RNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridação em embriões de Mount inteiros e histologia de células Adaptado para Elasmobrânquios Marinhos

Resumo

Através da combinação de métodos para a montagem de toda RNA In situ Hibridação e histologia, a expressão do gene pode estar relacionada com as decisões celulares destino no embrião em desenvolvimento. Estes métodos têm sido adaptados para elasmobrânquios marinhos e facilitar o uso desses animais como organismos-modelo para estudos de toxicologia, biomédicas e comparativo.

Resumo

Elasmobrânquios marinhos são avaliados modelos animais para estudos biomédicos e genômica, como eles são os vertebrados mais primitivos para ter imunidade adaptativa e ter mecanismos exclusivos para osmorregulação ^1-3. Como as mais primitivas de vida mandibulados-vertebrados com apêndices pareados, elasmobrânquios são um modelo evolutivo importante, especialmente para estudos em evolução e desenvolvimento. Elasmobrânquios marinhos também têm sido utilizados para estudar toxicologia aquática e fisiologia stress em relação a ⁴ alterações climáticas. Assim, o desenvolvimento e adaptação de metodologias é necessário para facilitar e ampliar o uso destes vertebrados primitivos para várias disciplinas biológicas. Aqui I apresentam a capacidade de adaptação do RNA montagem inteira de hibridação in situ e de técnicas histológicas para estudar a expressão do gene e histologia de células em elasmobrânquios.

Monitorando a expressão do gene é uma ferramenta de cunho biol desenvolvimentoogists, e é amplamente utilizada para investigar os processos de desenvolvimento ^5. RNA montagem inteira de hibridação in situ, permite uma visualização e localização de transcritos de genes específicos nos tecidos do embrião em desenvolvimento. O padrão de expressão da mensagem de um gene pode fornecer uma visão do que os processos de desenvolvimento e decisões destino da célula um gene pode controlar. , Comparando o padrão de expressão de um gene em diferentes fases de desenvolvimento, a percepção pode ser adquirida na forma de um papel a alterações dos genes durante o desenvolvimento.

Enquanto todo montagem in situ 's fornece um meio para localizar a expressão do gene ao tecido, técnicas histológicas permitir a identificação de tipos de células diferenciadas e de tecidos. Manchas histológico têm funções variadas. Manchas gerais são utilizadas para realçar a morfologia das células, por exemplo, hematoxilina e eosina para corar geral dos núcleos e do citoplasma, respectivamente. Outras manchas podem destacar célula específicatipos. Por exemplo, o azul alcian mancha relatado no presente artigo é uma mancha amplamente utilizado para identificar mucosaccharides catiônica. A coloração do tracto digestivo com alcian azul pode identificar a distribuição de células caliciformes produtoras de mucosaccharides. Variações na constituintes mucosaccharide em péptidos curtos distinguir células caliciformes por função dentro do tracto digestivo ^6. Usando RNA montagem inteira métodos in situ 's e histoquímicas simultaneamente, as decisões do destino das células pode ser ligado ao gene a expressão específica.

Apesar de RNA in situ 's e histoquímica são amplamente utilizados por pesquisadores, sua adaptação e utilização em elasmobrânquios marinhos encontraram sucesso limitado e variada. Aqui eu apresento protocolos desenvolvidos para elasmobrânquios e usado em uma base regular em meu laboratório. Embora a modificação adicional do RNA in situ o método de hibridação pode ser necessária para se adaptar a diferentes espécies, os protocolos aqui descritos provide um forte ponto de partida para pesquisadores que querem adaptar o uso de elasmobrânquios marinhos para suas investigações científicas.

