RNA<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; in embrioni Mount interi e istologia Adattato per Elasmobranchi Marine

Riepilogo

Grazie alla combinazione di metodi di montaggio RNA tutto In situ e istologia, l'espressione genica può essere collegato con le decisioni destino delle cellule nell'embrione in via di sviluppo. Questi metodi sono stati adattati per gli Elasmobranchi marine e facilitare l'uso di questi animali come organismi modello per biomedico, tossicologia e studi comparativi.

Abstract

Elasmobranchi Marine sono valutati modelli animali per studi biomedici e genomica in quanto sono i vertebrati più primitivi di avere l'immunità adattativa e hanno meccanismi unici per osmoregolazione ^1-3. Come le più primitive di vita ganasce-vertebrati con appendici appaiate, elasmobranchi sono un modello evolutivamente importante, soprattutto per gli studi in evoluzione e sviluppo. Elasmobranchi marini sono stati utilizzati anche per studiare tossicologia acquatica e fisiologia dello stress in relazione a ⁴ dei cambiamenti climatici. Pertanto, lo sviluppo e l'adeguamento delle metodologie è necessario per agevolare ed estendere l'uso di questi vertebrati primitivi a più discipline biologiche. Qui presento l'adattamento di successo del monte RNA tutto ibridazione in situ e tecniche istologiche per lo studio dell'espressione genica e cellulare in istologia elasmobranchi.

Controllo dell'espressione genica è uno strumento di sviluppo segno distintivo di biologists, ed è ampiamente utilizzato per studiare i processi di sviluppo ^5. Mount RNA tutto ibridazione in situ permette la visualizzazione e la localizzazione di trascritti del gene specifici nei tessuti dell'embrione in via di sviluppo. Il pattern di espressione del messaggio di un gene in grado di fornire indicazioni su ciò che i processi di sviluppo e le decisioni sul destino delle cellule un gene può controllare. Confrontando il pattern di espressione di un gene in differenti stadi di sviluppo, intuizione può essere ottenuto in quanto il ruolo di un gene cambia durante lo sviluppo.

Mentre mount intero in situ 's fornisce un mezzo per localizzare l'espressione genica di tessuti, tecniche istologiche consentire l'identificazione di tipi di cellule differenziate e tessuti. Macchie istologiche hanno funzioni diverse. Macchie generale sono utilizzati per evidenziare la morfologia cellulare, ad esempio ematossilina ed eosina generale per la colorazione dei nuclei e citoplasma, rispettivamente. Altre colorazioni può evidenziare cella specificatipi. Per esempio, il blu Alcian macchia riportati in questo documento è una macchia ampiamente utilizzato per identificare mucosaccharides cationico. Colorazione del tubo digerente con Alcian blue possibile identificare la distribuzione di cellule caliciformi che producono mucosaccharides. Le variazioni intervenute nel perimetro mucosaccharide su brevi peptidi distinguere le cellule caliciformi per funzione all'interno del tubo digerente ^6. Utilizzando mount intero RNA in situ metodi 's istochimiche e contemporaneamente, decisioni destino cellulare può essere collegato al gene-specifico espressione.

Anche se RNA in situ 's e istochimica sono ampiamente utilizzati dai ricercatori, il loro adattamento e l'uso in elasmobranchi marini hanno incontrato un successo limitato e varia. Qui presento i protocolli sviluppati per elasmobranchi e utilizzato su base regolare nel mio laboratorio. Sebbene ulteriore modifica delle RNA ibridazione in situ metodo 's può essere necessaria per adattarsi a diverse specie, i protocolli descritti qui provide un punto di forza di partenza per i ricercatori che desiderano adattare l'uso di elasmobranchi marini alle loro domande scientifiche.

