ARN<em&gt; In situ</emHibridación&gt; Los embriones en todo el montaje y la histología de células Adaptado para elasmobranquios marinos

Resumen

Mediante la combinación de los métodos de montaje de ARN total In situ y la histología, la expresión génica se puede vincular con las decisiones del destino celular en el embrión en desarrollo. Estos métodos han sido adaptados a los elasmobranquios marinos y facilitar el uso de estos animales como organismos modelo para estudios biomédicos, toxicología y comparativa.

Resumen

Elasmobranquios marinos se valoran los modelos animales para estudios biomédicos y genómicos, ya que son los vertebrados más primitivos para tener inmunidad adaptativa y contar con mecanismos únicos para la osmorregulación ^1-3. Como las más primitivas de vida jawed vertebrados con apéndices pares, los elasmobranquios son un modelo evolutivo importante, especialmente para los estudios de evolución y desarrollo. Elasmobranquios marinos también se han utilizado para estudiar toxicología acuática y la fisiología del estrés en relación a ⁴ sobre el cambio climático. Así, el desarrollo y la adaptación de las metodologías que se necesita para facilitar y ampliar el uso de estos vertebrados primitivos a múltiples disciplinas biológicas. Aquí os presento la exitosa adaptación de montaje ARN total hibridación in situ y técnicas histológicas para el estudio de la expresión génica y la histología de células en los elasmobranquios.

Seguimiento de la expresión de genes es una herramienta de sello de desarrollo biologists, y se utiliza ampliamente para investigar los procesos de desarrollo ^5. Montaje ARN toda la hibridación in situ permite la visualización y localización de transcritos de genes específicos en tejidos del embrión en desarrollo. El patrón de expresión del mensaje de un gen puede dar una idea de lo que los procesos de desarrollo y las decisiones de destino celular de un gen puede controlar. Al comparar el patrón de expresión de un gen en diferentes etapas de desarrollo, la visión puede ser adquirida en cómo el papel de algunos cambios genéticos durante el desarrollo.

Mientras que todo el montaje in situ 's proporciona un medio para localizar la expresión de genes a los tejidos, las técnicas histológicas permiten la identificación de tipos de células diferenciadas y tejidos. Tinciones histológicas tienen diversas funciones. Manchas generales se usan para resaltar la morfología celular, por ejemplo hematoxilina y eosina para la tinción general de núcleos y el citoplasma, respectivamente. Otras manchas pueden destacar celda específicatipos. Por ejemplo, el azul Alcian mancha presentado en este artículo es una mancha muy utilizado para identificar mucosaccharides catiónico. La tinción del tracto digestivo con azul alcián puede identificar la distribución de las células caliciformes que producen mucosaccharides. Las variaciones en los componentes mucosaccharide en péptidos cortos distinguir las células caliciformes por su función en el tracto digestivo ^6. Mediante el uso de montaje ARN entero en métodos in situ 's e histoquímicas simultáneamente, las decisiones de destino celular puede estar vinculado a genes específicos de expresión.

A pesar de ARN in situ 's e histoquímica son ampliamente utilizados por los investigadores, su adaptación y uso en los elasmobranquios marinos han tenido un éxito limitado y variados. Aquí presento protocolos desarrollados para los elasmobranquios y se utiliza de forma regular en mi laboratorio. Aunque la modificación de los ARN en el método de hibridación in situ 's puede ser necesario para adaptarse a las diferentes especies, los protocolos descritos aquí proveer un sólido punto de partida para los investigadores que deseen adaptar el uso de elasmobranquios marinos para sus investigaciones científicas.