Protocolo

I. Mount RNA Total de hibridação in situ em Elasmobranchs Marinhas

1. Fixação embrião e Preparação

1. Embriões de skate pode ser encenado de acordo com Ballard ^7. Fases óptimas para a detecção da expressão do gene depende do tecido de interesse. Para acompanhar a expressão do gene no trato digestivo de skate, 27-30 estágios são óptimas ^7.
2. Dissecar embriões em PBS, separando os embriões a partir do saco vitelino.
3. Fixar em 30 ml de frescos paraformaldeído a 4% (PFA) em um tubo cónico de 50 ml, a 4 ° C com agitação suave. Correção para 24 horas.
4. Lavar os embriões em PBT, por duas vezes, durante 15 min, à temperatura ambiente, rotação. Todas as receitas de solução para a montagem de todo o RNA in situ 's são incluídos (Tabela 1).
5. Desidratar embriões por lavagem de uma série de metanol de 25%, 50% e 75% de metanol: PBT oscilante à temperatura ambiente. A duração das lavagens depende da fase dos embriões. Para pré-neurulation encenado embriões, 5 min de cada lavagem da série metanol é suficiente. Para embriões com mais de 30 fases, lavagens pode durar até 30 minutos. Para determinar se os embriões são suficientemente penetrada e aclimatados a cada lavagem, mantenha o tubo na posição vertical na sua mão. Se os embriões vão para o fundo do tubo, então você está pronto para a próxima lavagem. Se os embriões flutuar para o topo da solução, mudar a solução e repetir esse passo particular desidratação.
6. Lavar duas vezes em metanol a 100% durante 10 min suavemente balanço.
7. Uma vez desidratado à solução de metanol a 100%, os embriões devem ser armazenadas a -20 ° C durante pelo menos 24 horas antes de prosseguir com o protocolo. Os embriões foram sucesso armazenado a -20 ° C e utilizada para montagens inteiras de RNA durante até 1 ano.

2. Síntese de RNA Probe

1. Gerar um fragmento linear do gene cuja expressão que você deseja detectar. Isto pode ser feito quer através de amplificação por PCR ou linearizar o plasmídeo com um gene suade interesse. Para amplificar por PCR, escolher primers cujos locais de ligação do flanco do gene inserir e reter sítios de ligação da polimerase de RNA na região amplificada. Para os plasmídeos geralmente utilizados, tais como pBS ou pGEM, para a frente M15 e iniciadores inversos são ideais. Alternativamente, um plasmídeo linearizado por digestão de 15 ul de ADN de miniprep QIAGEN com uma enzima que cliva a extremidade 5 'do gene. Extrair e purificar em gel utilizando o kit QIAquick apropriado.
2. A transcrição reversa do RNA a sonda com 8 ul de plasmídeo ou 100 ng de produto de PCR linear como um molde utilizando a polimerase de ARN adequado (ver Quadro 2 para a reacção de transcrição).
3. Incubar reacção de transcrição reversa, durante 2 horas a 37 ° C.
4. Para confirmar a reacção, correr 1 ul de reacção de transcrição em um gel de agarose a 1% / TAE. Executar gel a 100 mVolts até que o corante tem apenas correr no gel. Uma única banda de destaque deve ser visível. O fragmento linear de ADN molde pode ser fracamente visíveis em maior molecuLar de peso.
5. Adicionar 1 ml de RNAse-livre de DNAse I à reacção de transcrição e incubar a 37 ° C durante 15 min.
6. Para precipitado, adicionar 100 ul de TE, pH 8, 10 uL de 4 M de LiCl, 300 ul de EtOH a 100% e incubado a -20 ° C durante pelo menos 60 minutos ou durante a noite.
7. Centrifugação durante 10 min a 4 ° C uma microcentrífuga a 14000 rpm.
8. Lavar pellet com 70% de EtOH e secar ao ar.
9. Ressuspender RNA sonda em 20 l de dH ₂ O. Adicionar 80 ul de tampão de hibridação (tampão de hibridação deve ser pré-aquecido a 70 ° C). A sonda pode ser armazenado em tampão de hibridação de 80% durante vários meses à temperatura de -20 ° C ou mais, à temperatura de -80 ° C.

