Usando cuantitativa en tiempo real PCR para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo Trasplante de médula ósea murina

Resumen

Determinación de quimerismo de células donantes presenta un reto en modelos de ratón trasplante de médula ósea que carecen bien definidos marcadores fenotípicos. Se presenta una metodología para cuantificar injerto macho donante de células en ratones hembras receptoras de trasplante. Este método se puede utilizar en todas las cepas de ratón para el estudio de funciones HSC.

Resumen

Murino de trasplante de médula ósea modelos constituyen una herramienta importante en la medición de células madre hematopoyéticas (HSC) y los genes que determinan las funciones / moléculas que regulan las CMH. En estos sistemas modelo de trasplante, la función de HSCs se determina por la capacidad de estas células a ratones injertan y reconstituir receptores irradiados letalmente. Comúnmente, la célula donante contribución / injerto se mide por los anticuerpos específicos de donante-proteínas de superficie celular por citometría de flujo. Sin embargo, este método depende en gran medida de la especificidad y la capacidad del marcador de superficie celular para diferenciar las células derivadas del donante de células receptoras originados, que pueden no estar disponibles para todas las cepas de ratón. Teniendo en cuenta los diversos antecedentes de cepas de ratón genéticamente modificados en el mercado, esta superficie de la célula / citometría de flujo basado en el método tiene limitaciones importantes, especialmente en las cepas de ratón que carecen bien definidos marcadores de superficie de células donantes separados de congenic destinatario cells. Aquí, se informó de una técnica basada en PCR para determinar quimerismo de células donantes / contribución en los ratones receptores de trasplante. Hemos trasplantado machos donantes de médula ósea a HSCs irradiados letalmente ratones hembra congénicos. Muestras de sangre periférica fueron recolectadas en diferentes tiempos después del trasplante puntos. Muestras de médula ósea se obtuvieron al final de los experimentos. ADN genómico se aisló y el gen específico de cromosoma Y, Zfy1, se amplificó utilizando PCR en tiempo real cuantitativa. El injerto de los machos células derivadas del donante en los ratones receptores hembra se calculó contra curva estándar con un porcentaje conocido de los ADN macho contra hembra. Bcl2 se utilizó como gen de referencia para normalizar la cantidad de ADN total. Nuestros datos sugiere que este enfoque fiable determina quimerismo de células donantes y proporciona un método útil, pero sencillo en la medición de la reconstitución de células hematopoyéticas en modelos murinos trasplante de médula ósea. Nuestro método puede ser realizada de forma rutinaria en la mayoría de los laboratorios porque noequipos costosos tales como la citometría de flujo se requiere.

Introducción

Murino médula ósea (MO) trasplante modelo fue desarrollado por primera vez en 1960 ^1. Este modelo se ha usado ampliamente para el estudio de células madre de un donante hematopoyéticas (HSC) biología en un ratón receptor host. Médula ósea murina modelo de trasplante nos ha proporcionado valiosa información sobre las funciones de HSC y su regulación y es indispensable en la investigación HSC. Alogénico de médula ósea como modelo de transplante C57Bl/6J ^H2B-Balb / C ^H2d o modelo de trasplante congenic como C56Bl/6J ^{CD45.2-B6.SJL CD45.1} se utilizan en muchos laboratorios para estudiar la función de genes en la actividad HSC ^2, el efecto de fármaco de tratamiento de enfermedades de función HSC ³ o trasplante relacionados, tales como la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) ^4.

Marcadores de superficie celular tales como haplotipo MHC o CD45.1 son comúnmente utilizados para distinguir las células derivadas del donante de células receptoras-originaron. C57Bl/6J ^{H2b, CD45.2} , Balb / C ^H2d y ^CD45.1 B6.SJL son las cepas de ratón más comúnmente usados ​​en el trasplante de médula ósea debido a que la contribución de donantes de células pueden ser fácilmente evaluada por citometría de flujo midiendo vs CD45.1 o CD45.2 H2b vs H2D. Sin embargo, muchas otras cepas como FVB / NJ ⁵ y C3H también se utiliza a menudo para generar transgénicos o genéticamente ratones knockout. Estos ratones pueden ser retrocruzaron a una línea consanguínea y mantenido en una genético mixto / MHC fondo. En estos casos, la determinación de quimerismo de células donantes y la función HSC podría ser difícil como donante específico de células marcadores de superficie puede no estar disponible.