Protocolo

I. Total RNA montaje hibridación in situ en los elasmobranquios marinos

1. Fijación embrión y Preparación

1. Skate embriones pueden organizarse de acuerdo a Ballard ^7. Etapas óptimo para la detección de la expresión génica depende del tejido de interés. Para el seguimiento de la expresión génica en el tracto digestivo del patín, etapas 27-30 son óptimas ^7.
2. Diseccionar embriones en PBS, la separación de los embriones desde el saco vitelino.
3. Fijar en 30 ml de paraformaldehído al 4% recién hecho (PFA) en un tubo cónico de 50 ml a 4 º C con agitación suave. Fijar durante 24 horas.
4. Lavar los embriones en PBT, dos veces durante 15 min, rotando a temperatura ambiente. Todas las recetas de solución para montaje ARN total in situ 's se incluyen (Tabla 1).
5. Deshidratar embriones por lavado en una serie de metanol de 25%, 50% y 75% de metanol: PBT balanceo a temperatura ambiente. La duración de los lavados depende de la etapa de los embriones. Para pre-neurulation etapas embriones, 5 min de cada lavado en la serie de metanol es suficiente. Para los embriones de más de 30 etapas, lavado puede durar hasta 30 minutos. Para determinar si los embriones son suficientemente penetrado y aclimatarse a cada lavado, mantenga el tubo en posición vertical en la mano. Si los embriones se hunden hasta el fondo del tubo, entonces está listo para el siguiente lavado. Si los embriones flotan en la parte superior de la solución, cambie la solución y repita que etapa de deshidratación particular.
6. Lavar dos veces en 100% de metanol durante 10 min agitando suavemente.
7. Una vez deshidratado a 100% de metanol, los embriones deben ser almacenados a -20 ° C durante al menos 24 horas antes de proceder con el protocolo. Los embriones han sido correctamente almacenados a -20 ° C y se utiliza para los montajes de ARN enteros de hasta 1 año.

2. Síntesis de ARN sonda

1. Generar un fragmento lineal de los genes cuya expresión se quiere detectar. Esto se puede hacer ya sea mediante amplificación por PCR o linealizando un plásmido con el gende interés. Para amplificar por PCR, elegir cebadores cuyos sitios de unión flanquean el gen insertar y retener los sitios de unión de ARN polimerasa en la región amplificada. Para plásmidos comúnmente usados ​​tales como PBS o pGEM, hacia adelante M15 y cebadores inversos son ideales. Alternativamente, linealizar un plásmido por digestión de 15 l de ADN de QIAGEN miniprep con una enzima que escinde en el extremo 5 'del gen. Gel extraer y purificar usando el kit QIAquick apropiado.
2. Transcribir inversamente la sonda de ARN usando 8 ng l de plásmido lineal o 100 de producto de PCR como una plantilla mediante la ARN polimerasa apropiada (véase la Tabla 2 para la reacción de transcripción).
3. Incubar reacción de transcripción inversa durante 2 horas a 37 ° C.
4. Para confirmar reacción, ejecutar 1 l de la reacción de transcripción en un 1% de agarosa / TAE gel. Corra el gel a 100 mVolts hasta que el colorante acaba de correr en el gel. Una banda prominente solo debe ser visible. El fragmento de ADN plantilla lineal puede ser débilmente visible en un molecu mayorlar peso.
5. Añadir 1 l de RNasa libre de DNasa I a la reacción de transcripción y se incuba a 37 ° C durante 15 min.
6. Para precipitado, añadir 100 ml de TE pH 8, 10 l LiCl 4 M, 300 l 100% de EtOH y se incuba a -20 ° C durante al menos 60 minutos o durante la noche.
7. Centrifugado durante 10 min en una microcentrífuga de 4 º C a 14.000 rpm.
8. Lave pellet con EtOH 70% y secar al aire.
9. Resuspender sonda de ARN en 20 l de H ₂ O. Añadir 80 l de tampón de hibridación (tampón de hibridación debe ser pre-calentado a 70 ° C). La sonda puede ser almacenado en tampón de hibridación 80% durante varios meses a -20 ° C o más, a -80 ° C.

