ARN<em&gt; In situ</emHybridation&gt; en embryons entiers de montage et histologie Adapté pour les élasmobranches marins

Résumé

En combinant les méthodes de montage ARN ensemble In situ et l'histologie, l'expression des gènes peuvent être liés aux décisions du destin cellulaire dans l'embryon en développement. Ces méthodes ont été adaptées aux élasmobranches marins et faciliter l'utilisation de ces animaux comme des organismes modèles pour les études biomédicales, la toxicologie et comparative.

Résumé

Élasmobranches marins sont évalués modèles animaux pour des études biomédicales et de la génomique car ils sont les vertébrés les plus primitifs pour avoir l'immunité adaptative et des mécanismes uniques pour l'osmorégulation ^1-3. Comme les plus primitives de vie des vertébrés à mâchoire-avec des appendices paires, les élasmobranches sont un modèle évolutif important, en particulier pour les études de l'évolution et de développement. Élasmobranches marins ont également été utilisés pour étudier la toxicologie aquatique et la physiologie du stress en relation avec ^le changement climatique ^4. Ainsi, le développement et l'adaptation des méthodes est nécessaire pour faciliter et étendre l'utilisation de ces vertébrés primitifs à de multiples disciplines biologiques. Ici, je présente l'adaptation réussie de l'ARN monture toute hybridation in situ et des techniques histologiques pour étudier l'expression des gènes et histologie chez les élasmobranches.

Suivi de l'expression des gènes est un outil caractéristique de biologie développementalegues, et il est largement utilisé pour étudier les processus de développement ^5. ARN monture toute hybridation in situ permet la visualisation et la localisation des transcrits de gènes spécifiques dans les tissus de l'embryon en développement. Le modèle d'expression d'un message d'un gène peut donner un aperçu de ce que les processus de développement et les décisions du destin cellulaire un gène peut contrôler. En comparant le profil d'expression d'un gène à différents stades de développement, le gain de connaissance sur la façon dont le rôle d'un gène changements au cours du développement.

Alors que l'ensemble de montage in situ de l 'offre un moyen de localiser l'expression du gène des tissus, des techniques histologiques permettent l'identification des types de cellules différenciées et des tissus. Colorations histologiques ont des fonctions variées. Taches générales sont utilisées pour mettre en évidence la morphologie des cellules, par exemple l'hématoxyline et à l'éosine pour la coloration générale de noyaux et le cytoplasme, respectivement. D'autres taches peuvent mettre en évidence cellule spécifiquetypes. Par exemple, le bleu alcian tache rapportée dans cet article est une tache largement utilisé pour identifier mucosaccharides cationique. La coloration du tube digestif avec le bleu alcian peut identifier la répartition des cellules caliciformes qui produisent mucosaccharides. Les variations de constituants mucosaccharide sur les peptides courts distinguer les cellules caliciformes par fonction au sein de l'appareil digestif ^6. À l'aide de l'ARN de montage ensemble des méthodes in situ d 'histochimique et en même temps, les décisions destin cellulaire peut être relié à l'expression spécifique du gène.

Bien que l'ARN in situ de l 'histochimie et sont largement utilisés par les chercheurs, leur adaptation et leur utilisation chez les élasmobranches marins ont rencontré un succès limité et varié. Ici, je présente protocoles élaborés pour les élasmobranches et utilisé sur une base régulière dans mon laboratoire. Même si une nouvelle modification de l'ARN dans la méthode d'hybridation in situ 's peut être nécessaire pour s'adapter aux différentes espèces, les protocoles décrits ici pournir un bon point de départ pour les chercheurs désireux d'adapter l'utilisation des élasmobranches marins à leurs recherches scientifiques.

