RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Özet

RNA tüm montaj yöntemleri birleştirerek In situ Hibridizasyon ve histoloji, gen ekspresyonu gelişen embriyonun hücre kaderi kararlar ile bağlantılı olabilir. Bu yöntemler deniz elasmobranchs uyarlanmış ve biyomedikal, toksikoloji ve karşılaştırmalı çalışmalar için model organizmalar olarak bu hayvanların kullanımını kolaylaştırmak edilmiştir.

Özet

Adaptif bağışıklık var ve osmoregülasyon ^1-3 için benzersiz mekanizmalara sahip en ilkel omurgalılar olarak Deniz elasmobranchs biyomedikal ve genomik çalışmalar için hayvan modellerinin değerlenir. Eşleştirilmiş ekleri ile en ilkel canlı çeneli-omurgalılar olarak elasmobranchs özellikle evrim ve gelişme çalışmaları için, evrimsel önemli bir model vardır. Deniz elasmobranchs ayrıca iklim değişikliğinin ⁴ ilişki sucul toksikoloji ve stres fizyolojisi incelemek için kullanılmıştır. Böylece, metodolojilerin geliştirilmesi ve adaptasyonu kolaylaştırmak ve çoklu biyolojik disiplinlerin bu ilkel omurgalıların kullanımını yaygınlaştırmak için gereklidir. İşte situ hibridizasyon ve gen ekspresyonu ve elasmobranchs hücre histolojisi çalışma histolojik teknikler RNA bütün mount başarılı uyum sunuyoruz.

Gen ekspresyonu İzleme gelişimsel başina bir işaretidir araçtırogists ve yaygın olarak gelişim süreçleri ⁵ incelemek için kullanılır. In situ hibridizasyon RNA bütün montaj gelişen embriyonun dokularda görselleştirme ve belirli bir gen transkript lokalizasyonu için izin verir. Bir genin mesajının ifade desen gelişimsel süreçler ve hücre kaderini belirleyen bir gen kontrol edebilir ne içgörü sağlayabilir. Farklı gelişim aşamalarında bir genin ekspresyonu desen karşılaştırarak, içgörü gelişimi sırasında gen değişikliklerinin nasıl rolüne elde edilebilir.

In situ 's tüm montaj dokuya gen ekspresyonu yerelleştirmek için bir araç sunarken, histolojik teknikler farklılaşmış hücre tipleri ve dokuların tespiti için izin verir. Histolojik lekeleri çeşitli işlevlere sahiptir. Genel lekeleri hücre morfolojisi vurgulamak için kullanılır, örneğin sırasıyla hematoksilen ve çekirdek ve sitoplazma genel boyama için eozin,. Vardır Diğer lekeleri spesifik hücre vurgulayabilirsiniztürleri. Örneğin, alcian mavi mucosaccharides belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir katyonik leke bu yazıda leke. Alcian mavisi ile sindirim sistemi Boyanması mucosaccharides üreten goblet hücrelerinin dağılımının tespit edebilirsiniz. Kısa peptidler üzerine mucosaccharide bileşenlerinin değişimleri sindirim sistemi ⁶ içinde işlevi tarafından goblet hücreleri ayırt. Eşzamanlı in situ 's ve histokimyasal yöntemlerle RNA bütün montaj kullanarak, hücre kaderini belirleyen gen-spesifik ekspresyonu ile bağlantılı olabilir.

RNA in situ 's ve histokimyası yaygın olarak araştırmacılar tarafından kullanılıyor olmasına rağmen, deniz elasmobranchs onların uyum ve kullanımı sınırlı ve çeşitli başarı tanıştım. İşte elasmobranchs için geliştirilen ve benim laboratuvarda düzenli olarak kullanılan protokoller mevcut. In situ 'in hibridizasyon metodu ile de RNA daha fazla değişiklik farklı türler uyum için gerekli olsa da, burada p açıklanan protokolonların bilimsel araştırmalar için deniz elasmobranchs kullanımı uyarlamak isteyen araştırmacılar için güçlü bir başlangıç ​​noktası rovide.

