Utilisation quantitative PCR en temps réel pour déterminer prise de greffe de donneurs de cellules dans un modèle murin concurrentiel greffe de moelle osseuse

Résumé

Détermination de la prise de greffe de cellule donneuse présente un défi dans des modèles de souris moelle osseuse greffe qui n'ont pas bien définis marqueurs phénotypiques. Nous avons décrit une méthodologie pour quantifier les hommes greffe de cellule donneuse dans des souris femelles bénéficiaires de greffes. Cette méthode peut être utilisée dans toutes les souches de souris pour l'étude des fonctions HSC.

Résumé

Modèles murins de greffe de moelle osseuse constituent un outil important pour mesurer de cellules souches hématopoïétiques (CSH) et les gènes qui déterminent les fonctions / molécules qui régulent la CSH. Dans ces systèmes, le modèle de transplantation, la fonction des cellules souches hématopoïétiques est déterminé par la capacité de ces cellules à des souris greffer et reconstituer bénéficiaires irradiées de façon létale. Communément, la cellule donneuse contribution / prise de greffe est mesurée par des anticorps spécifiques aux bailleurs de protéines de surface cellulaire par cytométrie en flux. Cependant, cette méthode dépend fortement de la spécificité et de la capacité du marqueur de surface cellulaire pour différencier des bailleurs de fonds des cellules dérivées de cellules destinataire-nées, qui peuvent ne pas être disponibles pour toutes les souches de souris. Compte tenu de la diversité des souches de souris génétiquement modifiées sur le marché, cette surface cellulaire / cytométrie de flux basé sur la méthode comporte des limites importantes en particulier dans les souches de souris qui n'ont pas bien définis marqueurs de surface de cellules du donneur séparer congéniques destinataire CElls. Ici, nous avons enregistré une technique basée sur la PCR pour déterminer la prise de greffe de cellule donneuse / contribution à des souris receveuses de transplantation. Nous avons transplanté hommes CSH donneurs de moelle osseuse de souris irradiées de façon létale congéniques femmes. Échantillons de sang périphérique ont été prélevés au moment de post-transplantation différents points. Des échantillons de moelle osseuse ont été obtenus à la fin des expériences. L'ADN génomique a été isolé et le gène du chromosome Y spécifique, Zfy1, a été amplifié par PCR en temps réel quantitative. La prise de greffe des hommes donneurs de cellules dérivées des souris receveuses femelles a été calculé par rapport à la courbe standard avec pourcentage connu des ADN masculins vs femme. Bcl2 a été utilisé comme gène de référence pour normaliser la quantité d'ADN total. Nos données suggèrent que cette approche permet de déterminer de manière fiable la prise de greffe de cellule donneuse et fournit une méthode utile, mais simple dans la mesure de la reconstitution hématopoïétique dans des modèles murins de transplantation de moelle osseuse. Notre méthode peut être effectué systématiquement dans la plupart des laboratoires, car aucunéquipements coûteux comme la cytométrie de flux est nécessaire.

Introduction

Murin moelle osseuse (MO) transplantation modèle a été développé dans les années 1960 ^1. Ce modèle a été largement utilisé pour l'étude des cellules souches donateurs hématopoïétiques (CSH) la biologie dans une souris hôte receveur. Murin modèle de greffe de moelle osseuse nous a fourni de précieuses connaissances sur les fonctions HSC et de leur régulation et est indispensable dans la recherche HSC. Allogénique modèle greffe de moelle osseuse comme C57BL/6J ^H2b-souris Balb / C ^H2d ou d'un modèle de transplantation congéniques ^CD45.2 comme C56Bl/6J-B6.SJL ^CD45.1 sont utilisés dans de nombreux laboratoires pour étudier la fonction des gènes sur l'activité HSC ^2, effet de traitement de la toxicomanie sur les maladies de fonction ³ ou greffe de CSH connexes tels que la réaction du greffon contre l'hôte (GvHD) ^4.

Marqueurs de surface cellulaire tels que haplotype CMH ou CD45.1 sont couramment utilisés pour distinguer les donneurs de cellules dérivées de cellules de destinataire origine. C57BL/6J ^{H2b, CD45.2} , Balb / C ^H2d et B6.SJL ^CD45.1 sont les souches de souris les plus couramment utilisés dans la greffe de moelle osseuse, car la contribution cellule donneuse peut être facilement évaluée par cytométrie en flux mesure CD45.1 vs vs CD45.2 ou H2b H2D. Cependant, de nombreuses autres souches telles que FVB / NJ ⁵ et C3H sont également souvent utilisé pour générer transgénique ou génétiquement des souris knockout. Ces souris peuvent être recroisé à une lignée consanguine et maintenus dans un mélange génétique / CMH arrière-plan. Dans ces cas, la détermination de la prise de greffe de cellule donneuse et la fonction HSC pourrait être difficile en tant que marqueurs de surface spécifiques des donneurs de cellules peuvent ne pas être disponibles.