Protocole

I. ARN Mont entier Hybridation in situ dans les élasmobranches marins

1. Fixation de l'embryon et de préparation

1. Patinage embryons peuvent être organisés selon Ballard ^7. Étapes optimales pour la détection de l'expression du gène dépend du tissu d'intérêt. Pour suivre l'expression des gènes dans le tractus digestif de skate, les étapes 27-30 sont optimales ^7.
2. Disséquer embryons dans du PBS, la séparation des embryons à partir du sac vitellin.
3. Fixer dans 30 ml de paraformaldéhyde à 4% fraîchement préparé (PFA) dans un tube conique de 50 ml à 4 ° C avec doux balancement. Fixer pendant 24 heures.
4. Laver les embryons en PBT, deux fois pendant 15 min, en tournant à la température ambiante. Toutes les recettes de solution pour l'ensemble de montage ARN in situ 's sont inclus (tableau 1).
5. Déshydrater embryons par lavage dans une série de méthanol de 25%, 50% et 75% de méthanol: PBT basculement à température ambiante. La durée des lavages dépend du stade de l'embryon. Pour le pré-neurulation mise en scène embryons, 5 min de chaque lavage de la série méthanol est suffisante. Pour les embryons âgés de plus l'étape 30, les lavages peuvent durer jusqu'à 30 minutes. Pour déterminer si les embryons sont suffisamment pénétré et acclimatés à chaque lavage, tenir le tube en position verticale dans votre main. Si les embryons se déposent au fond du tube, alors vous êtes prêt pour le lavage suivant. Si les embryons flottent à la surface de la solution, la solution de changer et répéter ce que l'étape de déshydratation particulier.
6. Laver deux fois dans le méthanol à 100% pendant 10 min à bascule doucement.
7. Une fois déshydraté à 100% de méthanol, les embryons doivent être conservés à -20 ° C pendant au moins 24 heures avant de procéder avec le protocole. Les embryons ont été correctement stockée à -20 ° C et utilisée pour les montages d'ARN entiers jusqu'à 1 an.

2. Synthèse de l'ARN de la sonde

1. Générer un fragment linéaire du gène dont l'expression que vous voulez détecter. Cela peut être fait soit par amplification par PCR ou linéariser un plasmide avec votre gèned'intérêt. Pour amplifier par PCR, pour choisir un des sites de liaison d'amorces dont flanquent le gène insérer et retenir un des sites de liaison d'ARN polymérase de la région amplifiée. Pour les plasmides couramment utilisés tels que PBS ou pGEM, M15 amorces sens et antisens sont idéales. Alternativement, linéariser un plasmide par digestion de 15 pi de QIAGEN miniprep ADN avec une enzyme qui clive à l'extrémité 5 'du gène. Gel extraire et purifier l'aide du kit QIAquick approprié.
2. La transcription inverse de l'ARN en utilisant la sonde 8 ul de plasmide ou 100 ng de produit PCR linéaire comme un modèle en utilisant l'ARN polymerase appropriée (voir le tableau 2 pour la réaction de transcription).
3. Incuber réaction de transcription inverse pendant 2 heures à 37 ° C.
4. Pour confirmer la réaction, exécutez 1 pl de la réaction de transcription sur un agarose à 1% / TAE gel. Exécuter un gel à 100 mVolts jusqu'à ce que le colorant vient de lancer dans le gel. Une seule bande de premier plan doit être visible. Le fragment d'ADN linéaire modèle peut être à peine visible à un plus haut moléculaireslar poids.
5. Ajouter 1 ul de RNase-Free DNase I de la réaction de transcription et incuber à 37 ° C pendant 15 min.
6. Pour précipité, ajouter 100 pi de TE pH 8, 10 pi 4 M LiCl, 300 ul EtOH à 100% et incuber à 20 ° C pendant au moins 60 minutes ou toute la nuit.
7. Spin pendant 10 min dans une microcentrifugeuse 4 ° C à 14000 rpm.
8. Laver culot avec 70% EtOH et de l'air sec.
9. Resuspendre sonde d'ARN dans 20 pi de dH ₂ O. Ajouter 80 ul de tampon d'hybridation (tampon d'hybridation doit être pré-chauffé à 70 ° C). La sonde peut être stockée dans un tampon d'hybridation de 80% pendant plusieurs mois à -20 ° C ou plus à -80 ° C.

