РНК<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизации эмбрионов Всего в гору и сотовых гистологии адаптированный для морских хрящевых рыб

Резюме

Комбинируя методы РНК целом креплением На месте Гибридизации и гистологии, экспрессия генов могут быть связаны с клеточной судьбы решений в развивающемся эмбрионе. Эти методы были адаптированы для морских хрящевых рыб и облегчения использования этих животных в качестве модельных организмов для медико-биологических, токсикологических и сравнительных исследований.

Аннотация

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation ^1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change ⁴. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.

Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes ⁵. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.

While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract ⁶. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.

Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

протокол

I. РНК Всего горы в гибридизация в морских хрящевых рыб

1. Фиксация эмбрионов и подготовка

1. Skate эмбрионы могут быть организованы в соответствии с Ballard ^7. Оптимальное этапы для выявления экспрессии генов в зависимости от ткани интерес. Для отслеживания экспрессии генов в пищеварительном тракте кататься на коньках, этапы 27-30 оптимальные ^7.
2. Проанализируйте эмбрионов в PBS, отделяя эмбрионы из желточного мешка.
3. Исправить в 30 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида (PFA) в 50 мл коническую трубку при 4 ° С с нежным качалки. Исправить в течение 24 часов.
4. Промойте эмбрионы в PBT, дважды в течение 15 мин, вращающаяся при комнатной температуре. Все рецепты решения для РНК целом крепления на месте "с включены (табл. 1).
5. Высушить эмбрионов промывкой в ​​метаноле серия 25%, 50% и 75% метанола: PBT качалке при комнатной температуре. Продолжительность промывки зависит от стадии эмбрионов. Для Pre-Neurulation поставил эмбрионов, 5 мин каждого мытья в метаноле серии является достаточным. Для эмбрионами старше этапе 30, моет может длиться до 30 минут. Чтобы определить, если эмбрионы достаточно проникла и приспособиться к каждой стирки, удерживая трубу в вертикальном положении в ваших руках. Если зародыши опускаются на дно пробирки, то вы готовы к следующей стирки. Если эмбрионы плавают в начало решения, изменить решение и повторяю, что особенно обезвоживание шаг.
6. Мыть два раза в 100% метаноле в течение 10 минут нежно качалке.
7. Как только обезвоженный до 100% метанола, эмбрионы должны храниться при температуре -20 ° C в течение не менее 24 часов, прежде чем приступить к протоколу. Эмбрионы были успешно хранят при температуре -20 ° C и используется для РНК весь транспорт на срок до 1 года.

2. Синтез РНК-зонда

1. Создание линейного фрагмента гена, экспрессия которого вы хотите обнаружить. Это может быть сделано либо путем ПЦР-амплификации или линеаризации плазмиды с геноминтерес. Чтобы усилить с помощью ПЦР, выбрать праймеры которого сайтов связывания фланга ген вставить и сохранить РНК-полимеразы сайтов связывания в регионе усиливается. Для часто используемых плазмиды, такие как PBS или pGEM, M15 прямого и обратного праймеров являются идеальным выбором. Кроме того, линеаризации плазмиды путем расщепления 15 мкл ДНК QIAGEN Miniprep с ферментом, который расщепляет на 5 'конце гена. Гель извлечь и очистить помощью соответствующего комплекта QIAquick.
2. Обратный транскрибировать РНК с использованием зонда 8 мкл линейные плазмиды или 100 нг ПЦР-продукт в качестве шаблона, используя соответствующие РНК-полимеразы (см. Таблицу 2 для транскрипции реакции).
3. Инкубируйте реакции обратной транскрипции в течение 2 часов при температуре 37 ° C.
4. Для подтверждения реакции, запустить 1 мкл транскрипции реакции на 1% агарозном / TAE геля. Выполнить геля при 100 mVolts, пока краситель просто запустить в гель. Один видный группа должна быть видна. Линейный фрагмент ДНК-матрицы может быть слабым видимым при более высокой молекулярнойLAR веса.
5. Добавить 1 мкл РНКазы без ДНКазы реакции транскрипции и инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин.
6. Для осадок, добавляют 100 мкл TE рН 8, 10 мкл 4 М LiCl, 300 мкл 100% этанола и инкубировать при температуре -20 ° С в течение не менее 60 минут или на ночь.
7. Спин в течение 10 мин в 4 ° C микроцентрифуге при 14000 оборотах в минуту.
8. Вымойте гранул с 70% этанола и сухой воздух.
9. Ресуспендируют РНК-зонд в 20 мкл дН ₂ O. Добавить 80 мкл буфера гибридизации (гибридизации буфер должен быть предварительно нагревают до 70 ° C). Зонд может быть сохранен в 80% гибридизации буфер в течение нескольких месяцев при температуре -20 ° C или больше при температуре -80 ° C.