Utilizando Y-cromosoma sonda específica de ADN para detectar las células del donante masculino por Southern blot en el sexo no coincide el trasplante de médula ósea ha sido desarrollado por el grupo del Dr. Miwa ^6. Entonces, una PCR en tiempo real para la región Y determinante del sexo se encontró que era un método preciso y altamente específico para cuantificar male células fetales en la sangre materna sistema ^7. Este concepto fue adaptado por el grupo del Dr. Schwarzenberger para el desarrollo de una técnica de PCR en tiempo real en un modelo de trasplante de médula ósea murina para determinar quimerismo de células donantes ^8. Hemos modificado adicionalmente este método para la medición de quimerismo de células donantes en FVB / NJ modelo de trasplante de médula ósea de ratón. Este método actualmente es ampliamente utilizado en nuestro grupo para estudiar el papel de Pim1 quinasa en biología HSC.

Protocolo

1. Bone Marrow celda de aislamiento

1. Eutanasiar donantes masculinos FVB / NJ ratones y hembra FVB / NJ ratones utilizando CO ₂ método seguido por dislocación cervical. La hembra FVB / NJ células de médula ósea se utiliza como células competitivas.
2. Utilice pequeñas tijeras y pinzas, diseccionar el fémur y tibiaes de ratones y colocarlos en una placa de cultivo tisular de 60 mm que contiene 6 ml de helado de RPMI1640 con FBS inactivado por calor al 5%. Utilizar tejido Kimwipe para eliminar músculo y otros tejidos. Cortar ambos extremos de cada eje del hueso en el plato.
3. Conectar el extremo del hueso con aguja 23G en la jeringa de 3 cc, enjuagar la médula ósea con RPMI1640 con FBS al 5% inactivado por calor en el plato. Desagregar los tejidos de la médula ósea por aspiraciones repetidas utilizando la misma aguja. Transferir la suspensión celular a 15 ml tubo de centrífuga.
4. Centrifugue las células durante 5 min a 400 xg, eliminar el sobrenadante, resuspender las células en 1 ml de tampón a temperatura ambiente de color rojo sangre lisis celular (155 mM potassium bicarbonato, cloruro de amonio 10 mM, 0,1 mM de EDTA, 7,4 = PH) e incubar a temperatura ambiente durante 5 min y después se añade 5-10 ml de RPMI 1640 con FBS al 5% inactivado por calor.
5. Pasar las células a través de un filtro de células. Recoger el flujo a través de un tubo nuevo. Centrifugue durante 5 min a 400 x g. Eliminar el sobrenadante, el pellet de células no debe contener ningún color rojo. La ausencia de color rojo indica una eliminación completa de las células rojas de la sangre. Resuspender el sedimento celular en 10 ml de RPMI1640 con FBS al 5% inactivado por calor. Vórtice suavemente para asegurarse de que la suspensión de células es completamente uniforme. Tomar una parte alícuota y se cuentan las células en un hemocitómetro. Calcular la cantidad de volumen de células necesarias para el trasplante de médula ósea y células alícuotas suficientes y mezclar células masculinas donantes con células competidor femenino en una proporción de 5:2. Centrifugue durante 5 min a 400 xg, se lava con PBS, se resuspende en PBS con la concentración final de células del donante en 5 × 10 ⁶ células / ml y competidor en 2 × 10 ⁶ / ml.

2. Trasplante de Médula Ósea Competitiva

1. Irradiar ratones hembra receptora (8-12 semanas de edad) con gamma 137Cs radiador rayos en una sola dosis de 11Gy 4-6 h antes del trasplante de médula ósea.
2. Coloque los ratones irradiados femeninos en un mecanismo de contención del ratón. Se inyecta la mezcla de donante y las células de la competencia a través de la vena caudal en 0,1 ml de volumen total de tal manera que cada ratón recibe el 5 × 10 ⁵ células del donante y 2 × 10 ⁵ células de médula ósea de la competencia.

3. Recogida de muestras

Semana pareja después del trasplante de médula ósea, recoger muestras de sangre periférica (~ 50 l) de ratón hembra receptora por sangrado retro-orbital bajo anestesia condición. Las muestras se recogen en tubos con EDTA recubiertos. BM muestras también pueden ser recogidos al final del experimento, usualmente al menos 4 meses después del trasplante, con los mismos procedimientos que se describen anterior (Paso 1); generalmente 20-40% deUna tibia BM células son suficientes para hacer la cantidad suficiente de ADN. La sangre o muestras de la misma edad BM ratones normales de ambos sexos también se recogen para preparar la curva estándar.