3. Embrião pré-tratamento e Hibridação

1. Remover embriões armazenados em metanol a 100% a partir de -20 ° C. Para os embriões jovens prosseguir com a etapa (3.2). Para mais tarde encenado embriões (fase 29/30 <), você pode ver uma camada da epiderme que 'levantou' fora do corpo do embrião. Sob o microscópio, cuidadosamente chatearect fora a camada epidérmica para maximizar a penetração da sonda.
2. Embriões coloque em frascos de cintilação limpa vidro. Reidratar os embriões na série metanol reversa descrito acima: (75%, 50%, 25% de metanol: PBT) por balançar suavemente cada solução para 5-30 min cada, à temperatura ambiente. Reidratação completa com duas lavagens de PBT de 10 min cada, balançando suavemente.
3. Para remover qualquer pigmento, os embriões de branqueamento com peróxido de hidrogénio a 6% em PBT durante 1 hora à temperatura ambiente, agitando.
4. Remover o peróxido de hidrogénio através de lavagem por três vezes em PBT, (agitando à temperatura ambiente, 10 min cada).
5. Tratar embriões com proteinase K para permitir a penetração da sonda durante a hibridação. A quantidade de proteinase K e a duração do tratamento depende do tecido que pretende examinar e a idade do embrião. Tecido mais superficial e embriões menores exigem K mais curta e menos proteinase, enquanto que os tecidos mais profundos e os embriões mais velhos exigem uma concentração mais elevada e maior tempo de tratamento time para a plena permeabilizar o embrião para a hibridização da sonda. Por exemplo, para detectar Shh no endoderma visceral de embriões em estágio 29 do patim, 30 ug / ml de proteinase K / PBT é incubada durante 20 min à temperatura ambiente.
6. Rapidamente lavar embriões em PBT para lavar proteinase K.
7. Para desactivar proteinase K, embriões postfix com 4% PFA, glutaraldeído a 0,2% em PBT durante 20 min, agitando suavemente.
8. Lavar duas vezes durante 10 min com PBT.
9. 1. Para pré-hibridização, adicionar 2-3 ml de pré-aquecido solução de hibridização para os embriões, apenas o suficiente para cobri-los. Agitar suavemente num banho de água aquecida a 70 ° C durante 1 h.
   2. Para preparar a solução de hibridização, de pré-aquecimento da sonda de ARN a 70 ° C durante 10 min e arrefecer em gelo. Diluir ul 15-20 de sonda de ARN de 2 ml de solução de hibridação fresco pré-aquecido, para obter uma concentração final de 0,5-1,0 ug / ml. Remover pré-hybe e adicionar sonda de RNA diluído para embriões. Embriões devem ser cobertos por apenas uma solução, umadd solução de hibridação mais se necessário. Tampa firmemente seguro do frasco de cintilação. Hibridizar balançando suavemente num banho de água aquecida a 70 ° C durante a noite.

4. Mensagem lavagens de hibridação e hibridação Antibody

1. Remover a solução de hibridação com a sonda a partir de embriões e colocar num frasco de cintilação de fresco ou o tubo de Eppendorf. A sonda pode ser armazenada a -20 ° C e reutilizada no futuro. Para pós-hibridação lavagens, embriões colocar num NetWell sentado numa placa de cultura de tecidos de 6 poços.
2. Lavar 3 vezes durante 30 min em cada pré-aquecido Solução # 1, agitando a 70 ° C.
3. Lavar 3 vezes durante 30 min em cada pré-aquecido Solução # 2, agitando a 70 ° C.
4. Lavar 3 vezes durante 5 min cada em TBST, balançando a temperatura ambiente.
5. Pré-bloqueio com soro de ovelha a 10% inactivado pelo calor, em TBST durante 1 hora, agitando à temperatura ambiente.
6. Transferir embriões de NetWell para um frasco de vidro de cintilação fresco. Adicionar anti-DIGFragmentos Fab (1:5000) no soro de ovelha 1% inactivado pelo calor / TBST de embriões. Agitar durante a noite a 4 ° C.

5. Hibridação de anticorpos pós Lava

1. Remover o anticorpo e descarte. Embriões lugar de volta em NetWell para lavagens.
2. Lavar 3 vezes durante 5 min cada em TBST, agitando à temperatura ambiente
3. Lavar pelo menos 6 vezes, durante 1 h cada, agitando à temperatura ambiente.
4. Lavar durante a noite em TBST, agitando a 4 ° C. À medida que as lavagens de anticorpos pós ajudar a reduzir a coloração de fundo, a maximização do número e da duração da lavagem é preferível. Os embriões são rotineiramente lavados em TBST, a 4 ° C, durante o fim de semana.

6. Detecção de Sonda

1. Maquiagem solução NTMT fresco e filtrar esterilizar.
2. Rejeitar a solução TBST lavagem e embriões lugar em um frasco de vidro limpo de cintilação. Lavar 3 vezes em embriões NTMT fresco durante 10 minutos cada, à temperatura ambiente, de balanço.
3. Remover NTMT lavar e adicionar mistura de reaçãode 1 x NBT / BCIP de 1 x NTMT. Uma vez que estes reagentes são sensíveis a luz, frasco de cintilação de cobertura em folha de rocha e à temperatura ambiente.
4. Monitorar reacção de cor a cada 15 minutos até que a expressão do gene desejado é claramente visível. Sondas fortes podem demorar tão pouco como 10 minutos para se desenvolver. Sondas fracos pode levar 1-2 horas. Não deixe reação ir por muito tempo ou coloração de fundo vão começar a aparecer (o embrião inteiro começa a virar uma cor maçante roxo ou marrom).
5. Lavar 2 vezes durante 10 minutos cada em PBT, à temperatura ambiente, de balanço.
6. Embriões Postfix em paraformaldeído a 4%, glutaraldeído a 0,1% durante 1 hora à temperatura ambiente. Os embriões podem ser indefinidamente loja em fixador, a 4 ° C.
7. Visualize embriões com um estereomicroscópio de dissecação. Para produzir um fundo azul claro para fotos, embriões lugar em um prato com pré-endurecido de agarose 1% / PBS.