3. Эмбрион предварительной обработки и гибридизация

1. Удалить эмбрионы хранятся в 100% метанола от -20 ° C. Для молодых эмбрионов переходите к шагу (3,2). Для дальнейшего поставил эмбрионов (этап 29/30 <) вы можете увидеть слой эпидермиса, который "поднял" от тела эмбриона. Под микроскопом, тщательно диссECT от эпидермального слоя, чтобы максимально проникающий зонд.
2. Место эмбрионов в чистом флаконы сцинтилляционного стекла. Увлажняет эмбрионов в обратном серии метанола описано выше: (75%, 50%, 25% метанола: PBT) по покачиваясь каждое решение в течение 5-30 мин каждый при комнатной температуре. Полное регидратации с двумя промывками ПБТ в течение 10 минут каждый, мягко покачиваясь.
3. Для удаления пигмента, отбеливание эмбрионов с 6% перекиси водорода в PBT в течение 1 часа при комнатной температуре, покачиваясь.
4. Удалить перекиси водорода стиральная три раза в PBT, (покачивание при комнатной температуре 10 мин каждая).
5. Лечить эмбрионов с протеиназы К, чтобы обеспечить проникновение зонда при гибридизации. Количество протеиназы К и продолжительность лечения зависит от ткани вы хотите проверить и возраст эмбриона. Более поверхностные ткани и младшего эмбрионы требуют более коротких и менее протеиназы К, в то время как более глубокие ткани и старше эмбрионы требуют более высокой концентрации и длительном лечении Тимомэлектронной полностью permeabilize эмбриона для зонда гибридизации. Например, для обнаружения Shh в кишечнике энтодермы стадии 29 эмбрионов кататься на коньках, 30 мкг / мл протеиназы К / PBT инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре.
6. Быстро промыть эмбрионов в PBT, чтобы смыть протеиназы К.
7. Чтобы отключить протеиназы К, Postfix эмбрионы с 4% PFA, 0,2% глутарового альдегида в PBT в течение 20 мин, мягко покачиваясь.
8. Мыть два раза в течение 10 мин с PBT.
9. 1. Для предварительной гибридизации, добавить 2-3 мл подогретого гибридизации решение эмбрионов, достаточно, чтобы покрыть их. Рок мягко подогревом водяной бане при температуре 70 ° С в течение 1 часа.
   2. Чтобы подготовить раствор для гибридизации, разогрейте РНК-зонд до 70 ° С в течение 10 мин и прохладной на льду. Развести 15-20 мкл РНК-зонд до 2 мл свежей предварительно нагретый раствор гибридизации для получения конечной концентрации 0,5-1,0 мкг / мл. Удалите предварительно Hybe и добавить разбавленный зонд РНК эмбрионов. Эмбрионы должны быть просто покрыта раствором,дд более гибридизации решение, если это необходимо. Плотно закрыть крышкой сцинтилляционный флакон. Гибридизации по покачиваясь в отапливаемом водяной бане при температуре 70 ° С в течение ночи.