3. Embryon pré-traitement et hybridation

1. Retirer embryons conservés dans le méthanol à 100% à partir de -20 ° C. Pour les plus jeunes embryons passez à l'étape (3,2). Pour plus tard, mis en scène embryons (stade 29/30 <) vous pouvez voir une couche de l'épiderme qui a «levé» hors du corps de l'embryon. Sous le microscope, dissect large de la couche épidermique de maximiser la pénétration de la sonde.
2. Placer les embryons propres flacons à scintillation en verre. Réhydrater les embryons dans la série méthanol inverse décrit ci-dessus: (75%, 50%, 25% de méthanol: PBT) en basculant doucement chaque solution pour chaque 5-30 minutes à température ambiante. Réhydratation complète avec deux lavages de 10 min pour le PBT, doucement chaque bascule.
3. Pour supprimer tous les pigments, les embryons de blanchiment avec du peroxyde d'hydrogène à 6% en PBT pendant 1 heure à température ambiante, se balançant.
4. Retirer le peroxyde d'hydrogène en lavant trois fois en PBT, (bascule à la température ambiante, 10 minutes chacun).
5. Traiter embryons avec la protéinase K pour permettre la pénétration de la sonde lors de l'hybridation. Le montant de la protéinase K et la durée du traitement dépend du tissu que vous voulez examiner et l'âge de l'embryon. Tissus plus superficiels et les plus jeunes embryons nécessitent K plus courts et moins protéinase, tandis que les tissus plus profonds et plus d'embryons exigent une plus grande concentration et un traitement plus long time pleinement perméabiliser l'embryon pour l'hybridation de la sonde. Par exemple, pour détecter Shh dans l'endoderme intestinal des embryons au stade de skate 29, 30 ug / ml de protéinase K / PBT est incubé pendant 20 min à température ambiante.
6. Rincez rapidement les embryons in PBT pour laver la protéinase K.
7. Pour désactiver la protéinase K, les embryons postfix avec 4% de PFA, le glutaraldéhyde 0,2% en PBT pendant 20 min, balançant doucement.
8. Laver deux fois pendant 10 minutes avec du PBT.
9. 1. Pour pré-hybridation, ajouter 2-3 ml de solution d'hybridation préchauffé à des embryons, juste assez pour les couvrir. Balancer doucement dans un bain d'eau chauffée à 70 ° C pendant 1 heure.
   2. Pour préparer la solution d'hybridation, préchauffer sonde d'ARN à 70 ° C pendant 10 minutes et laisser refroidir sur glace. Diluer 15-20 ul de sonde d'ARN à 2 ml de solution d'hybridation frais préchauffé, pour obtenir une concentration finale de 0,5-1,0 g / ml. Retirer pré-Hybe et ajouter dilué sonde d'ARN pour les embryons. Embryons doivent être juste couvert par solution, unjj solution d'hybridation plus si nécessaire. Couvercle bien sûr du flacon à scintillation. Hybrider en basculant doucement dans un bain d'eau chauffée à 70 ° C pendant une nuit.