7. Os resultados representativos para I. Mount RNA Total de hibridação in situ em elasmobrânquios marinhos

RNA montagem inteira in situ A expressão de descrever de Sonic hedgehog (Shh) e Hoxa13 em embriões de skate são mostrados na Figura 1. A expressão de Shh em vertebrados superiores é encontrado no endoderma notocorda e intestino e este padrão de expressão é conservada no patim (Figura 1a) ^8,9. Elasmobrânquios marinhos têm um único método de regulação osmótica que usa a glândula rectal para sais secretam. Hoxa13 expressão é elevada na glândula desenvolvimento rectal (Figura 1b) ^10. Hoxa13 papel produto do gene na padronização da glândula retal permanece desconhecida.

II. Inclusão em parafina e Seccionamento Tissue Elasmobranch

1. Colheita e preparação do tecido

1. Dissecar tecido desejado e fixar em formol 10% por 24-48 horas, balançando a temperatura ambiente. Paraformaldeído a 4% (PFA) pode também ser usado como um fixador(Ver discussão).
2. Lavar a fixador de lavagem em PBS, três vezes, durante 30 minutos cada. Dependendo do tamanho do tecido, os tempos de lavagem pode ser diminuído para 10 min ou aumentada para 1 hr.
3. Desidratar embriões por lavagem através de uma série de etanol a 25%, 50% e 75% de etanol: PBS de balanço à temperatura ambiente. Mais uma vez, o tempo para cada lavagem dependerá do tamanho do tecido. Por 0,5 cm ³ de tecido, incubar cada lavagem durante 15 min. Aumentar o tempo de pedaços maiores. Se o armazenamento a longo prazo do tecido é desejada, um adicional de lavar duas vezes em etanol a 75% e armazenar a -20 ° C durante até um ano. Caso contrário, prossiga para a próxima etapa.
4. Além disso desidratar por lavagem 3 vezes em etanol a 100% durante 15 minutos cada, agitando.

2. Inclusão em parafina e Seccionamento

1. Esclarecer tecido por lavagem duas vezes em xilol durante 5 minutos cada em frascos de vidro com tampas de cintilação com tampa de rosca. Xileno tornará o tecido frágil, portanto, não exceder um total de 10 minutos para sehes. O tecido deve olhar translúcido quando você segurá-la contra a luz. Se o tecido é ainda muito opaco após duas lavagens, fazer uma lavagem adicional em xileno durante 5 minutos e, em seguida, continuar com o protocolo. Apenas lidar com xileno dentro de uma capela com luvas.
2. Remover xileno e preencher o frasco de cintilação 2/3 cheio com parafina derretida. Incubar em forno a 60 ° C durante 30 min. Ao colocar parafina no frasco, você vai notar a parafina solidificar ao longo das laterais do frasco. Colocar o frasco no forno e permite a parafina para re-dissolver-se durante alguns minutos. Tomar o frasco para fora do forno e dar a solução de um redemoinho para misturar rápida e substitua no forno por resto de incubação.
3. Parafina Repeat incubações mais duas vezes durante 30 min.
4. Incubar em parafina duas vezes por uma hora cada. Parafina alterar uma última vez e incubar durante a noite nos 60 ° C forno.
5. No dia seguinte, colocar o tecido em uma câmara aquecida e banho de parafina se sob vácuo durante 2-3 hr. Isto irá facilitar a infiltração de parafina para o tecido e remover quaisquer bolhas de ar. Para alguns tipos de tecido magro, de um passo de vácuo pode não ser necessária, mas é necessário que os embriões inteiros ou do tracto digestivo e outros órgãos com compartimentos luminais.
6. Após vácuo facilitada a infiltração de tecido tecido local, num molde de metal com parafina fundida e arrefecer sobre uma placa de gelo. Deixar em gelo ou a 4 ° C durante a noite, antes de tentar remover o tecido a partir do molde. Os blocos de parafina do tecido pode ser armazenado indefinidamente a 4 ° C.
7. Colocar o bloco de parafina em um micrótomo e cortar 8 seções jam. Secções deve ser lançada sobre um banho de água aquecida a 48 ° C e montados em lâminas de vidro SuperFrost * Plus.
8. Lâminas secas durante a noite num forno de 37 ° C.
9. Secções armazenar a 4 ° C até ser necessário.