3. Embrión Pre-tratamiento y la hibridación

1. Eliminar embriones almacenados en 100% de metanol a partir de -20 ° C. Para los más pequeños embriones continúe con el paso (3,2). Para más tarde en escena etapa embriones (29/30 <) puede ver una capa de la epidermis que ha 'levantado' fuera del cuerpo del embrión. Bajo el microscopio, cuidadosamente dissejar la capa epidérmica para maximizar la penetración de la sonda.
2. Coloque los embriones en viales de centelleo de vidrio limpios. Rehidratar los embriones en la serie de metanol inversa descrito anteriormente: (75%, 50%, 25% de metanol: PBT) por meciéndose suavemente cada solución para cada 5-30 min a temperatura ambiente. Rehidratación completa con dos lavados de PBT durante 10 minutos cada uno, agitando suavemente.
3. Para eliminar cualquier pigmento, embriones de blanqueo con peróxido de hidrógeno al 6% en PBT durante 1 hora a temperatura ambiente, balanceo.
4. Eliminar el peróxido de hidrógeno por lavado tres veces en PBT, (agitación a temperatura ambiente, 10 min cada uno).
5. Tratar embriones con proteinasa K para permitir la penetración de la sonda durante la hibridación. La cantidad de proteinasa K y la duración del tratamiento depende del tejido que desea examinar y la edad del embrión. Tejido más superficial y los embriones más jóvenes requieren más corto y proteinasa K menos, mientras que los tejidos más profundos y más embriones requieren una mayor concentración y un tratamiento más largo time para permeabilizar completamente el embrión para la hibridación de la sonda. Por ejemplo, para detectar Shh en el endodermo visceral de embriones en estado de patín 29, 30 ug / ml de proteinasa K / PBT se incuba durante 20 min a temperatura ambiente.
6. Rápidamente enjuague embriones en PBT para lavar proteinasa K.
7. Para desactivar la proteinasa K, embriones postfix con PFA al 4%, 0,2% de glutaraldehído en PBT durante 20 min, agitando suavemente.
8. Lavar dos veces durante 10 minutos con PBT.
9. 1. Para pre-hibridación, añadir 2-3 ml de solución de hibridación precalentada a los embriones, solo lo suficiente para cubrir. Oscilar suavemente en un baño de agua caliente a 70 ° C durante 1 hr.
   2. Para preparar la solución de hibridación, precalentar sonda de ARN a 70 º C durante 10 min y enfriar en hielo. Diluir 15-20 l de sonda de ARN a 2 ml de solución de hibridación fresco precalentado, para obtener una concentración final de 0,5-1,0 g / ml. Retire pre-Hybe y añadir diluida sonda de ARN a los embriones. Los embriones se acaba de cubrir por solución, unadd hibridación solución más si es necesario. Tapa bien segura del vial de centelleo. Hibridan meciéndose suavemente en un baño de agua caliente a 70 ° C durante la noche.

4. Publica Lava hibridación y la hibridación de anticuerpos

1. Elimine la solución de hibridación con la sonda de embriones y póngalas en un vial de centelleo fresco o un tubo Eppendorf. La sonda puede ser almacenado a -20 ° C y reutilizado en el futuro. Para lavados post-hibridación, los embriones lugar en un Netwell sentado en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos.
2. Lavar 3 veces durante 30 minutos cada uno en pre-calentado Solución n º 1, agitación a 70 ° C.
3. Lavar 3 veces durante 30 minutos cada uno en pre-calentado Solución # 2, mecedora a 70 ° C.
4. Lavar 3 veces durante 5 min cada uno en TBST, balanceo a temperatura ambiente.
5. Pre-bloque con suero de oveja 10% inactivado por calor en TBST durante 1 hora, meciéndose a temperatura ambiente.
6. Transferencia de embriones Netwell a un vial de centelleo de vidrio fresco. Agregar anti-DIGFragmentos Fab (1:5.000) en suero de oveja 1% inactivado por calor / TBST a los embriones. Roca durante la noche a 4 ° C.

5. La hibridación del anuncio anticuerpos Lava

1. Retire y deseche el anticuerpo. Vuelva a colocar los embriones en Netwell para lavados.
2. Lavar 3 veces durante 5 minutos cada uno en TBST, meciendo a temperatura ambiente
3. Lavar al menos 6 veces durante 1 hora cada uno, balanceo a temperatura ambiente.
4. Lave toda la noche en TBST, meciendo a 4 ° C. A medida que los lavados posteriores de anticuerpos ayudar a reducir la tinción de fondo, maximizando el número y la duración de los lavados es preferible. Los embriones son rutinariamente lavó en TBST a 4 º C, durante el fin de semana.

6. La detección de la sonda

1. Maquillaje solución NTMT fresco y esterilizar por filtración.
2. Desechar la solución TBST lavado y embriones lugar en un vial de centelleo de vidrio limpio. Lavar 3 veces en embriones NTMT fresco durante 10 min cada uno a temperatura ambiente, balanceo.
3. Retire NTMT lavar y agregar la mezcla de reacciónde 1 x NBT / BCIP en 1 x NTMT. Como estos reactivos son sensibles a la luz, cubrir vial de centelleo en papel de aluminio y roca a temperatura ambiente.
4. Monitorear reacción de color cada 15 minutos hasta que la expresión del gen deseado es claramente visible. Sondas fuertes pueden tomar tan poco como 10 minutos para desarrollarse. Sondas débiles pueden tomar 1-2 horas. No permita que la reacción vaya por mucho tiempo o tinción de fondo comenzará a aparecer (todo el embrión comienza a tomar un color opaco púrpura o marrón).
5. Lavar dos veces durante 10 minutos en cada una de PBT a temperatura ambiente, balanceo.
6. Postfix embriones en paraformaldehído al 4%, 0,1% de glutaraldehído durante 1 hora a temperatura ambiente. Los embriones pueden ser almacenar indefinidamente en fijador a 4 º C.
7. Visualice embriones con un microscopio binocular de disección. Para producir una luz de fondo azul para las fotos, embriones Coloque en un plato con pre-endurecido agarosa al 1% / PBS.