Protocollo

I. RNA Mount tutto ibridazione in situ in Elasmobranchi Marine

1. Embrione Fissazione e preparazione

1. Skate embrioni può essere messo in scena secondo Ballard ^7. Stadi ottimali per il rilevamento di espressione genica dipende dal tessuto di interesse. Per tenere traccia di espressione genica nel tratto digestivo pattino, le fasi 27-30 sono ottimali ^7.
2. Dissect embrioni in PBS, separando gli embrioni dal sacco vitellino.
3. Fissare in 30 ml di appena fatta paraformaldeide 4% (PFA) in una provetta da 50 ml a 4 ° C con gentile dondolio. Fix per 24 ore.
4. Lavare embrioni in PBT, due volte per 15 min, rotazione a temperatura ambiente. Tutte le ricette di soluzioni per il montaggio in situ di RNA intero 's sono inclusi (Tabella 1).
5. Disidratare embrioni mediante lavaggio in una serie di metanolo 25%, 50% e 75% metanolo: PBT dondolo a temperatura ambiente. La durata dei lavaggi dipende dallo stadio degli embrioni. Per la pre-neurulation scena embrioni, 5 min di ogni lavaggio nella serie metanolo è sufficiente. Per gli embrioni più vecchi di fase 30, lavaggi possono durare fino a 30 minuti. Per determinare se gli embrioni sono sufficientemente penetrato e acclimatati per ogni lavaggio, tenere il tubo in posizione verticale in mano. Se gli embrioni si depositano sul fondo del tubo, allora siete pronti per il lavaggio successivo. Se gli embrioni a galla della soluzione, cambiare la soluzione e ripetere questo passo particolare disidratazione.
6. Lavare due volte in metanolo 100% per 10 minuti agitando lentamente.
7. Una volta disidratati al 100% metanolo, embrioni devono essere conservati a -20 ° C per almeno 24 ore prima di procedere con il protocollo. Gli embrioni sono stati correttamente conservati a -20 ° C ed utilizzato per montature RNA intero fino a 1 anno.

2. Sintesi di RNA Probe

1. Generare un frammento lineare del gene la cui espressione si desidera rilevare. Ciò può essere fatto mediante amplificazione PCR o linearizzare un plasmide con il genedi interesse. Per amplificare mediante PCR, primer scegliere il cui legame siti fiancheggiano il gene inserire e conservare i siti di legame di RNA polimerasi della regione amplificata. Per i plasmidi di uso comune come PBS o pGEM, M15 in avanti e reverse primer sono l'ideale. In alternativa, linearizzare un plasmide mediante digestione 15 microlitri di DNA QIAGEN miniprep con un enzima che scinde alla estremità 5 'del gene. Gel estrarre e purificare con l'apposito kit QIAquick.
2. Invertire trascrivere RNA utilizzando la sonda 8 microlitri di plasmide lineare o 100 ng del prodotto di PCR come modello utilizzando la RNA polimerasi appropriata (vedi Tabella 2 per reazione di trascrizione).
3. Incubare la reazione di trascrizione inversa per 2 ore a 37 ° C.
4. Per confermare la reazione, eseguire 1 microlitri della reazione di trascrizione su un 1% di agarosio / TAE gel. Esegui gel a 100 mVolts fino a quando il colorante ha appena incontrato il gel. Una singola banda di primo piano dovrebbe essere visibile. Il modello lineare frammento di DNA può essere debolmente visibili a molecolare maggiorelar peso.
5. Aggiungere 1 ml di RNasi-free DNasi I per la reazione di trascrizione e incubare a 37 ° C per 15 min.
6. Per precipitato, aggiungere 100 microlitri TE pH 8, 10 pl 4 M LiCl, 300 ul 100% EtOH e incubare a -20 ° C per almeno 60 minuti o per una notte.
7. Spin per 10 min a 4 ° C una microcentrifuga a 14.000 rpm.
8. Lavare pellet con% EtOH 70 e aria secca.
9. Risospendere RNA sonda in 20 ml di dH ₂ O. Aggiungere 80 ml di tampone di ibridazione (tampone di ibridazione deve essere pre-riscaldato a 70 ° C). La sonda può essere memorizzato in tampone di ibridazione 80% per diversi mesi a -20 ° C o più a -80 ° C.