Utilisation du chromosome Y spécifique sonde d'ADN pour détecter les cellules du donneur mâle par transfert de Southern de sexe dépareillés greffe de moelle osseuse a été développé par le groupe du Dr Miwa ^6. Ensuite, une PCR en temps réel pour la région Y détermination du sexe a été jugée une méthode précise et hautement spécifique pour quantifier macellules fœtales LE dans le système sanguin maternel ^7. Ce concept a été adapté par le groupe du Dr Schwarzenberger pour le développement d'une technique de PCR en temps réel dans un modèle de transplantation de moelle osseuse murine pour déterminer la prise de greffe de cellule donneuse ^8. Nous avons également modifié cette méthode pour la mesure de la prise de greffe de cellule donneuse dans FVB / NJ modèle osseuse de souris greffe de moelle. Cette méthode est actuellement largement utilisés dans notre groupe pour étudier le rôle de la kinase PIM1 en biologie HSC.

Protocole

1. Isolement de cellules de moelle osseuse

1. Euthanasier mâles donneurs FVB / NJ souris et femelles FVB / NJ souris utilisant le CO ₂ méthode suivie par dislocation cervicale. Les femelles FVB / NJ cellules de moelle osseuse seront utilisées comme cellules compétitifs.
2. Utilisez de petits ciseaux et des pinces, disséquer les fémurs et tibiaes de souris et de les placer dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm contenant 6 ml RPMI1640 glacée avec du FBS inactivé chaleur 5%. Utilisez le tissu Kimwipe pour enlever les muscles et d'autres tissus. Couper les deux extrémités de chaque corps d'os dans le plat.
3. Branchez l'extrémité de l'os avec une aiguille 23G sur une seringue de 3 cc, rincer la moelle osseuse avec RPMI1640 avec du FBS inactivé chaleur 5% dans le plat. Désagréger les tissus de moelle osseuse par des aspirations répétées en utilisant la même aiguille. Transférer la suspension cellulaire à 15 ml du tube de centrifugation.
4. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 xg, éliminer le surnageant, remettre en suspension les cellules dans 1 ml de sang température ambiante tampon de lyse des globules rouges (155 mM de pbicarbonate de otassium, 10 mM de chlorure d'ammonium, 0,1 mM d'EDTA, pH = 7,4) et incuber à température ambiante pendant 5 min, puis ajoutez 5-10 ml de RPMI 1640 avec du FBS inactivé chaleur 5%.
5. Passez les cellules à travers un tamis cellulaire. Recueillir le débit à travers un nouveau tube. Centrifuger pendant 5 min à 400 x g. Retirer le surnageant, le culot cellulaire ne doit contenir aucune couleur rouge. L'absence de couleur rouge indique une suppression complète des globules rouges. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de RPMI 1640 avec du FBS inactivé chaleur 5%. Vortexer doucement pour s'assurer que la suspension cellulaire est complètement uniforme. Prélever une partie aliquote et compter les cellules dans un hémocytomètre. Calculez combien de volume de cellules nécessaires pour la transplantation de moelle osseuse et de cellules aliquotes et mélanger suffisamment de cellules du donneur avec des cellules mâles concurrents femelles à un ratio de 5:2. Centrifuger pendant 5 min à 400 xg, laver avec du PBS, remettre en suspension dans du PBS à la concentration finale de cellules du donneur à 5 x 10 cellules ⁶ / ml et un concurrent à 2 × 10 ⁶ / ml.

2. Concurrentiel greffe de moelle osseuse

1. Souris irradier bénéficiaires féminins (8-12 semaines d'âge) avec des rayons gamma radiateur à une dose unique de 11Gy 4-6 heures avant la transplantation de moelle osseuse 137Cs.
2. Placez les souris irradiées de sexe féminin dans un dispositif de retenue de la souris. Injecter le donateur mixte et les cellules concurrents via la veine caudale dans 0,1 ml de volume total de sorte que chaque souris reçoit ⁵ × 10 5 cellules du donneur et 2 × 10 ⁵ cellules de la moelle osseuse concurrents.

3. Prélèvement des échantillons

Couples semaine après la transplantation de moelle osseuse, de prélever des échantillons de sang périphérique (~ 50 pi) de la souris femelle receveuse par rétro-orbitaire saignement sous condition de l'anesthésie. Les échantillons sont prélevés dans des tubes EDTA enduits. Échantillons BM peuvent également être recueillies à la fin de l'expérience, le plus souvent au moins 4 post-transplantation mois, avec les mêmes procédures que décrites précédente (étape 1);% habituellement 20-40 du1 tibia cellules BM sont assez pour faire une quantité suffisante d'ADN. Échantillons de sang ou de BM âge appariés normaux chez les souris femelles et mâles sont également recueillies pour préparer la courbe standard.