7. Resultados representativos para Mount I. Todo el ARN de hibridación in situ en los elasmobranquios marinos

Montaje ARN toda la expresión in situ 's que representa de Sonic hedgehog (Shh) y HOXA13 en embriones de patín se muestra en la figura 1. La expresión de Shh en los vertebrados superiores se encuentra en la notocorda y endodermo visceral y este patrón de expresión se conserva en el patín (Figura 1a) ^8,9. Elasmobranquios marinos tienen un método único de osmorregulación que utiliza la glándula rectal a las sales secretan. HOXA13 expresión es alta en el desarrollo de la glándula rectal (Figura 1b) ^10. HOXA13 producto génico papel en la morfogénesis de la glándula rectal sigue siendo desconocido.

II. Inclusión en parafina y seccionar los tejidos Elasmobranquios

1. Cosecha y Preparación de tejido

1. Diseccionar el tejido deseado y se fijan en formalina al 10% durante 24-48 horas, meciéndose a temperatura ambiente. 4% de paraformaldehído (PFA) también puede ser utilizado como fijador(Ver Discusión).
2. Lavar fijador por lavado en PBS, 3 veces durante 30 minutos cada uno. Dependiendo del tamaño del tejido, tiempos de lavado se puede reducir a 10 min o mayor a 1 hr.
3. Deshidratar embriones por lavado en una serie de etanol de 25%, 50% y 75% de etanol: PBS balanceo a temperatura ambiente. Una vez más, el tiempo para cada lavado dependerá del tamaño del tejido. Para 0,5 cm ³ de tejido, incubar cada lavado durante 15 min. Aumentar el tiempo para grandes piezas. Si el almacenamiento a largo plazo del tejido que se desea, lavar un adicional de dos veces en etanol al 75% y almacenar a -20 ° C durante hasta un año. De lo contrario proceder al siguiente paso.
4. Además deshidratar por lavado 3 veces en 100% de etanol durante 15 min cada uno, balanceo.

2. Inclusión en parafina y seccionamiento

1. Aclarar el tejido mediante el lavado 2 veces en xileno durante 5 minutos cada una en viales de centelleo de vidrio con tapas a rosca. Xileno hará que el tejido frágil, así que no excedan de un total de 10 minutos para la erahes. El tejido translúcido debe buscar cuando se lo sostiene contra la luz. Si el tejido es todavía muy opaco después de los dos lavados, hacer un lavado adicional en xileno durante 5 min y luego proceder con el protocolo. Sólo manejar xileno dentro de una campana de humos con guantes.
2. Retire xileno y llenar el vial de centelleo de 2/3 partes con parafina derretida. Incubar en un horno a 60 º C durante 30 min. Al poner parafina en el vial, te darás cuenta de que la parafina se solidifique a lo largo de los lados del vial. Colocar el vial en el horno y permitir que la parafina para volver a disolver durante unos minutos. Tome el vial fuera del horno y dar a la solución un remolino para mezclar rápida y sustituir en el horno durante el resto de la incubación.
3. Parafina Repetir dos veces más las incubaciones durante 30 min.
4. Incubar en parafina dos veces durante una hora cada uno. Cambiar parafina por última vez y se incuba durante la noche en la estufa a 60 º C.
5. El día siguiente, colocar el tejido en una cámara de parafina baño caliente y se coloca bajo vacío durante 2-3 hr. Esto facilitará la infiltración de parafina en el tejido y eliminar las burbujas de aire. Para algunos tipos de tejido delgado, un paso de vacío puede no ser necesario, pero es necesario que los embriones enteros o del tracto digestivo y otros órganos con compartimentos luminal.
6. Después de vacío facilita la infiltración de tejido tejido lugar, en un molde metálico con parafina derretida, y enfriar sobre una placa de hielo. Deja en hielo oa 4 ° C durante la noche antes de tratar de eliminar el tejido del molde. Los bloques de parafina de tejido pueden ser almacenadas indefinidamente a 4 ° C.
7. Colocar un bloque de parafina en un micrótomo y cortar secciones 8 micras. Las secciones deben ser flotados en un baño de agua a 48 ° C y se montaron en portaobjetos de vidrio Superfrost Plus *.
8. Diapositivas en seco durante la noche en un horno de 37 ° C.
9. Secciones se almacena a 4 ° C hasta su utilización.