Protokol

Deniz Elasmobranchs in situ Hibridizasyon I. RNA Tüm Dağı

1. Embriyo Fiksasyon ve Hazırlık

1. Skate embriyolar Ballard ^7'ye göre düzenledi olabilir. Gen ifadesinin saptanması için en uygun aşamada ilgili doku bağlıdır. Paten sindirim sisteminde gen ekspresyonu izlemek için, aşamaları ^27-30 Temmuz optimaldir.
2. Yolk kesesi gelen embriyolar ayıran, PBS içine embriyo teşrih.
3. 4'e bir 50 ml konik boru ° C'de hafif sallama ile taze olarak yapılmış% 4 paraformaldehit (PFA), 30 ml düzeltildi. 24 saat için düzelt.
4. Iki kez oda sıcaklığında 15 dakika dönen için, PBT embriyonlar yıkayın. In situ 's RNA bütün montaj için tüm çözüm tarifler (Tablo 1) dahildir.
5. Oda sıcaklığında, PBT sallanan: metanol% 25 oranında dizi, en az% 50 ve% 75 metanol içinde yıkama ile embriyolar kurutmak. Yıkama süresi embriyo evresine bağlıdır. Ön-N içineurulation embriyolar aşamalı, metanol seride her yıkamadan 5 dakika yeterlidir. Aşamada 30 daha eski embriyolar için, yıkama 30 dk kadar sürebilir. Embriyolar yeterince nüfuz ve her yıkama için acclimated olup olmadığını belirlemek için, elinizde dik tüp tutun. Embriyoların tüpün dibine çöker varsa, o zaman bir sonraki yıkama için hazır. Embriyoların çözüm üst şamandıra, çözüm değiştirmek ve o belirli dehidratasyon adımı tekrarlayın.
6. Nazikçe sallanan 10 dakika boyunca% 100 metanol içinde iki kere yıkayın.
7. % 100 metanol kez susuz, embriyolar protokol ile devam etmeden önce en az 24 saat boyunca -20 ° C'de muhafaza edilmelidir. Embriyolar başarıyla -20 ° C'de saklanabilir ve en fazla 1 yıl için RNA bütün bağlar için kullanılmıştır.

2. RNA Prob Sentezi

1. Ifade algılamak istediğiniz genin doğrusal bir parçası oluşturun. Bu PCR amplifikasyonu yoluyla yapılabilir ya da gen içeren bir plazmid doğrusallaştırma edilebilirilgi. PCR ile yükseltmek için, kimin bağlayıcı siteleri kanadını geni amplifiye bölgede RNA polimeraz bağlayıcı siteleri eklemek ve korumak primerler seçin. Böyle PBS veya pGEM, M15 ileri ve geri primerleri gibi yaygın olarak kullanılan plazmidler için idealdir. Alternatif olarak, genin 5 'ucunda parçalayarak bir enzim ile QIAGEN miniprep DNA 15 ul sindirilmesi ile linearize bir plazmid. Jel ayıklamak ve uygun QIAquick kiti kullanılarak arındırmak.
2. Uygun RNA polimeraz (transkripsiyon reaksiyonu için bakınız Tablo 2) ile, bir şablon olarak doğrusal PCR ürününün plazmid ya da 100 ng 8 ul kullanılarak RNA probu uyarlamak Ters.
3. 37 °, 2 saat boyunca ters transkripsiyon reaksiyon ° C. inkübe
4. Reaksiyon doğrulamak için, bir% 1 agaroz / TAE jeli üzerinde transkripsiyon reaksiyon 1 ul çalıştırın. Boya sadece jel çalıştırmak kadar 100 mVolts jel çalıştırın. Tek bir belirgin bant görünür olmalıdır. Lineer DNA şablonu fragmanı yüksek Moleküler azından belli belirsiz görünür olabilirlar ağırlığı.
5. 15 dakika boyunca 37 ° C 'de transkripsiyon reaksiyonu ve inkübe RNAse serbest DNAz I 1 ul ekle.
6. Çökelti etmek için, en az 60 dk ya da gece boyunca -20 ° C'de 100 ul TE pH 8, 10 ul 4 M LiCI, 300 ul% 100 EtOH ve inkübe edin.
7. 14.000 rpm, 4 ° C de 10 dakika mikrofüj için Spin.
8. % 70 EtOH ve kuru hava ile pelet yıkayın.
9. DH ₂ O 20 ul yeniden süspanse RNA probu Hibridizasyon tamponu 80 ul (hibridizasyon tamponu 70 ° C ile ön ısıtmaya tabi olmalıdır) ekleyin. Prob -80 -20 ° C veya daha az birkaç ay için% 80 hibridizasyon tamponu saklanabilir ° C