4. Isolement de l'ADN génomique

1. Ajouter 4 × volume de la chambre de lyse RBC température tampon (~ 200 pi) pour chaque échantillon de sang. Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter 1 ml de PBS, puis tourner vers le bas pour enlever la plupart des lysé RBC.
2. Isoler l'ADN en utilisant un kit d'extraction de sang ADN (ADN QIAmp sang kit d'extraction). Préchauffer le tampon d'élution (AE) à 37 ° C afin d'améliorer le rendement de l'ADN élué. ADN masculins et féminins pour la courbe standard sont isolés de façon similaire.
3. (Facultatif) ADN génomique peut être encore purifié ou concentré selon la méthode de précipitation EtOH en présence d'acétate de sodium 3 M (pH = 5,5). Les culots d'ADN sont ensuite remises en suspension dans 40-50 ul d'eau distillée pour l'analyse immédiatement ou conservés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.
4. Mesurer la concentr ADNtion avec photomètre ND-1000 spectres Nanodrop. Les échantillons présentant des DO 260/280 entre 1,8 à 2,0 sont utilisés pour une analyse plus approfondie.
5. Diluer avec l'ADN DNase sans H ₂ O à 4ng/μl dans un volume total de 50 ul.

5. Préparation courbe standard

Diluer l'ADN masculin et féminin ADN à une concentration de 4 ng / ul, et rendre le mélange d'ADN selon la Table1

% D'ADN mâle en arrière-plan Femme	Volume (pi) de l'ADN masculin 4ng/μl	Volume (pi) de l'ADN femelle 4ng/μl	Le volume total (pl)
0,2	1	499	500
0,5	1	199	200
2,5	5	195	200
12,5	25	175	200
50	100	100	200
87,5	175	25	200
100	200	0	200

La préparation des échantillons tableau 1. Pour la courbe standard. Normales hommes et femmes FVB / NJ souris à l'âge de 8-12 sem ont été sacrifiés. Les cellules sanguines et BM ont été recueillies. ADN provenant de cellules mâles et des cellules femelles ont été isolées et remises en suspension à une concentration de 4ng/μl. Les ADN masculins et féminins ont été mélangés à des taux différents pour générer les mélanges d'ADN d'échantillons standard.

6. PCR en temps réel

1. Mettre en place la plaque de réaction PCR en mélangeant SYBR Green Supermix réactif avec des amorces et l'ADN génomique. Le volume de réaction (20 pi) contient 400 nM de chaque amorce et 5 pi d'ADN génomique de cellules sanguines (4ng/μl x5 pi = 20 ng) dans chaque réaction. ADN samples normes et ont été établis en trois exemplaires. Les séquences d'amorces sont présentés dans le tableau 2.

Nom de gène	Avant	Inverser
Bcl2	5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA	5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG
Zfy1	5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA	5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC

Tableau 2. Séquence de l'amorce de RT-PCR pour Bcl2 murin et Zfy1.

2. Effectuer la réaction de PCR en utilisant Biorad iQ5 machine de PCR dans les conditions suivantes: 95 ° C 3 min, 42 cycles d'amplification de 95 ° C pendant 10 sec, 58 ° C pendant 25 s et 72 ° C pendant 15 s, suivi d'une courbe de fusion- l'étape.
3. Obtenir cycle seuil (Ct) des valeurs par Bio-Rad iQ5 2.1 Système Standard Edition optique. Calculer δCt (Ct ^{Zfy1 <}/ Sup> ^Ct-Bcl2) valeur, et Zfy1 niveau d'expression est calculée en tant que valeur de ^{2-δ Ct.}
4. Établir des courbes d'étalonnage pour chaque série de réactions utilisant du ^2-δCt lecture à partir connues mâle / femelle mélanges étalons. Les courbes d'étalonnage sont générées par le moyen de pointage ^2-δCt valeur de triplicatas à l'ADN mâle% connue dans le mélange avec ajustement de la régression linéaire.

Résultats

Figures 1 et 2 montrent des exemples de courbes de référence tracées avec des valeurs moyennes de ^2-δCt contre pourcentages d'ADN masculin. Figure 1A montre la température de fusion spécifique pour Bcl2 et Zfy1 amplicons localisés à 78,5 ° C et 88,5 ° C respectivement. Bcl2 est utilisé en tant que gène de référence pour normaliser la quantité totale d'ADN chargé dans chaque réaction de PCR. Bcl2 courbes d'amplification (vue Log) pour chaque échan...

Discussion

L'objectif de notre étude est de fournir aux spectateurs une technique basée sur la PCR pour quantifier la prise de greffe de cellule donneuse dans un modèle concurrentiel osseuse murine greffe de moelle. Plusieurs études ont été rapportés par RT-PCR pour détecter les cellules du donneur dans des modèles de transplantation ^9-10. Le groupe du Dr Schwarzenberger a d'abord développé un modèle murin de greffe de moelle osseuse en utilisant PCR en temps réel pour amplifier chromosome Y spécif...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
RPMI 1640	Hyclone	SH30255.01
FBS	Invitrogen	16140-017	Inactivé par la chaleur
Le chlorure d'ammonium	MP Biomedicaals	194806
Bicarbonate de potassium	Pêcheur	P184-500
QIAamp d'ADN de sang minikit	Qiagen	51106
Tamis cellulaire	BD biosciences
iQ SYBR Green Supermix	Biorad	170-8882
iQ5 temps réel machine PCR	Biorad
Spectra photomètre	Nanodrop ND-1000	ND-1000