3. Embrioni pre-trattamento e ibridazione

1. Rimuovere embrioni conservati in metanolo 100% da -20 ° C. Per i più piccoli embrioni procedere con il passo (3.2). Per la successiva fase di messa in scena embrioni (29/30 <) si può visualizzare un strato di epidermide che si e 'tolto' dal corpo dell'embrione. Sotto il microscopio, con attenzione dissect lo strato epidermico per massimizzare la penetrazione della sonda.
2. Embrioni Luogo in fiale di vetro puliti scintillazione. Reidratare gli embrioni della serie metanolo inverso descritto sopra: (75%, 50%, 25% metanolo: PBT) agitando delicatamente ogni soluzione per ogni 5-30 min a temperatura ambiente. Reidratazione completa con due lavaggi di PBT per 10 minuti ciascuno, delicatamente a dondolo.
3. Per rimuovere qualsiasi pigmento, embrioni candeggina con perossido di idrogeno al 6% in PBT per 1 ora a temperatura ambiente, dondolo.
4. Rimuovere perossido di idrogeno mediante lavaggio tre volte in PBT, (dondolo a temperatura ambiente, 10 min ciascuna).
5. Trattare embrioni con proteinasi K per consentire la penetrazione della sonda durante l'ibridazione. La quantità di proteinasi K e la durata del trattamento dipende dal tessuto che si desidera esaminare e l'età dell'embrione. Tessuti più superficiali e più giovani embrioni richiedono K più breve e meno proteinasi, mentre i tessuti più profondi e più embrioni richiedono una maggiore concentrazione e un trattamento più lungo time al permeabilize pienamente l'embrione per l'ibridazione della sonda. Per esempio, per rilevare Shh nella endoderma dell'intestino di fase 29 embrioni skate, 30 ug / ml di proteinasi K / PBT viene incubata per 20 min a temperatura ambiente.
6. Rapidamente il risciacquo embrioni in PBT per lavare via proteinasi K.
7. Per disattivare proteinasi K, embrioni postfix con 4% PFA, 0,2% glutaraldeide in PBT per 20 minuti, delicatamente a dondolo.
8. Lavare due volte per 10 minuti con PBT.
9. 1. Per la pre-ibridazione, aggiungere 2-3 ml di pre-riscaldato soluzione di ibridazione per gli embrioni, quanto basta per coprirli. Oscillare delicatamente in un bagno d'acqua riscaldata a 70 ° C per 1 ora.
   2. Per preparare la soluzione di ibridazione, preriscaldare RNA sonda a 70 ° C per 10 minuti e raffreddare in ghiaccio. Diluire 15-20 microlitri di RNA sonda a 2 ml di soluzione di ibridazione fresco preriscaldato, per ottenere una concentrazione finale di 0,5-1,0 mg / ml. Rimuovere pre-hybe e aggiungere diluito sonda RNA agli embrioni. Gli embrioni devono essere appena coperto da una soluzione, undd soluzione di ibridazione più se necessario. Coperchio a tenuta sicura di fiala di scintillazione. Ibridano agitando delicatamente in un bagno d'acqua riscaldata a 70 ° C per una notte.

4. Posta lavaggi di ibridazione e di ibridazione Anticorpo

1. Rimuovere soluzione di ibridazione con sonda da embrioni e posto in una fiala di scintillazione fresco o provetta Eppendorf. La sonda può essere conservato a -20 ° C e riutilizzati in futuro. Per la post-ibridazione lavaggi, gli embrioni in un posto Netwell seduto in una piastra da 6 pozzetti di coltura.
2. Lavare 3 volte per 30 minuti in ciascuna delle pre-riscaldato Soluzione # 1, dondolo a 70 ° C.
3. Lavare 3 volte per 30 minuti in ciascuna pre-riscaldato Solution # 2, dondolo a 70 ° C.
4. Lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno in TBST dondolo, a temperatura ambiente.
5. Pre-blocco con 10% di siero siero ovino in TBST per 1 ora, a temperatura ambiente dondolo.
6. Trasferimento embrioni da Netwell in una fiala di vetro fresco di scintillazione. Aggiungi anti-DIGFrammenti Fab (1:5.000) in 1% di siero siero ovino / TBST agli embrioni. Muovere la notte a 4 ° C.