4. Сообщение Гибридизация автомойки и антител Гибридизация

1. Удалите раствор для гибридизации с зондом из эмбрионов и место в свежей флаконе сцинтилляционный или Eppendorf трубки. Зонд можно хранить при температуре -20 ° C и повторно использовать в будущем. Для пост-гибридизации моет, место эмбрионов в Netwell сидит в 6-луночный планшет для культивирования тканей.
2. Промыть 3 раза по 30 минут в каждом из подогретого Решение № 1, раскачиваясь при 70 ° C.
3. Промыть 3 раза по 30 минут в каждом из подогретого Решение № 2, раскачиваясь при 70 ° C.
4. Промыть 3 раза по 5 мин в TBST, раскачиваясь при комнатной температуре.
5. Предварительно блок с 10% инактивированной сыворотки овец в TBST в течение 1 часа, покачиваясь при комнатной температуре.
6. Трансфер эмбрионов из Netwell на свежий флакон сцинтилляционного стекла. Добавить анти-DIGFab фрагментов (1:5000) в 1% инактивированной сыворотки овец / TBST для эмбрионов. Рок течение ночи при 4 ° C.

5. Гибридизация Сообщение антител Моет

1. Удалить антител и выбросить. Место эмбрионов обратно в Netwell для мытья.
2. Промыть 3 раза по 5 мин в TBST, раскачиваясь при комнатной температуре
3. Мыть не менее 6 раз в течение 1 часа каждый, раскачиваясь при комнатной температуре.
4. Мыть на ночь в TBST, раскачиваясь при 4 ° C. Как моет сообщение антител помочь сократить на фоне окрашивание, максимальное количество и продолжительность мытья предпочтительнее. Эмбрионы регулярно мыть в TBST при 4 ° C, в минувшие выходные.

6. Обнаружение Probe

1. Макияж свежий раствор NTMT и фильтрации стерилизации.
2. Откажитесь TBST промывочного раствора и место эмбрионов в чистую пробирку сцинтилляционного стекла. Промойте эмбрионы 3 раза в свежем NTMT в течение 10 минут каждый при комнатной температуре, качалки.
3. Удалить NTMT вымыть и добавить реакционной смеси1 х NBT / 1 х BCIP в NTMT. Поскольку эти реагенты являются светочувствительными, накрыть сцинтилляционных флаконов в фольгу и рок-при комнатной температуре.
4. Монитор цветной реакции каждые 15 мин до желаемой экспрессии гена ясно видно. Сильные зондов может занять всего 10 минут, чтобы развиваться. Слабые зондов может занять 1-2 часа. Не позволяйте реакции идут слишком долго или фоновое окрашивание начнут появляться (весь эмбрион начинает превратить скучный фиолетовый или коричневый цвет).
5. Промойте 2 раза по 10 минут в каждом из PBT при комнатной температуре, качалки.
6. Postfix эмбрионов в 4% параформальдегид, 0,1% глутарового альдегида в течение 1 часа при комнатной температуре. Эмбрионы могут быть магазина на неопределенный срок в фиксаторе при 4 ° C.
7. Визуализация эмбриона с рассекает стереомикроскопа. Для получения светло-голубой фон для фотографий, место эмбрионов в чашке с предварительно закаленной 1% агарозном / PBS.

7. Представитель Результаты I. РНК Всего горы в гибридизация в морских хрящевых рыб

РНК целые горы на месте "с изображающих выражение Еж Соник (Shh) и Hoxa13 в эмбрионах конька показано на рисунке 1. Экспрессия Shh у высших позвоночных находится в энтодерме хорда и кишечник, и это выражение шаблон сохраняется в конька (рис. 1а) ^8,9. Морские хрящевых рыб имеют уникальный метод, который использует осморегуляции ректальные железы выделяют соли. Hoxa13 выражение высокой в развивающихся ректальные железы (рис. 1b) ^10. Hoxa13 продукт гена роль в формировании паттерна ректальные железы остается неизвестной.