III. Alcian Blue / Red Rápido Nuclear mancha de tecido Elasmobranch

1. Alcian Blue Stain para mucinas

1. Lugar desliza com seções voltadas para cima em um aquecedor de slides. Derreter durante 45 min.
2. Lugar desliza em um suporte de slides. Todas as soluções conseqüentes estão contidas em banheiras dentro de uma capela. As lâminas são lavadas por transferi-los de uma cuba com uma solução para o outro. Certifique-se de que os níveis de solução nas banheiras de cobre os slides, os tecidos dos slides são completamente submerso. Dissolver parafina por lavagem 2 vezes as lâminas em xileno durante 5 minutos cada.
3. Lavar as lâminas duas vezes com etanol a 100% durante 1 minuto cada.
4. Rehidratar as lâminas em uma série de etanol (75%, 50%, etanol a 25%) de lavagem em cada solução durante 1 min. Lave em _dH2O durante 1 min.
5. Mancha de solução de azul Alcian, pH 2,5, durante 15 min.
6. Desenvolver a mancha de lavagem em água corrente durante 3 min. Mergulhe de vez em dH ₂ O.
7. Contracoloração em solução contracoloração Nuclear Fast Red, durante 10 min.
8. Lavar em água corrente durante 3 minutos e mergulhe _em dH2O uma vez.
9. Desidrataçãodrate em séries de etanol (25%, 50%, 75%, 100%, 100%), durante 20 depressões cada, ou 1 min cada. Lavar duas vezes em xilol durante 5 minutos cada. Monte com DPX meio de montagem e lamínulas. Permitir a montagem de médio a seco e endurecer por 48 horas na capela antes de manipular slides.

Resultados

Exemplos de coloração com azul de alcian em diferentes regiões do L. trato digestivo erinacea são mostrados na Figura 2. Mucina ácida contendo células globlet são claramente visíveis pelo alcian azul mancha ao longo do trato digestivo. A distribuição das mucinas ácidas difere em diferentes regiões do tracto digestivo, o que reflecte diferenças na função. Mucinas ácidas são escassamente produzido no intestino e cloaca espiral, enquanto que uma alta concentração de muc...

Discussão

Os protocolos apresentados são os métodos clássicos para monitorar a expressão de genes e identificação de tipos de células diferenciadas, e têm sido adaptadas para utilização em elasmobrânquios marinhos. Outras modificações destes protocolos pode ser necessária para se adaptar a diferentes espécies de elasmobrânquios.

A preocupação mais comum em relação a todo o RNA mount in situ 's é o risco de contaminação por RNase e assim a degradação da sonda de RN...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 x transcription buffer	Roche	11-465-384-001
DIG-RNA labeling mix	Roche	11-277-073-910
RNAse inhibitor	Roche	03-335-399-001
RNA polymerase - SP6	Roche	10-810-274-001
DNAseI, RNAse-free	Roche	10-776-785-001
Yeast RNA	Invitrogen	15401-029
CHAPS	EMD-Millipore	220201
heparin	Sigma-Aldrich	H4784
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Research Organics	2106D
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17
Netwell inserts	Electron Microscopy Sciences	64713-00	Netwells for use in 6-well tissue culture dishes
6-well tissue culture plate	Corning	3516
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
formamide	Fisher	BP227500
Proteinase K	Invitrogen	59895 (AM2542)
NBT		11585029001
BCIP	Roche	11585002001
Hydrogen peroxide, 30%	EMD	HX0635-1
Sheep serum	VWR	101301-478
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
tRNA	Roche	10-109-541-001
Anti-DIG Fab Fragments	Roche	1137-6623
Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.
1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5	Electron Microscopy Sciences	26323-01
Nuclear Fast Red	Electron Microscopy Sciences	26078-05
DPX Mountant	Electron Microscopy Sciences	13510
Paraffin (Paraplast X-tra)	McCormick Scientific	39503002
10% Formalin, NBF	VWR	95042-908
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
Stainless steal base molds	Tissue-Tek	4161-4165	Multiple sizes available.
Cassettes	Tissue-Tek	4170
Slide warmer	Fisher-Scientific	12-594Q
Tissue Embedder	Leica Microsystems	EG1160
Microtome, rotary	Leica Microsystems	RM2235
Tissue-Tek Slide Staining Set	Electron Microscopy Sciences	62540-01
Tissue-Tek 24-Slide Holder	Electron Microscopy Sciences	62543-06
Superfrost*Plus slides	Fisherbrand	12-550-17
Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.