5. Anticorpo ibridazione Messaggio lava

1. Rimuovere l'anticorpo e scartare. Embrioni posto nuovamente dentro Netwell per lavaggi.
2. Lavare 3 volte per 5 minuti in ciascuna delle TBST, dondolo a temperatura ambiente
3. Lavare almeno 6 volte per 1 ora ciascuno, dondolo a temperatura ambiente.
4. Lavare pernottamento in TBST, dondolo a 4 ° C. Mentre i lavaggi post-anticorpo aiuta a diminuire la colorazione di fondo, massimizzando il numero e la durata dei lavaggi è preferibile. Gli embrioni vengono regolarmente lavati in TBST a 4 ° C, durante il fine settimana.

6. Rilevamento di sonda

1. Make up soluzione fresca NTMT e filtro sterilizzare.
2. Scartare la soluzione di lavaggio e gli embrioni TBST posto in un flaconcino di vetro pulito scintillazione. Lavare 3 volte in embrioni NTMT fresco per 10 min a temperatura ambiente, a dondolo.
3. Rimuovere NTMT lavare e aggiungere miscela di reazionedi 1 x NBT / 1 x BCIP in NTMT. Dal momento che questi reagenti sono sensibili luce, coprire fiala di scintillazione in un foglio e roccia a temperatura ambiente.
4. Monitorare la reazione colore ogni 15 min fino genica desiderata è chiaramente visibile. Sonde forti può prendere un minimo di 10 minuti per lo sviluppo. Sonde deboli può richiedere 1-2 ore. Non lasciare che la reazione andare troppo a lungo o la colorazione di fondo cominceranno a comparire (l'embrione tutto inizia a girare un colore opaco viola o marrone).
5. Lavare 2 volte per 10 min in PBT a temperatura ambiente, a dondolo.
6. Embrioni postfix in paraformaldeide al 4%, 0,1% di glutaraldeide per 1 ora a temperatura ambiente. Gli embrioni possono essere a tempo indeterminato in negozio di fissativo a 4 ° C.
7. Visualizza embrioni con uno stereomicroscopio dissezione. Per produrre uno sfondo blu chiaro per le immagini, gli embrioni posto in un piatto con pre-temprato di agarosio all'1% / PBS.

7. Rappresentante dei risultati per Mount I. RNA totale ibridazione in situ in elasmobranchi marine

Mount RNA tutto in espressione in situ 's raffigurante di Sonic hedgehog (Shh) e HOXA13 in embrioni da skate sono illustrati nella Figura 1. L'espressione di Shh nei vertebrati superiori si trova nel endoderma notocorda e intestino, e questo pattern di espressione è conservato nel pattino (Figura 1a) ^8,9. Elasmobranchi marini hanno un metodo unico di osmoregulation che utilizza la ghiandola rettale di sali secernono. HOXA13 espressione è elevata nella ghiandola sviluppo rettale (Figura 1b) ^10. HOXA13 ruolo prodotto genico in patterning ghiandola rettale rimane sconosciuta.

