Идентификация<em&gt; Спящая красавица</em&gt; Транспозонов вставки в твердых опухолей с использованием Linker-опосредованного ПЦР

Резюме

Метод идентификации неизвестных водителей канцерогенеза использованием беспристрастный подход описан. Метод использует Спящая красавица Транспозона как случайная мутаген направлена ​​на конкретные ткани. Геномная отображение транспозона вставками, которые управляют образования опухоли определяет роман онкогенов и генов-супрессоров опухолей

Аннотация

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer¹. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation². Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method³. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor⁴. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method⁵. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations⁶. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

протокол

1. Разведение и старение трансгенных животных

1. Выберите штаммов трансгенных мышей подходит для вашего эксперимента. Типичный эксперимент будет использовать три трансгенные линии, условно транспозазы мыши, мыши укрывательство concatamer транспозонов, и мышь выражения Cre рекомбиназой в клетках Считается, что клетки происхождения желаемого рака. Если рак моделируемой имеет известную мутацию в большой процент пациентов может быть желательно, чтобы включить эту мутацию в самом начале. Примерами таких "предрасполагающих" мутации включают активированный Kras, доминантный негативный TP53 или floxed аллель Pten. При добавлении в предрасполагающие мутации модель может лучше представлять рака у человека (см. п. 1.3). Несколько транспозазы Спящая красавица и транспозонов мышей доступны из Национального института рака мышей хранилища ( http://mouse.ncifcrf.gov/ ).
2. Порода условного транспозазы мышей с мышами, укрывательство транспозонов, чтобы в конечном итоге получить мышей, гомозиготных по аллели и если это возможно. Порода гомозиготных потомства мышей, экспрессирующих Cre рекомбиназой для создания своих тройной трансгенных подопытных мышей (рис. 2). Примечание: Получение гомозиготных мышей, не всегда возможно или идеал. Например, гомозиготных p53 доминирующего отрицательного мышей гораздо труднее, чем разводить гетерозиготных мышей. Кроме того, было бы полезно, чтобы убедиться, что помет следует генетики Менделя, чтобы подтвердить, что разведение схема успешно.
3. При использовании предрасположены фон, в первую мышах породы с транспозазы мышам с предрасполагающих аллелей. Одновременно породу мышей, экспрессирующих Cre рекомбиназой для мышей, несущих транспозонов. Создать гомозиготных мышей для каждого аллеля если это возможно. Наконец, разводить гомозиготных потомство от двух предыдущих схем размножения для создания трансгенных четверка Аним экспериментальныхALS.
4. В дополнение к экспериментальным животным, генерировать управления когорты мышей. Контрольная группа обычно состоит из помета от экспериментального разведения, что наследовать только два из трех аллелей (рис. 2). В случае предрасположены фон, мышами в том числе три из четырех аллелей также будет необходимо.
5. Мониторинг экспериментальных и контрольных мышей ежедневно развития опухоли и / или moribundity. Следуй за своей институциональной и использования животных комитета (IACUC) требования к животноводству. Кроме того, он является типичным для определения возраста, в котором вы будете принести в жертву животное, если оно еще не стало умирающим. Восемнадцать месяцев типичный возраст, в котором мышей эвтаназии.

2. Аутопсия трансгенных животных

Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Sure-Seal Inducния палата	Мозг дерево Научные	EZ-177
Криопробирку	Bioexpress	C-3355-2
10% буферном растворе формалина	Sigma Aldrich	HT501128-4L

Таблица 1. Реагенты требуется.