4. Message d'hybridation et d'hybridation Lavage Anticorps

1. Retirez solution d'hybridation avec la sonde à partir d'embryons et les placer dans un flacon à scintillation frais ou tube Eppendorf. La sonde peut être conservé à -20 ° C et réutilisé dans l'avenir. Pour la post-hybridation lavages, les embryons placer dans un Netwell assis dans une plaque à 6 puits de culture de tissu.
2. Laver 3 fois pendant 30 minutes dans chacune des préchauffé Solution n ° 1, à bascule à 70 ° C.
3. Laver 3 fois pendant 30 minutes dans chacune des préchauffé Solution n ° 2, bascule à 70 ° C.
4. Laver 3 fois pendant 5 minutes chacun dans du TBST, bascule à la température ambiante.
5. Pré-bloc avec du sérum de mouton 10% inactivé par la chaleur dans du TBST pendant 1 heure, se balançant à la température ambiante.
6. Transfert d'embryons de Netwell dans un flacon à scintillation en verre frais. Ajouter anti-DIGFragments Fab (1:5000) dans le sérum de mouton 1% inactivé à la chaleur / TBST aux embryons. Basculez nuit à 4 ° C.

5. Hybridation Anticorps Message Lave

1. Retirez et jetez les anticorps. Embryons replacer dans Netwell pour lavages.
2. Laver 3 fois pendant 5 minutes dans chacune des TBST, se balançant à la température ambiante
3. Laver au moins 6 fois pendant 1 heure chacun, se balançant à la température ambiante.
4. Laver la nuit dans TBST, se balançant à 4 ° C. Comme les lavages d'anticorps post-aider à réduire le bruit de fond, en maximisant le nombre et la durée des lavages est préférable. Les embryons sont régulièrement lavés dans du TBST à 4 ° C, le week-end.

6. Détection de la sonde

1. Maquillage solution NTMT frais et stériliser par filtration.
2. Jeter la solution de lavage TBST et d'embryons place dans un flacon à scintillation en verre propre. Laver 3 fois en embryons NTMT frais pendant 10 min chacune à la température ambiante, à bascule.
3. Retirer NTMT laver et ajouter le mélange de réactionde 1 x NBT / BCIP 1 x en NTMT. Comme ces réactifs sont sensibles à la lumière, couvrir flacon à scintillation dans du papier et du rock à la température ambiante.
4. Surveiller la réaction de couleur toutes les 15 min jusqu'à ce que l'expression du gène désiré est clairement visible. Sondes forts peuvent prendre aussi peu que 10 minutes pour se développer. Sondes faibles peuvent prendre 1-2 heures. Ne laissez pas passer réaction trop longtemps ou coloration de fond commencent à apparaître (l'embryon entier commence à tourner une couleur terne pourpre ou brun).
5. Laver 2 fois pendant 10 minutes dans chacune des évaluations PBT à la température ambiante, à bascule.
6. Postfix embryons dans du paraformaldéhyde à 4%, glutaraldéhyde à 0,1% pendant 1 heure à température ambiante. Les embryons peuvent être indéfiniment magasin dans un fixateur à 4 ° C.
7. Visualisez embryons avec un stéréomicroscope à dissection. Pour produire un fond bleu clair pour les photos, les embryons placer dans un plat avec pré-durci agarose à 1% / PBS.

7. Les résultats représentatifs pour I. ARN Mont entier hybridation in situ chez les élasmobranches marins

ARN monture toute expression in situ de l 'dépeignant de Sonic hedgehog (Shh) et HOXA13 dans des embryons de skate sont présentés dans la figure 1. L'expression de Shh chez les vertébrés supérieurs se trouve dans l'endoderme notochorde et le tube digestif, ce mode d'expression est conservée dans le patin (Figure 1a) ^8,9. Élasmobranches marins ont une méthode unique d'osmorégulation qui utilise la glande rectale de sels sécrètent. HOXA13 expression est élevé dans la glande rectale développement (figure 1b) ^10. HOXA13 rôle dans la structuration produit du gène de la glande rectale demeure inconnue.