II. Парафин вложения и секционирования пластиножаберных тканей

1. Урожая и подготовка ткани

1. Проанализируйте нужную ткань и закрепите в 10% формалине в течение 24-48 часов, раскачиваясь при комнатной температуре. 4% параформальдегида (PFA) также может быть использована в качестве закрепителя(См. Обсуждение).
2. Промойте фиксатором промывкой в ​​PBS 3 раза в течение 30 минут каждый. В зависимости от размера ткани, стиральные раз может быть уменьшено до 10 мин или увеличить до 1 часа.
3. Высушить эмбрионов промывкой в ​​этаноле серия 25%, 50% и 75% этанола: PBS качалке при комнатной температуре. Опять же, время для каждой стирки будет зависеть от размера ткани. Для 0,5 см ³ ткани, инкубировать каждого мытья в течение 15 мин. Увеличение времени для больших кусков. Если длительном хранении ткани желательно, мыть еще два раза с 75% этанола и хранят в -20 ° C на срок до одного года. В противном случае переходите к следующему шагу.
4. Дальнейшая обезвоживанию промыванием 3 раза в 100% этаноле в течение 15 минут каждый, покачиваясь.

2. Парафин вложения и секционирования

1. Уточнить ткани, стиральные 2 раза в ксилоле в течение 5 мин в стеклянные сцинтилляционные флаконы с крышками винтовой крышкой. Ксилол будет оказывать ткани хрупкими, поэтому не превышает в общей сложности 10 мин былоГЭС. Ткань должна выглядеть полупрозрачными, когда вы держите его к свету. Если ткань по-прежнему очень непрозрачная после двух стирок, делать дополнительные мыть в ксилоле в течение 5 мин, а затем приступить протокол. Только обрабатывать ксилол внутри вытяжного шкафа в перчатках.
2. Удалить ксилол и заполнить сцинтилляционный флакон на 2/3 с расплавленным парафином. Инкубируйте в 60 ° C духовке в течение 30 мин. При установке парафин во флакон, вы заметите, парафин укрепить по бокам флакона. Поместить флакон в духовку и дайте парафин повторно растворяется в течение нескольких минут. Возьмите пузырек из духовки и дать решение быстрый водоворот, чтобы смешивать и заменить в духовке в течение оставшейся части инкубации.
3. Повторите парафин инкубации еще два раза в течение 30 мин.
4. Инкубируйте в парафин два раза в течение часа каждый. Изменение парафина в последний раз и инкубировать в течение ночи в 60 ° C духовке.
5. На следующий день, поместить ткань в ванну с подогревом камеру парафин и место под вакуумом в течение 2-3 часов. Это будет способствовать проникновению парафина в ткани и удалить пузырьки воздуха. Для некоторых типов тонких тканей, вакуумные шаг может и не потребоваться, но это необходимо для целого эмбриона или желудочно-кишечного тракта и других органов просвета отсеков.
6. После вакуумной способствовало проникновению ткани, места ткани в металлическую форму с расплавленным парафином, и прохладно на ледяной пластины. Оставить на льду или при температуре 4 ° С в течение ночи, прежде чем пытаться удалить ткань из формы. Парафиновые блоки ткани могут храниться неопределенно при 4 ° C.
7. Место парафинового блока на микротома и сократить 8 мкм разделов. Разделы должны быть размещены на водяной бане нагревают до 48 ° С и установлены на стекло Superfrost * слайды Plus.
8. Сухие горки на ночь в духовку на 37 ° C.
9. Магазин разделов при 4 ° С до необходимости.