1. Когда мышь умирает или уже достигли конца определена продолжительность жизни, эвтаназии животных с использованием CO ₂ камере после вашего IACUC руководящих принципов. Как правило, поместить животное в чистую газовую камеру, открыть бензобак и настроить регулятор читать не выше 5 фунтов на квадратный дюйм. Заполните медленно, чтобы свести к минимуму носа и раздражение глаз и отвращение к CO _2. Убедитесь, что сердце животного больше не избивали и не реагирует при прикосновении в глаза.
2. Спрей внешности жертву мышь с 70% этанола.
3. Место мыши на вскрытии плате и закрепить рассекает контакты. Используйте ножницыг пинцет, чтобы открыть мыши и удалить органах. Определение того, какие органы должны быть собраны, проект завис. Тем не менее, рекомендуется всегда собирают селезенки и печени, так как эти органы часто дают важную информацию, почему мышь умирает. Также собираем грудины для потенциального анализа костного мозга. Кроме того, это всегда полезно для сбора любого органа или ткани, который появляется ненормальный.
4. Тканей и опухолей, которые собираются должно быть разделено на четыре части. Одна часть фиксируется в 10% буферном растворе формалина в течение 18 часов с последующим 70% этанола. В этом разделе могут быть использованы для H & E окрашивание и / или IHC. Остальные три секции, которые, как правило, от 50 до 100 мг в размерах, которые замораживали в жидком азоте. Они могут быть использованы для ДНК, РНК и белков изоляции.
5. Утилизация туш и оставшиеся ткани в соответствии с руководящими принципами IACUC.

3. Изоляция геномной ДНК из опухоли

<сильная Name> реагента	Компания	Номер в каталоге
Решение осаждения белков	Qiagen	158910
Сотовые лизис буфера	Qiagen	158906
Протеиназы K	Qiagen	158920
РНКазы	Qiagen	158924
TE буфера	Promega	V6232

Таблица 2. Реагенты требуется.

1. Мелко фарш замороженных образцов опухоли (50 до 100 мг), используя чистые лезвия бритвы.
2. Место измельченной ткани в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и добавьте 1 мл клеточного буфера для лизиса, содержащего 5 мкл протеиназы К раствор (20 мг / мл).
3. Vortex тщательно.
4. Инкубируйте в 55 ° C шейкере установлено на уровне 250 оборотов в минуту в течение 4 часов, желательно на ночь.
5. Добавить 1 мкл РНКазы раствора (10 мг / мл) и инвертировать трубки 25 раз.
6. Инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин.
7. Остудить до комнатной температуры путем размещения на льду в течение 3 мин.
8. Добавить 333 мкл раствора Осадки белков и вихревые энергично.
9. Центрифуга при 14000 оборотов в минуту 10 мин. Белки должны гранул. Если гранулы очень мало, вихрь снова, инкубировать на льду в течение 5 минут, а затем повторно центрифуги.
10. Слейте супернатант, содержащий ДНК в чистую пробирку для центрифугирования 15 мл.
11. Добавить равном объеме 100% изопропанола и смешать, аккуратно обращения 50 раз.
12. Центрифуга при 3500 оборотов в минуту в течение 3 минут.
13. Удалите супернатант.
14. Добавить 1 мл 70% этанола и инвертировать трубку несколько раз мыть гранул.
15. Передача промытый осадок вместе с этанолом, 1,5 мл микроцентрифужных трубку.
16. Центрифуга при 14000 оборотов в минуту в течение 5 мин при 4 ° C.
17. Вылейте этанола и инвертировать трубку воздух сухой (примерно от 5 до 30 мин.)
18. Ресуспендируют ДНК-рВ Ellet 50 до 500 мкл ТЕ в зависимости от размера гранул ДНК.
19. Дополнительно инкубации при 37 ° C для ресуспендирования ДНК.
20. Хранить при температуре 4 ° C или -20 ° C для длительного хранения.