3. Embriyo Tedavi öncesi ve Hibritleşme

1. -20 ° C ila% 100 metanol içinde saklanan embriyolar kaldırma Genç embriyolar için adım (3.2) ile devam edin. Daha sonra sahneye embriyolar (evre 29/30 <) Eğer embriyonun vücudu kapalı 'kaldırdı' olan bir epidermis tabakası görebilirsiniz. İçin Mikroskop altında, dikkatle dissprob penetrasyonu maksimize etmek epidermal tabakasını ect.
2. Temiz cam sintilasyon şişeleri Yeri embriyolar. Yukarıda tarif ters metanol seride embriyolar rehidrate: (% 75,% 50,% 25 metanol: PBT), oda sıcaklığında 5-30 dakika için hafifçe her biri her bir çözelti ile sallanan. 10 dakika her PBT iki yıkamadan, hafifçe sallanan ile komple rehidrasyon.
3. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBT% 6 oranında hidrojen peroksit, sallama ile herhangi bir pigment, ağartıcı embriyolar kaldırmak için.
4. , PBT içinde üç kere yıkama ile hidrojen peroksit çıkarın (oda sıcaklığında, 10 dakika sallama her biri).
5. Hibridizasyon sırasında sondanın penetrasyonu sağlamak için proteinaz K ile embriyolar davranın. Proteinaz K miktarı ve tedavi süresine incelemek istediğiniz doku ve embriyonun yaşına bağlıdır. Derin dokulara ve yaşlı embriyolar daha yüksek bir konsantrasyon ve uzun tedavi tim gerektiren süre daha yüzeyel doku ve genç embriyolar, daha kısa ve daha az proteinaz K gerektirire tam prob hibridizasyon için embriyo geçirgenliği. Örneğin, 29, aşama paten embriyoların bağırsak endodermal içinde Shh tespit etmek için, 30 ug / proteinaz K / PBT mL, oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
6. Hızla proteinaz K. uzak yıkamak için PBT embriyoların durulama
7. % 4 PFA, 20 dakika boyunca PBT% 0.2 glutaraldehit, hafifçe sallanan proteinaz K, postfix embriyolar devre dışı bırakmak için.
8. PBT ile 10 dakika boyunca iki kez yıkanır.
9. 1. Ön hibridizasyon için, embriyolar onları karşılamak için yeterli önceden ısıtılmış hibridizasyon çözeltisi 2-3 ml ekleyin. 1 saat boyunca 70 ° C 'de ısıtılmış bir su banyosu içinde yavaşça sallayın.
   2. ° C 10 dk ve buz üzerinde serin için 70 hibridizasyon çözüm, ön ısıtma RNA probu hazırlamak. 0.5-1.0 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için, taze, önceden ısıtılmış hibridizasyon çözeltisi, 2 ml RNA probu 15-20 ul seyreltin. Önceden hybe çıkarın ve embriyolar için seyreltilmiş RNA probu ekleyin. Embriyolar adil bir çözüm ile kaplanmış olmalıdır, birdd daha hibridizasyon çözüm gerekiyorsa. Sintilasyon flakon Sıkıca güvenli kapak. 70 ° C'da gece boyunca bir sıcak su banyosu içinde yavaşça sallanarak ile melezleşir.