II. Paraffine inclusion et la coupe des tissus élasmobranches

1. Récolte et préparation des tissus

1. Disséquer les tissus désiré et fixer formol à 10% pendant 24-48 h, se balançant à la température ambiante. Paraformaldéhyde 4% (PFA) peut également être utilisé comme fixateur(Voir Discussion).
2. Laver fixateur par un lavage dans du PBS, 3 fois pendant 30 min chacun. En fonction de la taille du tissu, le temps de lavage peut être réduit à 10 minutes, ou plus de 1 h.
3. Déshydrater embryons par lavage dans une série d'éthanol de 25%, 50% et 75% d'éthanol: PBS à bascule à la température ambiante. Encore une fois, le temps pour chaque lavage dépendra de la taille du tissu. Pour 0,5 cm ³ tissus, incuber chaque lavage pendant 15 min. Augmenter le temps pour les grandes pièces. Si le stockage à long terme des tissus est souhaitée, lavez deux autres fois dans l'éthanol à 75% et stocker à -20 ° C pendant un maximum d'un an. Sinon, passez à l'étape suivante.
4. En outre déshydrater en lavant 3 fois dans de l'éthanol à 100% pendant 15 min chacun, se balançant.

2. Paraffine inclusion et la coupe

1. Clarifier les tissus par lavage 2 fois dans du xylène pendant 5 min dans chacune des fioles à scintillation en verre à couvercle à bouchon à vis. Xylène rendra le tissu fragile, il ne faut pas dépasser un total de 10 min pour ahes. Le tissu translucide devrait ressembler quand vous le tenez devant une lumière. Si le tissu est encore très opaque après deux lavages, faire un lavage supplémentaire dans le xylène pendant 5 minutes et ensuite avec le protocole. Ne manipulez xylène à l'intérieur d'une hotte avec des gants.
2. Retirer le xylène et remplir le flacon à scintillation aux 2/3 avec de la paraffine fondue. Incuber dans une étuve à 60 ° C pendant 30 min. Lors de la remise de paraffine dans le flacon, vous remarquerez la paraffine solidifier le long des parois de la fiole. Placer le flacon dans le four et laissez la paraffine pour re-dissoudre pendant quelques minutes. Prendre le flacon hors du four et faire tourbillonner la solution d'un mini à mélanger et à remplacer dans le four pour le reste de l'incubation.
3. Répétez la paraffine incubations deux fois plus pendant 30 min.
4. Incuber dans de la paraffine à deux reprises pendant une heure chaque. Changer la paraffine une dernière fois et laisser incuber pendant la nuit dans le four à 60 ° C.
5. Le lendemain, placer le tissu dans une chambre de bain de paraffine chauffée et mise sous vide pendant 2-3 h. Cela facilitera l'infiltration de paraffine dans les tissus et éliminer les bulles d'air. Pour certains types de tissu mince, une étape de vide peut ne pas être nécessaire, mais il est nécessaire pour les embryons entiers ou le tube digestif et d'autres organes avec des compartiments luminales.
6. Après sous vide facilitée infiltration de tissu endroit du tissu, dans un moule métallique avec de la paraffine fondue, et laisser refroidir sur une plaque de glace. Laisser sur la glace ou à 4 ° C pendant la nuit avant d'essayer de retirer le tissu du moule. Les blocs de paraffine de tissu peuvent être conservés indéfiniment à 4 ° C.
7. Bloc de paraffine lieu sur un microtome et coupez 8 sections um. Les articles doivent être flottait sur un bain-marie chauffé à 48 ° C et montées sur des lames de verre SuperFrost Plus *.
8. Lames sèches pendant la nuit dans un four à 37 ° C.
9. Sections conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.