III. Alcian Blue / Red Fast tinción nuclear de tejido Elasmobranquios

1. Alcian Blue Stain para mucinas

1. Lugar desliza hacia arriba con secciones en una diapositiva más cálido. Derretir durante 45 min.
2. Lugar se desliza dentro de un soporte de diapositivas. Todas las soluciones resultantes están contenidas en las tinas dentro de una campana de humos. Las diapositivas se lavan mediante la transferencia de una bañera con una solución a otra. Asegúrese de que los niveles de solución en las tinas cubre las diapositivas, los tejidos de las diapositivas están completamente sumergidos. Disolver parafina por lavado diapositivas 2 veces en xileno durante 5 min cada uno.
3. Lavar los portaobjetos dos veces con 100% de etanol durante 1 min cada uno.
4. Rehidratar diapositivas en una serie de etanol (75%, 50%, 25% de etanol) de lavado en cada solución durante 1 min. Lave en dH ₂ O durante 1 min.
5. Teñir con solución de Azul de Alcian, pH 2,5 durante 15 min.
6. Desarrollar mancha por el lavado en agua corriente durante 3 min. Sumerja una vez en dH ₂ O.
7. Contratinción nuclear en solución rápida Contratinción Red durante 10 min.
8. Lavar con agua corriente durante 3 minutos y sumergir en dH ₂ O la vez.
9. Dehymonohidrato en una serie de etanol (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) para 20 inmersiones cada uno, o 1 min cada uno. Lavar 2 veces en xileno durante 5 min cada uno. Montar con DPX medio de montaje y cubreobjetos. Permitir medio de montaje para secar y endurecer durante 48 horas en la campana de humos antes de manipular las diapositivas.

Resultados

Ejemplos de tinción con azul Alcian en diferentes regiones de la L. tracto digestivo erinacea se muestra en la Figura 2. Mucina ácida que contiene células globlet son claramente visibles por el azul alcián mancha en todo el tracto digestivo. La distribución de las mucinas ácidas difiere en las diferentes regiones del tracto digestivo, lo que refleja las diferencias en la función. Mucinas ácidas están escasamente produce en el intestino espiral y cloaca, mientras que una alta c...

Discusión

Los protocolos presentados son métodos clásicos para el seguimiento de la expresión génica y la identificación de tipos de células diferenciadas, y se han adaptado para su uso en los elasmobranquios marinos. Las modificaciones adicionales de estos protocolos puede ser necesaria para adaptarse a las diferentes especies de elasmobranquios.

La preocupación más común con respecto montaje ARN total in situ 's es el riesgo de contaminación de ARNasa y de ese modo la degradac...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 x transcription buffer	Roche	11-465-384-001
DIG-RNA labeling mix	Roche	11-277-073-910
RNAse inhibitor	Roche	03-335-399-001
RNA polymerase - SP6	Roche	10-810-274-001
DNAseI, RNAse-free	Roche	10-776-785-001
Yeast RNA	Invitrogen	15401-029
CHAPS	EMD-Millipore	220201
heparin	Sigma-Aldrich	H4784
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Research Organics	2106D
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17
Netwell inserts	Electron Microscopy Sciences	64713-00	Netwells for use in 6-well tissue culture dishes
6-well tissue culture plate	Corning	3516
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
formamide	Fisher	BP227500
Proteinase K	Invitrogen	59895 (AM2542)
NBT		11585029001
BCIP	Roche	11585002001
Hydrogen peroxide, 30%	EMD	HX0635-1
Sheep serum	VWR	101301-478
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
tRNA	Roche	10-109-541-001
Anti-DIG Fab Fragments	Roche	1137-6623
Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.
1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5	Electron Microscopy Sciences	26323-01
Nuclear Fast Red	Electron Microscopy Sciences	26078-05
DPX Mountant	Electron Microscopy Sciences	13510
Paraffin (Paraplast X-tra)	McCormick Scientific	39503002
10% Formalin, NBF	VWR	95042-908
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
Stainless steal base molds	Tissue-Tek	4161-4165	Multiple sizes available.
Cassettes	Tissue-Tek	4170
Slide warmer	Fisher-Scientific	12-594Q
Tissue Embedder	Leica Microsystems	EG1160
Microtome, rotary	Leica Microsystems	RM2235
Tissue-Tek Slide Staining Set	Electron Microscopy Sciences	62540-01
Tissue-Tek 24-Slide Holder	Electron Microscopy Sciences	62543-06
Superfrost*Plus slides	Fisherbrand	12-550-17
Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.