4. Hibritleşme Yıkama ve Antikor Hibridizasyon Ver

1. Taze bir sintilasyon flakon veya Eppendorf tüp içinde embriyo ve yerden probu ile hibridizasyon çözüm çıkarın. Prob -20 ° C'de saklanan ve ileride yeniden kullanılabilir. Post-hibridizasyon yıkar, bir Netwell yer embriyolar 6-iyi doku kültürü plaka oturmuş.
2. 30 dakika önceden ısıtılmış Çözelti içinde her # 1, 70 ° C 'de sallanan için 3 kere yıkayın
3. 30 dakika önceden ısıtılmış Çözelti içinde her bir # 2, 70 ° C 'de sallanan için 3 kere yıkayın
4. Oda sıcaklığında sallanan TBST içinde 5 dakika her biri için 3 kere yıkayın.
5. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca sallanan TBST içinde% 10 ısı ile inaktive edilmiş koyun serum ile yapılan ön blok.
6. Netwell bir bardak taze sintilasyon flakon embriyolar transfer. Anti-DIG ekle% 1 ısı inaktive koyun serum / embriyoların TBST Fab Fragments (1:5,000). 4 ° C'de gece boyunca sallayın

5. Mesaj Antikor Hibridizasyon yıkar

1. Antikor çıkartın ve atın. Yıkama için geri Netwell içine yerleştirin embriyolar.
2. Oda sıcaklığında, sallanan TBST içinde 5 dakika her biri için 3 kere yıkayın
3. Oda sıcaklığında sallanan, 1 saat her biri için en az 6 kez yıkayın.
4. 4 ° C'de, sallanan TBST gecede yıkayın Sonrası antikor yıkar plan boyama azaltmak yardımcı olarak, yıkama sayısını ve süresini maksimize tercih edilir. Embriyolar rutin bir hafta sonu boyunca, 4 ° C de TBST yıkanır.

6. Prob Algılama

1. Taze NTMT çözüm Makyaj ve sterilize filtre.
2. Temiz bir bardak sintilasyon flakon TBST yıkama solüsyonu ve yerde embriyolar atın. Oda sıcaklığında, sallanan 10 dakika her biri için taze NTMT embriyoların 3 kere yıkayın.
3. NTMT reaksiyon karışımı yıkayın ve Kaldır eklentisi1 x NBT / NTMT 1 x BCIP arasında. Bu reaktifler ışığa duyarlı olduğundan, oda sıcaklığında folyo ve kaya sintilasyon şişenin kapağı.
4. İstenilen gen ekspresyonu açıkça görünür oluncaya kadar renk reaksiyonu her 15 dk izleyin. Güçlü probları geliştirmeye kadar az 10 dakika sürebilir. Zayıf probları 1-2 saat sürebilir. Reaksiyon çok uzun veya arka plan boyama (bütün embriyo donuk mor ya da kahverengi rengini açmak için başlar) görünmeye başlayacaktır için gitmesine izin vermeyin.
5. Oda sıcaklığında, sallanan at PBT her birinde 10 dk için 2 kez yıkayın.
6. % 4 paraformaldehit içinde Postfix embriyolar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.1 glutaraldehid. Embriyolar 4 ° C'de fiksatif süresiz mağaza olabilir
7. Diseksiyon steriomikroskop embriyolar görselleştirin. Ön sertleştirilmiş% 1 agaroz / PBS ile bir tabak resimleri, yer embriyolar için açık mavi arka plan üretmek için.

7. Deniz elasmobranchs in situ hibridizasyon I. RNA Tüm Mount Temsilcisi Sonuçlar

Sonic hedgehog (Shh) ve paten embriyolar Hoxa13 in situ 'in ekspresyonu gösteren bütün RNA bağlama Şekil 1' de gösterilmiştir. Yüksek omurgalılarda Şşş İfade Notokordun ve gut endoderm bulunur ve bu ifade deseninin paten (Şekil 1a) ^8,9 korunur. Deniz elasmobranchs salgılar tuzları rektal bezi kullanan osmoregülasyon benzersiz bir yöntem var. Hoxa13 ifade (Şekil 1b) ¹⁰ gelişmekte olan rektal bezinde yüksek. Rektal bezi bilinmemektedir desenleme Hoxa13 gen ürünü rolü.