III. Alcian Blue / Red nucléaire rapide Stain of Tissue élasmobranches

1. Alcian Blue Stain pour mucines

1. Lieu glisse aux articles tournés vers le haut sur une glissière chaud. Faire fondre pendant 45 min.
2. Lieu glisse dans un support. Toutes les solutions qui en découlent sont contenus dans des cuves à l'intérieur d'une hotte. Les lames sont lavées en les transférant d'une baignoire avec une solution à l'autre. Assurez-vous que les niveaux de solution dans les cuves couvre les diapositives, les tissus sur les lames soient complètement submergés. Dissoudre la paraffine en lavant diapositives 2 fois dans du xylène pendant 5 min chacun.
3. Laver les lames deux fois avec de l'éthanol à 100% pendant 1 min à chaque fois.
4. Réhydrater les lames dans une série d'éthanol (75%, 50%, éthanol à 25%) dans chaque solution de lavage pendant 1 min. Laver à l'dH ₂ O pendant 1 min.
5. Colorer dans une solution de Bleu Alcian, pH 2,5 pendant 15 min.
6. Développer tache par un lavage à l'eau courante pendant 3 min. Plongez une fois dans dH ₂ O.
7. Contre nucléaire en solution de contraste Fast Red pendant 10 min.
8. Laver à l'eau courante pendant 3 min et plongez dans dH ₂ O en même temps.
9. Dehydéshydrater dans une série d'éthanol (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) pendant 20 immersions chacun, soit 1 min chacune. Laver 2 fois dans du xylène pendant 5 min chacun. Monter avec support de montage DPX et des lamelles. Laisser le milieu de montage à sécher et durcir pendant 48 heures sous la hotte avant de manipuler les diapositives.

Résultats

Exemples de coloration au bleu alcian dans différentes régions du L. erinacea tube digestif sont présentés dans la figure 2. Mucine acide contenant des cellules globlet sont bien visibles par le bleu alcian tache à travers le tube digestif. La répartition des mucines acides diffère dans les différentes régions du tube digestif, ce qui reflète les différences de fonction. Mucines acides sont faiblement produite dans l'intestin en spirale et le cloaque, tandis qu'une concentrat...

Discussion

Les protocoles présentés sont des méthodes classiques de suivi de l'expression des gènes et d'identifier les types de cellules différenciées, et ont été adaptés pour une utilisation chez les élasmobranches marins. D'autres modifications de ces protocoles peut être nécessaire pour s'adapter à différentes espèces d'élasmobranches.

La plus grande préoccupation concernant l'ensemble de montage ARN in situ de l 'est le risque de contamination ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 x transcription buffer	Roche	11-465-384-001
DIG-RNA labeling mix	Roche	11-277-073-910
RNAse inhibitor	Roche	03-335-399-001
RNA polymerase - SP6	Roche	10-810-274-001
DNAseI, RNAse-free	Roche	10-776-785-001
Yeast RNA	Invitrogen	15401-029
CHAPS	EMD-Millipore	220201
heparin	Sigma-Aldrich	H4784
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Research Organics	2106D
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17
Netwell inserts	Electron Microscopy Sciences	64713-00	Netwells for use in 6-well tissue culture dishes
6-well tissue culture plate	Corning	3516
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
formamide	Fisher	BP227500
Proteinase K	Invitrogen	59895 (AM2542)
NBT		11585029001
BCIP	Roche	11585002001
Hydrogen peroxide, 30%	EMD	HX0635-1
Sheep serum	VWR	101301-478
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
tRNA	Roche	10-109-541-001
Anti-DIG Fab Fragments	Roche	1137-6623
Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.
1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5	Electron Microscopy Sciences	26323-01
Nuclear Fast Red	Electron Microscopy Sciences	26078-05
DPX Mountant	Electron Microscopy Sciences	13510
Paraffin (Paraplast X-tra)	McCormick Scientific	39503002
10% Formalin, NBF	VWR	95042-908
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
Stainless steal base molds	Tissue-Tek	4161-4165	Multiple sizes available.
Cassettes	Tissue-Tek	4170
Slide warmer	Fisher-Scientific	12-594Q
Tissue Embedder	Leica Microsystems	EG1160
Microtome, rotary	Leica Microsystems	RM2235
Tissue-Tek Slide Staining Set	Electron Microscopy Sciences	62540-01
Tissue-Tek 24-Slide Holder	Electron Microscopy Sciences	62543-06
Superfrost*Plus slides	Fisherbrand	12-550-17
Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.