4. Linker опосредованной-PCR с использованием геномной ДНК из опухоли

Название реагента	Компания	Номер в каталоге
BFAI	New England Biolabs	R0568S
NlaIII	New England Biolabs	R0125S
MinElute 96-луночные планшеты	Qiagen	28051
QIAvac 96 Вакуумная	Qiagen	19504
Multi-микропланшетов Genie, 120В	Научно Industries, Inc	SI-4000
T4 ДНК-лигазы с 5-кратным буфера лигирования	Invitrogen	15224-041
BamHI	New England Biolabs	R0136S
25 мМ дНТФ	Bioexpress	C-5014-200
Платиновая Taq	Invitrogen	10966-034
FastStart Taq ДНК-полимеразы	Roche	12032929001
Агароза	Promega	V3121
TAE буфер	Promega	V4271
TE буфера	Promega	V6232
Бромистый этидий	Promega	H5041

Таблица 3. Реагенты требуется.

Linker Последовательности

BFAI компоновщик + 5 'GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC 3'

BFAI линкер-5 'Phos-TAGTCCCTTAAGCGGAG 3'NH2

"> NlaIII компоновщик + 5'GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGACCATG 3 '

NlaIII линкер-5 'Phos-GTCCCTTAAGCGGAGCC 3'

Праймеров

Первичный ПЦР вперед правой стороны (NlaIII): SPL IRDR R1 1 GCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCC

Первичный ПЦР вперед левой стороне (BFAI): SPL IRDR L1 1 CTGGAATTTTCCAAGCTGTTTAAAGGCACAGTCAAC

Первичный обратной ПЦР для правой и левой стороны: Spl Link1 1 GTAATACGACTCACTATAGGGC

Вторичный ПЦР вперед правой стороны: Пример Illumina штрих вторичной грунтовки 5 'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaGgtgtatgtaaacttccgacttcaa (N представляют 12 б.п. штрих-код, последовательность в верхнем регистре, необходимых для Illumina платформы, и последовательность в нижнем регистре будет связываться с транспозонов).

Вторичный ПЦР вперед левой стороне: Пример Illumina штрих вторичныхДары грунтовки 5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaAgtgtatgtaaacttccgacttcaa (N представляют 12 б.п. штрих-код, последовательность в верхнем регистре, необходимых для Illumina платформы, и последовательность в нижнем регистре будет связываться с транспозонов).

Вторичный обратной ПЦР для правой и левой стороны: компоновщик вложенных обратный праймер 5 'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTAGGGCTCCGCTTAAGGGAC

1. Отжиг + и - линкеров для линкеры BFAI и NlaII линкеры путем смешивания 50 мкл компоновщик + (100 мкм) с 50 мкл линкер-(100 мкМ) и добавляют 2 мкл NaCl (5 м) в 1,5 мл микроцентрифужных трубку. Место в 95 ° C тепла блока в течение 5 мин. Отключите нагревательный блок и пусть медленно охлаждают до комнатной температуры (это занимает час и более). После охлаждения отожженной линкеров может храниться в морозильной камере -20 ° C до необходимости.
2. Приготовьте две порции опухоли ДНК, каждая из аликвоты, содержащие 1 мкг ДНК. Один аликвоты будет переварена остроумиега, рестриктазы, что позволит сократить близкий к "правильным" конца транспозонов. Вторая аликвота будет расщепляли ферментом рестрикции, что сокращение близкий к "левым" конца транспозонов. Это сделано, чтобы максимально повысить шансы на усиление каждого сайта транспозона вставки.
3. Дайджест опухоли ДНК в одной аликвоты использованием "правильной" стороне фермента NlaII, и переваривать опухоли ДНК в другие аликвоты помощью клавиш «влево» стороне фермента BFAI: смешайте 1 мкл фермента, 5 мкл 10х буфера NEB № 4, ДНК ( 1 мкг) и DDH ₂ O в общем объеме 50 мкл. Дайджест ДНК в течение ночи при 37 ° С в водяной бане или инкубатор.
4. Нагрейте инактивации ферментов (BFAI = 80 ° C в течение 20 мин, NlaIII = 65 ° С в течение 20 мин).
5. Очистите усваиваются образцы, помещая образцы в MinElute 96-луночный планшет, место пластину в многообразии вакуума и вакуума в течение приблизительно 15 минут, пока скважин выглядят сухими.
6. Удалите пластину из коллектора вакуум и пятно нижней части 96-луночный планшет с бумажным полотенцем, чтобы удалить все Liquiре
7. Добавить 30 мкл DDH ₂ O в каждую лунку и встряхивают на множестве орбитальный шейкер на высоко в течение 2 мин, или пипетки вверх и вниз от 20 до 40 раз.
8. Передача весь объем в скважинах (30 мкл) из MinElute 96-луночный планшет в чистую 96-луночных планшетах.
9. Выполните компоновщик реакции лигирования с расщепленной ДНК с шагом 4,8 и линкеры с шагом 4.1. Смешать 10 мкл ДНК переваривается, 4 мкл 5х буфера лигирования, 5,5 мкл отожженной линкеры (950 мкг / мкл), 0,5 мкл лигазы Т4 (5 ед / мкл).
10. Выдержите в течение 4 часов в течение ночи при 16 ° C.
11. Нагрейте инактивации ДНК-лигазы Т4 при 65 ° С в течение 10 мин.
12. Очистка перевязки использованием MinElute 96-луночные планшеты и вакуумный коллектор как описано в пунктах 4.5 - 4.6.
13. Ресуспендируют в 30 мкл H ₂ O и перенести в чистую 96-луночный планшет.
14. Выполнить второй пищеварение ДНК для того, чтобы уничтожить оставшиеся concatamer транспозонов. Это достигается путем разрезания ДНК второй раз с использованием фермента, который разрезает плазмиду VЭктор ДНК, который был использован для создания трансгенных мышей, содержащих транспозонов concatamer.
15. Дайджест ДНК с использованием BamHI (слева и справа): смешать 25 мкл линкер-Лигированную ДНК с шагом 4.13, 5 мкл 10х буфера NEB № 3, 0,5 мкл BamHI (20 ед / мкл), 0,5 мкл BSA (10 мг / мл ), и 19 мкл DDH ₂ O.
16. Дайджест 3-6 часа или на ночь при 37 ° C.
17. Выполните первичной ПЦР с использованием праймеров, специфичных для транспозонов и праймера, специфичных для компоновщика. Они будут варьироваться в зависимости от того, транспозонов и компоновщик вы используете. Праймеров, перечисленных в таблице выше грунтовки работы на T2/Onc и T2/Onc2 транспозонов.
18. Первичный ПЦР: 5 мкл 10х буфера, 2,0 мкл MgCl2 (50 мМ), 4 мкл дНТФ (2,5 нМ), 1 мкл Primer 1 (20 мкм), 1 мкл праймера 2 (20 мкм), 0,25 мкл Taq Платиновый (5 U / мкл), 3 мкл расщепленной ДНК с линкеры (сумма может варьироваться), до 50 мкл DDH ₂ O.
19. ПЦР программе: 94 ° C в течение 5 мин, 30 циклов 94 ° C в течение 30 сек, 60 и Dнапример, C в течение 30 сек, 72 ° С в течение 90 сек. Окончательное удлинение при 72 ° C в течение 5 мин.
20. Очистите PCR продукта с использованием MinElute 96-луночные планшеты и вакуумный коллектор, как описано выше.
21. Ресуспендируют в 30 мкл H ₂ O и перенести в чистую 96-луночный планшет.
22. Сделать 1:75 разбавление 1 ° ПЦР путем разбавления 2 мкл ДНК шаг 4,21 на 148 мкл DDH ₂ O
23. Выполните вторичной PCR с использованием вложенных версии праймеров, которые также имеют необходимую последовательность для Illumina машины GAIIx, а также в 12 пар оснований, что штрих-код является уникальным для каждого образца опухоли обработаны (см. таблицу выше грунтовку для примера этих праймеров).
24. Вторичный ПЦР 10 мкл 10х буфера с MgCl2, 8 мкл дНТФ (2,5 мм), 1 мкл Illumina штрих вторичной грунтовки (20 мкм), 1 мкл Nest Illumina 1 вторичная грунтовка (20 мкм), 0,25 мкл Taq FastStart (5 ед / мкл ), 2 мкл ДНК из первичных ПЦР разбавленной 1:75, до 100 мкл DDH ₂ O.
25. ПЦР программе: 94 °, С в течение 2 мин, 30 циклов при 94 ° C в течение 30 сек, 53 ° С в течение 45 сек, 72 ° C в течение 90 сек. Окончательное удлинение при 72 ° C в течение 5 мин.
26. Выполнить 45 мкл этой реакции ПЦР на 1% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (0,5 мкг / мл). Там должно быть "размазать" продуктов ПЦР представляет ампликонов из многих различных вставками транспозонов в опухоли (рис. 3).
27. Очистите оставшиеся 50 мкл продукта ПЦР с использованием MinElute 96-луночные планшеты и вакуумный коллектор, как описано выше. Мыть один раз путем размещения 50 мкл DDH ₂ O в скважинах и пылесосить раз.
28. Ресуспендируют в 30 мкл TE и перенести в чистую 96-луночный планшет.
29. Определение концентрации ДНК в каждой пробе. Комбинат равных количеств ДНК в одной трубе микроцентрифуге 1,5 мл. Это будет библиотека, которая последовательно в одну полосу Illumina HiSeq 2000 машин. Можно последовательности нескольких сотен опухоли в одной полосе Illumina перспективе.
30. Представлятьодной трубки, содержащей равные количества ДНК от всех опухолей для секвенирования. Это может быть сделано по вашей организации или в коммерческих целях.