II. Parafin Gömme ve Elasmobranch Doku Kesit

1. Hasat ve Doku hazırlanması

1. İstenilen doku inceleyin ve oda sıcaklığında sallanan, 24-48 saat süreyle% 10 formalin içinde düzeltmek. % 4 paraformaldehit (PFA), aynı zamanda, bir tespit maddesi olarak kullanılabilirler(Tartışma bakın).
2. 30 dakika her biri için, 3 kere PBS ile yıkanarak fiksatif yıkayın. Doku ve boyutuna bağlı olarak, yıkama kere 10 dakika için azaltılabilir ya da 1 saat için artmıştır.
3. Oda sıcaklığında PBS sallanan:% 25,% 50 ve% 75 etanol, etanol dizi yıkama ile embriyolar kurutmak. Yine, her bir yıkama için zaman doku boyutuna bağlı olacaktır. 0.5 cm doku ³ için, 15 dakika için her bir yıkama inkübe edilir. Büyük parçalar için süreyi artırın. Doku ve uzun süreli depolama arzu edilirse, bir yıla kadar -20 ° C'de% 75 etanol ve depo içinde ek bir iki kere yıkayın. Aksi takdirde bir sonraki adıma geçin.
4. Ayrıca sallanan, her biri için 15 dakika% 100 etanol içinde 3 kere yıkama ile kurutmak.

2. Gömülmesi ve Kesit Parafin

1. Vidalı kapaklı kapaklı cam sintilasyon şişeleri 5 dk her ksilen 2 kez yıkanarak doku netleştirin. Ksilen doku kırılgan hale getirecek, tabii ki için 10 dakikalık bir toplam aşmayanhes. Eğer bir ışık o kadar tuttuğunuzda doku saydam bakmak gerekir. Doku iki yıkamadan sonra hala çok opak ise, protokol ile devam sonra 5 dakika için ksilen içinde ek bir yıkama yapmak ve. Sadece eldiven ile bir davlumbaz içine ksilen anlaştım.
2. Ksilen çıkarın ve erimiş parafin ile 2/3 dolu sintilasyon flakon doldurun. 30 dakika için bir 60 ° C fırın içinde inkübe edin. Şişenin içine parafin koyarak zaman, parafin flakon kenarları boyunca katılaşmaya göreceksiniz. Fırında şişeye yerleştirin ve parafin, bir kaç dakika için yeniden çözmek için izin verir. Fırından çıkardığınız flakon çıkarın ve çözüm inkübasyon kalanı için fırında karıştırmak ve değiştirmek için hızlı girdap verir.
3. Tekrar parafin 30 dakika boyunca iki kez daha inkübasyonlar.
4. Bir saat her iki parafine inkübe edin. Parafin son bir kez değiştirin ve 60 ° C fırında gece inkübe.
5. Ertesi gün, 2-3 saat için vakum altında ısıtılmış bir parafin haznesi ve yerinde doku yerleştirmek. Bu doku içine parafin geçişlerini kolaylaştırmak ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak olacaktır. Ince doku bazı tipleri için bir vakum adım gerekli değildir, ancak bu insan embriyosu ya da sindirim sistemi ve lümen bölmeli diğer organlar için gerekli olabilir.
6. Erimiş parafin ve bir buz plaka üzerinde serin bir metal kalıp içinde doku, yer doku infiltrasyonu vakum kolaylaştırdı sonra. Kalıptan doku çıkarmak için çalışmadan önce buz üzerinde ya da 4 ° C'da gece boyunca bekletin. Dokusunun parafin blokları 4 ° C'de süresiz olarak saklanabilir
7. Sıra parafin bir mikrotom üzerine blok ve 8 mikron bölümleri kesmek. Bölümler ° C 48 ısıtılmış bir su banyosu üzerinde süzülüyor ve cam Superfrost * Plus slaytlar monte edilmelidir.
8. Bir 37 ° C fırın içinde gece boyunca kurumaya kayar.
9. Ihtiyaç ° C ye kadar 4 Mağaza bölümleri.

