチジウム（0.5μg/ mlの）を含む1％アガロースゲル上でこのPCR反応の45μlを実行します。腫瘍の多くの異なるトランスポゾン挿入（ 図3）のアンプリコンを表すPCR産物の"スミア"があるはずです。
27. 上記のようにMinElute 96ウェルプレートと真空マニホールドを用いたPCR産物の残りの50μlをクリーンアップします。ウェル中で、50μlの蒸留H ₂ Oを配置して、再度掃除機で1回洗浄。
28. 30μlのTEに再懸濁し、きれいな96ウェルプレートに移す。
29. 各試料中のDNAの濃度を決定する。単一の1.5mlマイクロチューブ内のDNAの等量を兼ね備えています。これはイルミナHiSeq 2000マシンの単一レーンで順序付けされたライブラリになります。それはイルミナランのシングルレーンでシーケンス数百腫瘍することが可能です。
30. 提出する配列決定のためのすべての腫瘍からのDNAの等量を含む単一のチューブ。これはあなたの機関または市販することによって行うことができる。

5。トランスポゾン挿入の分析

1. トランスポゾン挿入データを解析するためのソフトウェアは、SourceForge（経由で無料ダウンロード可能ですhttp://sourceforge.net/projects/tapdancebio/ ）。 TapDanceと呼ばれるプログラムは、イルミナのプラットフォームやライブラリマップテキストフ​​ァイルへのバーコードからシーケンスファイルが必要です。

結果

育種法が確立された後、ブリーダーごとに19から21日のゴミを生成する必要があります。産仔数はブリーダーや遺伝的背景の年齢に応じて、5〜12仔が変化します。また、ごみの遺伝子型が育種法が正しいと成功の両方であることを確認する方法として、メンデル遺伝学に従っていることを確認してください。

実験を成功させるには、実験動物では腫瘍発生率は、対照動物?...

ディスカッション

眠れる森の美女のトランスポゾンシステムを用いたフォワード遺伝子スクリーニングは、癌を引き起こす変異を同定する方法を提供する。任意の素因変異に加えて、Creリコンビナーゼを制御するための適切なプロモーターを選択することで、SBの画面が知られており、小説候補癌遺伝子を識別します。

SBの画面の成功は、画面を作成するために選択したマ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
確実なシール誘導商工会議所	ブレインツリー·サイエンティフィック	EZ-177
クライオバイアル	Bioexpress	C-3355から2
10％緩衝ホルマリン	シグマアルドリッチ	HT501128-4L
タンパク質沈殿ソリューション	キアゲン	158910
細胞溶解緩衝液	キアゲン	158906
プロテイナーゼK	キアゲン	158920
アーゼ	キアゲン	158924
TE緩衝液	プロメガ	V6232
BfaI	ニューイングランドバイオラボ	R0568S
NlaIII	ニューイングランドバイオラボ	R0125S
96ウェルプレートをMinElute	キアゲン	28051
QIAvac 96吸引マニホールド	キアゲン	19504
マルチマイクロプレート魔神、120V	サイエンティフィックインダストリーズ	SI-4000
5xのライゲーションバッファーでT4 DNAリガーゼ	インビトロジェン	15224-041
BamHIで	ニューイングランドバイオラボ	R0136S
25mMのdNTPを	Bioexpress	C-5014-200
プラチナTaqポリメラーゼ	インビトロジェン	10966-034
ファストスタートTaq DNAポリメラーゼ	ロッシュ	12032929001
アガロース	プロメガ	V3121
TAEバッファー	プロメガ	V4271
TE緩衝液	プロメガ	V6232
臭化エチジウム	プロメガ	H5041