5. Анализ вставками транспозонов

1. Программное обеспечение для анализа транспозона вставки данных доступна для бесплатного скачивания через SourceForge ( http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/ ). Программа под названием TapDance, требуется последовательность файлов из Illumina платформы и штрих-код библиотеки текстовый файл карты.

Результаты

После разведения схема была создана, заводчики должны производить мусор каждые 19-21 дней. Помет размер будет варьироваться от 5 до 12 детенышей, в зависимости от возраста заводчиков и генетического фона. Кроме того, убедитесь, что генотип помета следует генетики Менделя как способ подтве?...

Обсуждение

Вперед генетические экран с помощью Спящая красавица транспозона система предоставляет метод для выявления мутаций, которые вызывают рак. Выбрав соответствующий промотор для управления Cre рекомбиназой в дополнение к любой предрасполагающие мутации, на экране SB будет опред?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Sure-Seal индукционные палата	Мозг дерево Научные	EZ-177
Криопробирку	Bioexpress	C-3355-2
10% буферном растворе формалина	Sigma Aldrich	HT501128-4L
Решение осаждения белков	Qiagen	158910
Сотовые лизис буфера	Qiagen	158906
Протеиназы K	Qiagen	158920
РНКазы	Qiagen	158924
TE буфера	Promega	V6232
BFAI	New England Biolabs	R0568S
NlaIII	New England Biolabs	R0125S
MinElute 96-луночные планшеты	Qiagen	28051
QIAvac 96 Вакуумная	Qiagen	19504
Multi-микропланшетов Genie, 120В	Научно Industries, Inc	SI-4000
T4 ДНК-лигазы с 5-кратным буфера лигирования	Invitrogen	15224-041
BamHI	New England Biolabs	R0136S
25 мМ дНТФ	Bioexpress	C-5014-200
Платиновая Taq	Invitrogen	10966-034
FastStart Taq ДНК-полимеразы	Roche	12032929001
Агароза	Promega	V3121
TAE буфер	Promega	V4271
TE буфера	Promega	V6232
Бромистый этидий	Promega	H5041