III. Alcian Blue / Ядерная Быстрый красное пятно из ткани пластиножаберных

1. Alcian синевы для Муциньш

1. Место слайды с разделами вверх на слайде теплее. Растопить в течение 45 мин.
2. Место скользит в держателе слайдов. Все последующие решения, содержащиеся в кадках внутри вытяжного шкафа. Слайды промывают путем перевода их из одной ванны с раствором в другой. Убедитесь в том, что решение уровня в ваннах охватывает слайдов; ткани на слайдах они полностью погружены. Растворите парафина стиральная слайды 2 раза в ксилоле в течение 5 минут каждый.
3. Вымойте слайды в два раза со 100%-ным этанолом в течение 1 мин каждая.
4. Увлажняет слайды в серии этанола (75%, 50%, 25% этанола) мытье в каждом решении в течение 1 мин. Стирать в дН ₂ O в течение 1 мин.
5. Пятно в Alcian синий раствор, рН 2,5 в течение 15 мин.
6. Разработка пятно промывкой в ​​проточной воде в течение 3 мин. Опустите один раз в дН ₂ O.
7. Контрастирующая в ядерной Fast Red решение контрастирующая в течение 10 мин.
8. Промыть в проточной воде в течение 3 мин и окунуться в дН ₂ O один раз.
9. Дегидратацииdrate в серии этанола (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) в течение 20 провалов каждый, или 1 мин каждая. Промойте 2 раза в ксилоле в течение 5 минут каждый. Установить с DPX монтажа средних и покровные. Разрешить монтажа средних сухой и затвердеть в течение 48 часов в вытяжном шкафу до манипулирования слайдов.

Результаты

Примеры альциановым синего окрашивания в различные регионы L. erinacea тракта пищеварительного показано на рисунке 2. Кислота муцина содержащие globlet клеток четко видны на альциановым синие пятна на всем протяжении пищеварительного тракта. Распределение кислоты муцин отлича?...

Обсуждение

Протоколы представлены классические методы мониторинга экспрессии генов и определения дифференцированных типов клеток, и были адаптированы для использования в морских хрящевых рыб. Дальнейшие модификации этих протоколов могут быть необходимы для адаптации к различным видам пласти...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 x transcription buffer	Roche	11-465-384-001
DIG-RNA labeling mix	Roche	11-277-073-910
RNAse inhibitor	Roche	03-335-399-001
RNA polymerase - SP6	Roche	10-810-274-001
DNAseI, RNAse-free	Roche	10-776-785-001
Yeast RNA	Invitrogen	15401-029
CHAPS	EMD-Millipore	220201
heparin	Sigma-Aldrich	H4784
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Research Organics	2106D
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17
Netwell inserts	Electron Microscopy Sciences	64713-00	Netwells for use in 6-well tissue culture dishes
6-well tissue culture plate	Corning	3516
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
formamide	Fisher	BP227500
Proteinase K	Invitrogen	59895 (AM2542)
NBT		11585029001
BCIP	Roche	11585002001
Hydrogen peroxide, 30%	EMD	HX0635-1
Sheep serum	VWR	101301-478
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
tRNA	Roche	10-109-541-001
Anti-DIG Fab Fragments	Roche	1137-6623
Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.
1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5	Electron Microscopy Sciences	26323-01
Nuclear Fast Red	Electron Microscopy Sciences	26078-05
DPX Mountant	Electron Microscopy Sciences	13510
Paraffin (Paraplast X-tra)	McCormick Scientific	39503002
10% Formalin, NBF	VWR	95042-908
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
Stainless steal base molds	Tissue-Tek	4161-4165	Multiple sizes available.
Cassettes	Tissue-Tek	4170
Slide warmer	Fisher-Scientific	12-594Q
Tissue Embedder	Leica Microsystems	EG1160
Microtome, rotary	Leica Microsystems	RM2235
Tissue-Tek Slide Staining Set	Electron Microscopy Sciences	62540-01
Tissue-Tek 24-Slide Holder	Electron Microscopy Sciences	62543-06
Superfrost*Plus slides	Fisherbrand	12-550-17
Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.