II. Paraffina Incorporamento e sezionamento del tessuto Elasmobranch

1. Raccolta e Preparazione del tessuto

1. Dissect tessuto desiderato e fissare in formalina al 10% per 24-48 ore, dondolo a temperatura ambiente. 4% paraformaldeide (PFA) può anche essere utilizzato come fissativo(Vedi Discussione).
2. Lavare fissativo mediante lavaggio in PBS, 3 volte per 30 minuti ciascuno. A seconda delle dimensioni del tessuto, tempi di lavaggio può essere ridotto a 10 min o aumentata a 1 h.
3. Disidratare embrioni mediante lavaggio in una serie di etanolo 25%, 50% e 75% etanolo: rocking PBS a temperatura ambiente. Di nuovo, il tempo per ogni lavaggio dipende dalla dimensione del tessuto. Per 0,5 cm ³ tessuti, incubare ogni lavaggio per 15 min. Aumentare il tempo per i più grandi pezzi. Se la conservazione a lungo termine del tessuto è desiderato, lavare ulteriori due volte in 75% etanolo e conservare a -20 ° C fino ad un anno. In caso contrario, passare alla fase successiva.
4. Ulteriori disidratare mediante lavaggio 3 volte in etanolo al 100% per 15 minuti ciascuno, a dondolo.

2. Paraffina Incorporamento e sezionamento

1. Chiarire con il lavaggio dei tessuti 2 volte in xilene per 5 minuti in ciascuna delle fiale di vetro con coperchio a scintillazione con tappo a vite. Xilene renderà il tessuto fragile, in modo da non superare un totale di 10 min per erahes. Il tessuto dovrebbe essere trasparente quando lo si tiene fino a una luce. Se il tessuto è ancora molto opachi dopo due lavaggi, fare un ulteriore lavaggio in xilene per 5 min e quindi procedere con protocollo. Maneggiare xilene all'interno di una cappa di aspirazione con i guanti.
2. Rimuovere xilene e riempire la fiala di scintillazione in 2/3 con paraffina fusa. Incubare in un forno a 60 ° C per 30 min. Per la messa paraffina nel flaconcino, si noterà la paraffina solidifica lungo i lati della fiala. Porre la fiala in forno e consentire la paraffina di ri-sciogliere per qualche minuto. Prendere il flacone dal forno e dare la soluzione di un swirl resoconto di mescolare e sostituire in forno per la restante incubazione.
3. Paraffina Ripetere incubazioni altre due volte per 30 min.
4. Incubare in paraffina due volte per un'ora ciascuno. Modifica paraffina per l'ultima volta e incubare durante la notte nel forno a 60 ° C.
5. Il giorno seguente, posizionare il tessuto in una camera riscaldata bagno di paraffina e posto sotto vuoto per 2-3 ore. Questo faciliterà l'infiltrazione di paraffina nel tessuto ed eliminare eventuali bolle d'aria. Per alcuni tipi di tessuto sottile, una fase di vuoto potrebbe non essere necessaria, ma è necessario che gli embrioni interi o del tratto digerente e altri organi con compartimenti luminali.
6. Dopo sottovuoto facilitato infiltrazione di tessuto, tessuto posto in uno stampo metallico con paraffina fusa, e raffreddare su una piastra di ghiaccio. Lasciare in ghiaccio oppure a 4 ° C per una notte prima di cercare di rimuovere il tessuto dallo stampo. Blocchi di paraffina di tessuto può essere conservata indefinitamente a 4 ° C.
7. Collocare un blocco di paraffina su un microtomo e tagliare 8 sezioni micron. Sezioni deve essere collocato in un bagno d'acqua a 48 ° C, montato su vetro * vetrini Superfrost Plus.
8. Vetrini secco per una notte in un forno a 37 ° C.
9. Sezioni Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.