4. Aislamiento de ADN genómico

1. Añadir 4 × volumen de habitación lisis temperatura del tampón RBC (~ 200 l) a cada muestra de sangre. Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 1 ml de PBS, a continuación, girar hacia abajo para retirar la mayor parte de la RBC lisada.
2. Aislar ADN usando un kit de extracción de ADN de sangre (QIAmp DNA Blood Kit de extracción). Pre-caliente el tampón de elución (AE) a 37 º C para mejorar el rendimiento de ADN eluido. ADN masculino y femenino para la curva estándar se aíslan de manera similar.
3. (Opcional) El ADN genómico puede ser purificado adicionalmente o se concentró utilizando el método de precipitación con EtOH en presencia de acetato de sodio 3 M (pH = 5,5). Los sedimentos de ADN se resuspende en agua destilada 40-50 l para el análisis inmediatamente o almacenado a -20 ° C para su uso futuro.
4. Mida la concentr ADNción con fotómetro espectros Nanodrop ND-1000. Las muestras con OD 260/280 entre 1.8-2.0 se utilizan para el análisis adicional.
5. Diluir el ADN con ADNasa libre de H ₂ O para 4ng/μl en un volumen total de 50 l.

5. Preparación Curva Estándar

Diluir ADN masculino y femenino de ADN a una concentración de 4 ng / l, y hacer la mezcla de ADN según la Tabla 1

% De ADN masculino en segundo plano Mujer	Volumen (l) de ADN masculino 4ng/μl	Volumen (l) de ADN femenino 4ng/μl	Volumen total (l)
0,2	1	499	500
0,5	1	199	200
2,5	5	195	200
12,5	25	175	200
50	100	100	200
87,5	175	25	200
100	200	0	200

Tabla 1. Preparación de la muestra para la curva estándar. Normales macho y hembra FVB / NJ ratones a la edad de 8-12wks fueron sacrificados. Células de la sangre y el BM fueron recogidos. Los ADN de las células masculinas y femeninas células fueron aisladas y re-suspendido a una concentración de 4ng/μl. Los ADN masculino y femenino se mezclaron en diferentes proporciones para generar las mezclas de ADN de la muestra estándar.

6. PCR en tiempo real

1. Configurar la placa de reacción de PCR mezclando SYBR Green Supermix reactivo con cebadores y ADN genómico. El volumen de reacción (20 l) contiene 400 nM de cada cebador y 5 l de ADN genómico de células sanguíneas (4ng/μl l x5 = 20 ng) en cada reacción. ADN samples y las normas se establecieron por triplicado. Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 2.

Nombre del gen	Adelante	Marcha atrás
Bcl2	5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA	5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG
Zfy1	5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA	5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC

Tabla 2. RT-PCR cebador de secuencia de murino Bcl2 y Zfy1.

2. Realizar reacción de PCR usando Biorad iQ5 máquina de PCR con las siguientes condiciones: 95 ° C 3 min, 42 ciclos de amplificación de 95 ° C durante 10 s, 58 ° C durante 25 seg y 72 ° C durante 15 segundos, seguido por una fusión de curva el paso.
3. Obtener ciclo umbral (Ct) valores por Bio-Rad iQ5 2,1 Edición del sistema óptico estándar. Calcular? Ct (Ct ^{Zfy1 <}/ Sup>-Ct ^Bcl2) valor, y Zfy1 nivel de expresión se calcula como el valor de ^{2-δ Ct.}
4. Establecer las curvas de calibración para cada serie reacción utilizando ^{2-? Ct} lectura de conocidos / as mezclas estándar. Las curvas de calibración se generan por el trazado de la media de ^{2-? Ct} valor de triplicados en el ADN conocida macho% en la mezcla con ajuste de regresión lineal.

Resultados

La Figura 1 y 2 mostraron ejemplos de las curvas de calibración trazada con valores medios de ^{2-? Ct} contra porcentajes de ADN masculino. Figura 1A muestra la temperatura de fusión específica para Bcl2 y Zfy1 amplicones localizados a 78,5 ° C y 88,5 ° C, respectivamente. Bcl2 se utiliza como un gen de referencia para normalizar la cantidad total de ADN cargado en cada reacción de PCR. Bcl2 curvas de amplificación (vista de registro) para cada muestra estándar fusionar...

Discusión

El objetivo de nuestro estudio es proporcionar a los espectadores una técnica basada en PCR para cuantificar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo trasplante de médula ósea murina. Varios estudios han descrito el uso de RT-PCR para detectar células del donante en modelos de trasplante ^9-10. El grupo del Dr. Schwarzenberger la primera desarrollado un trasplante de médula ósea murina modelo de trasplante usando PCR en tiempo real para amplificar y-cromosoma específico ^8. Est...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
RPMI 1640	Hyclone	SH30255.01
FBS	Invitrogen	16140-017	Inactivado por calor
Cloruro amónico	MP Biomedicaals	194806
Bicarbonato de Potasio	Pescador	P184-500
QIAamp DNA Blood minikit	Qiagen	51106
Celular filtro	BD biociencias
iQ SYBR Green Supermix	Biorad	170-8882
iQ5 PCR en tiempo real de la máquina	Biorad
Spectra fotómetro	Nanodrop ND-1000	ND-1000