III. Alsiyan Mavi / Nükleer Hızlı Kırmızı Elasmobranch Doku Leke

1. Alsiyan Mavi Mukinler için Leke

1. Sıra sıcak bir slayt üzerinde yukarı bakacak bölümleri ile slaytlar. 45 dakika eritin.
2. Sıra bir slayt tutucunun içine kayar. Tüm sonucu çözümleri davlumbaz içine küvetler bulunur. Slaytlar başka bir solüsyon ile bir küvet arasında transfer ile yıkanır. Küvetler çözüm düzeyleri slaytları kapsar emin olun; slaytlarda dokuların tamamen su altında. 5 dakika her ksilen slaytları 2 kez yıkanarak parafin eritilir.
3. 1 dakika her biri için% 100 etanol ile slaytlar iki kez yıkayın.
4. 1 dakika için her çözüm yıkama bir etanol dizi slaytları (% 75,% 50,% 25 etanol) rehidrate. 1 dakika dH ₂ O yıkayın.
5. 15 dakika Alsiyan Mavi Çözüm, pH 2.5 Leke.
6. 3 dakika süreyle akan su ile yıkama ile leke geliştirin. DH ₂ O zamanlar batırın
7. 10 dakika için Nükleer Fast Red Counterstain çözelti içinde Counterstain.
8. 3 dakika süreyle akan su içinde yıkayın ve dH ₂ O bir kez daldırma.
9. Dehidrnateeğimler 20 her biri, ya da 1 dakika her biri için bir dizi etanol (% 25,% 50,% 75,% 100,% 100) halinde aminoasit, karbonhidrat. 5 dakika her ksilen 2 kez yıkayın. DPX montaj orta ve lamelleri ile monte edin. Slaytlar manipüle önce davlumbaz 48 saat süreyle kuru ve sertleşmeye orta montaj izin ver.

Sonuçlar

L. farklı bölgelerinde alcian blue boyama örnekleri erinacea sindirim sistemi Şekil 2 'de gösterilmiştir. Globlet hücreleri içeren Asit musin sindirim sistemi boyunca leke alcian blue tarafından net bir şekilde görülebiliyor. Asit müsin dağılımı dolayısıyla fonksiyon farklılıkları yansıtan, sindirim sisteminin farklı bölgelerinde farklıdır. Asit müsin yüksek konsantrasyon distal barsakta (2b Şekil 2a ve 2c karşılaşt...

Tartışmalar

Sunulan protokoller gen ekspresyonu izlenmesi ve farklılaşmış hücre türleri tespit için klasik yöntemlerdir ve deniz elasmobranchs kullanım için adapte edilmiştir. Bu protokollerin ayrıntılı değişiklikler farklı elasmobranch türlerin uyum için gerekli olabilir.

In situ 's RNA bütün montaj ile ilgili en yaygın endişe RNaz kontaminasyon riski ve böylece RNA probu ve endojen mesajları kayıplardır. İki yönleriyle dikkate alınması gerekir: Spastine Özg...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 x transcription buffer	Roche	11-465-384-001
DIG-RNA labeling mix	Roche	11-277-073-910
RNAse inhibitor	Roche	03-335-399-001
RNA polymerase - SP6	Roche	10-810-274-001
DNAseI, RNAse-free	Roche	10-776-785-001
Yeast RNA	Invitrogen	15401-029
CHAPS	EMD-Millipore	220201
heparin	Sigma-Aldrich	H4784
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Research Organics	2106D
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17
Netwell inserts	Electron Microscopy Sciences	64713-00	Netwells for use in 6-well tissue culture dishes
6-well tissue culture plate	Corning	3516
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
formamide	Fisher	BP227500
Proteinase K	Invitrogen	59895 (AM2542)
NBT		11585029001
BCIP	Roche	11585002001
Hydrogen peroxide, 30%	EMD	HX0635-1
Sheep serum	VWR	101301-478
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
tRNA	Roche	10-109-541-001
Anti-DIG Fab Fragments	Roche	1137-6623
Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.
1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5	Electron Microscopy Sciences	26323-01
Nuclear Fast Red	Electron Microscopy Sciences	26078-05
DPX Mountant	Electron Microscopy Sciences	13510
Paraffin (Paraplast X-tra)	McCormick Scientific	39503002
10% Formalin, NBF	VWR	95042-908
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
Stainless steal base molds	Tissue-Tek	4161-4165	Multiple sizes available.
Cassettes	Tissue-Tek	4170
Slide warmer	Fisher-Scientific	12-594Q
Tissue Embedder	Leica Microsystems	EG1160
Microtome, rotary	Leica Microsystems	RM2235
Tissue-Tek Slide Staining Set	Electron Microscopy Sciences	62540-01
Tissue-Tek 24-Slide Holder	Electron Microscopy Sciences	62543-06
Superfrost*Plus slides	Fisherbrand	12-550-17
Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.