III. Alcian Blu / Nuclear Fast Red Stain of Tissue Elasmobranch

1. Alcian Blu Colorare per mucine

1. Luogo scorre con sezioni rivolti verso l'alto su un vetrino più caldo. Melt per 45 min.
2. Luogo scivola in un portavetrini. Tutte le soluzioni conseguenti sono contenuti in vasche all'interno di una cappa aspirante. Vetrini vengono lavati trasferendoli da una vasca con una soluzione ad un altro. Assicurarsi che i livelli di soluzione delle vasche riguarda le diapositive, i tessuti sui vetrini siano completamente immersi. Sciogliere paraffina mediante lavaggio diapositive 2 volte in xilene per 5 minuti ciascuno.
3. Lavare i vetrini due volte con etanolo al 100% per 1 min ciascuna.
4. Reidratare vetrini in una serie di etanolo (75%, 50%, 25% etanolo) lavaggio in ciascuna soluzione per 1 min. Lavare in dH ₂ O per 1 min.
5. Colorare in soluzione Alcian blu, pH 2,5 per 15 min.
6. Sviluppare macchia mediante lavaggio in acqua corrente per 3 min. Immergere una volta in dH ₂ O.
7. Di contrasto nucleare in soluzione rapida di contrasto rosso per 10 min.
8. Lavare in acqua corrente per 3 minuti e immergere in dH ₂ O una volta.
9. Disidratatimonoidrato in una serie di etanolo (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) per 20 tuffi ciascuno, o 1 min ciascuno. Lavare 2 volte in xilene per 5 minuti ciascuno. Montare con il mezzo di montaggio e DPX coprioggetti. Lasciare mezzo di montaggio a secco e indurire per 48 ore nella cappa prima di manipolare diapositive.

Risultati

Esempi di Alcian colorazione blu in diverse regioni del L. tratto digestivo erinacea sono mostrati nella Figura 2. Mucina acido contenente cellule globlet sono chiaramente visibili dal blu Alcian macchia tutto il tratto digestivo. La distribuzione di mucine acide differisce in diverse regioni del tratto digerente, riflettendo differenze nella funzione. Mucine acide sono scarsamente prodotta nell'intestino spirale e cloaca, mentre una concentrazione di mucine acide vengono rilevati ...

Discussione

I protocolli presentati sono i metodi classici per monitorare l'espressione genica e di individuare i tipi di cellule differenziate, ed è stato adattato per l'uso in elasmobranchi marini. Ulteriori modifiche di questi protocolli possono essere necessarie per adattarsi alle diverse specie di elasmobranchi.

Il problema più comune relativa montatura intera RNA in situ 's è il rischio di contaminazione RNasi e quindi la degradazione della sonda RNA e messaggi endogeni. Du...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 x transcription buffer	Roche	11-465-384-001
DIG-RNA labeling mix	Roche	11-277-073-910
RNAse inhibitor	Roche	03-335-399-001
RNA polymerase - SP6	Roche	10-810-274-001
DNAseI, RNAse-free	Roche	10-776-785-001
Yeast RNA	Invitrogen	15401-029
CHAPS	EMD-Millipore	220201
heparin	Sigma-Aldrich	H4784
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Research Organics	2106D
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17
Netwell inserts	Electron Microscopy Sciences	64713-00	Netwells for use in 6-well tissue culture dishes
6-well tissue culture plate	Corning	3516
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
formamide	Fisher	BP227500
Proteinase K	Invitrogen	59895 (AM2542)
NBT		11585029001
BCIP	Roche	11585002001
Hydrogen peroxide, 30%	EMD	HX0635-1
Sheep serum	VWR	101301-478
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
tRNA	Roche	10-109-541-001
Anti-DIG Fab Fragments	Roche	1137-6623
Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.
1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5	Electron Microscopy Sciences	26323-01
Nuclear Fast Red	Electron Microscopy Sciences	26078-05
DPX Mountant	Electron Microscopy Sciences	13510
Paraffin (Paraplast X-tra)	McCormick Scientific	39503002
10% Formalin, NBF	VWR	95042-908
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
Stainless steal base molds	Tissue-Tek	4161-4165	Multiple sizes available.
Cassettes	Tissue-Tek	4170
Slide warmer	Fisher-Scientific	12-594Q
Tissue Embedder	Leica Microsystems	EG1160
Microtome, rotary	Leica Microsystems	RM2235
Tissue-Tek Slide Staining Set	Electron Microscopy Sciences	62540-01
Tissue-Tek 24-Slide Holder	Electron Microscopy Sciences	62543-06
Superfrost*Plus slides	Fisherbrand	12-550-17
Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.