Utilizzando quantitativa real-time PCR per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo

Riepilogo

Determinare l'attecchimento delle cellule del donatore rappresenta una sfida in modelli di trapianto di midollo osseo di topo che non hanno ben definiti marcatori fenotipici. Abbiamo descritto una metodologia per quantificare maschio attecchimento delle cellule del donatore nel topo femmina riceventi di trapianto. Questo metodo può essere utilizzato in tutti i ceppi di topo per lo studio delle funzioni HSC.

Abstract

Murini osseo modelli di trapianto di midollo fornire un importante strumento per la misurazione di cellule staminali ematopoietiche (HSC) funzioni e geni che determinano / molecole che regolano la CSE. In questi sistemi modello di trapianto, la funzione di CSE è determinato dalla capacità di queste cellule di topi riceventi attecchire e ricostituire letalmente irradiati. Comunemente, la cellula donatrice contributo / attecchimento si misura con gli anticorpi alle proteine ​​delle cellule del donatore-specifici di superficie in citometria a flusso. Tuttavia, questo metodo dipende fortemente la specificità e la capacità del marcatore di superficie cellulare per differenziare donatore cellule derivate da cellule destinatario-origine, che possono non essere disponibili per tutti i ceppi di topo. Considerando i vari ambiti di provenienza di ceppi di topi geneticamente modificati sul mercato, questa superficie delle cellule / citometria a flusso a base di metodo presenta limitazioni significative soprattutto in ceppi di topi che mancano ben definiti marcatori di superficie di cellule del donatore separate da congenic destinatario ceLLS. Qui, abbiamo riportato un PCR-based tecnica per determinare l'attecchimento delle cellule del donatore / contributo in topi riceventi di trapianto. Abbiamo trapiantato maschi donatori cellule staminali emopoietiche del midollo osseo di topi irradiati letalmente congenici femminili. Campioni di sangue periferico sono stati raccolti in diversi tempi post-trapianto punti. Campioni di midollo osseo sono stati ottenuti al termine degli esperimenti. DNA genomico è stato isolato e il gene cromosoma Y specifico Zfy1, è stato amplificato mediante PCR quantitativa in tempo reale. L'attecchimento dei maschi donatori cellule derivate nei topi riceventi femminili è stato calcolato contro curva standard con percentuale nota di DNA maschile vs femminile. Bcl2 è stato usato come un gene di riferimento per normalizzare la quantità totale di DNA. I nostri dati suggeriscono che questo approccio determina affidabile attecchimento delle cellule del donatore e fornisce un metodo utile, ma semplice per misurare la ricostituzione delle cellule ematopoietiche in modelli murini di trapianto di midollo osseo. Il nostro metodo può essere eseguita di routine nella maggior parte dei laboratori perché noapparecchiature costose quali citometria di flusso è necessario.

Introduzione

Murine midollo osseo (BM) trapianto di modello è stato sviluppato nel 1960 ^1. Questo modello è stato ampiamente utilizzato per lo studio di cellule staminali ematopoietiche del donatore (HSC) biologia in un mouse destinatario host. Murine midollo osseo trapianto di modello ci ha fornito preziose conoscenze sulle funzioni HSC e la loro regolazione ed è indispensabile nella ricerca HSC. Trapianto allogenico di midollo osseo trapianto di modello come C57BL/6J ^H2b-Balb / C ^H2D o modello trapianto congenic come C56Bl/6J ^{CD45.2-B6.SJL CD45.1} sono utilizzati in molti laboratori per studiare la funzione dei geni sull'attività HSC ^2, effetto di trattamento farmacologico di patologie HSC funzione ³ o il trapianto correlati, come graft-versus-host disease (GvHD) ^4.

Marcatori cellulari di superficie come aplotipo MHC o CD45.1 sono comunemente usati per distinguere i donatori cellule derivate da cellule destinatario-origine. C57BL/6J ^{H2b, CD45.2} , Balb / C e ^H2D B6.SJL ^CD45.1 sono i ceppi di topi più comunemente utilizzate nel trapianto di midollo osseo in quanto il contributo cellula donatrice può essere facilmente valutata mediante citometria a flusso misurando CD45.1 vs CD45.2 o H2b vs H2D. Tuttavia, molti altri ceppi come FVB / NJ ⁵ e C3H sono spesso utilizzati per generare transgenici o geneticamente topi knockout. Questi topi possono essere re-incrociata a una linea inbred e mantenuto in un ambiente misto genetico / MHC sfondo. In questi casi, la determinazione delle cellule attecchimento donatore e funzione HSC potrebbe essere difficile da donatori specifici marcatori di superficie delle cellule può non essere disponibile.

Utilizzando Y-cromosoma-specifici test sul DNA per individuare le cellule del donatore di sesso maschile con macchia meridionale sesso non corrispondenti trapianto di midollo osseo è stato sviluppato dal gruppo del Dr. Miwa ^6. Poi, una real-time PCR per l'determina il sesso Y regione è risultato essere un metodo accurato ed altamente specifico per quantificare maLe cellule fetali nel sangue materno sistema ^7. Questo concetto è stato adattato da Dr. Schwarzenberger gruppo per lo sviluppo di una real-time PCR in un modello murino di trapianto di midollo osseo per determinare cellula donatrice attecchimento ^8. Abbiamo ulteriormente modificato questo metodo per la misura di attecchimento delle cellule del donatore in FVB / NJ modello trapianto di midollo osseo del mouse. Questo metodo è attualmente ampiamente utilizzata nel nostro gruppo per studiare il ruolo della chinasi PIM1 in biologia HSC.

Protocollo

1. Midollo osseo di isolamento cellulare

1. Eutanasia maschi donatori FVB / NJ topi e femmine FVB / NJ topi utilizzando CO ₂ metodo seguito da dislocazione cervicale. Le femmine FVB / NJ cellule di midollo osseo saranno utilizzate come cellule competitivi.
2. Utilizzare piccole forbici e pinze, sezionare femore e tibiaes da topi e metterli in un piatto 60 millimetri tessuto di coltura contenente 6 ml ghiacciata RPMI1640 con FBS di calore 5% inattivato. Usare tessuti Kimwipe per rimuovere muscolo e altri tessuti. Tagliare entrambe le estremità di ciascun albero osso nel piatto.
3. Collegare l'estremità dell'osso con l'ago 23G in siringa da 3 cc, risciacquare midollo osseo con RPMI1640 con FBS di calore 5% inattivato nel piatto. Disaggregare i tessuti del midollo osseo da aspirazioni ripetute con lo stesso ago. Trasferire la sospensione cellulare a 15 ml provetta da centrifuga.
4. Centrifugare le cellule per 5 min a 400 xg, rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in 1 ml di temperatura ambiente rosso tampone di lisi delle cellule del sangue (155 mM potassium bicarbonato, cloruro di ammonio 10 mM, 0,1 mM di EDTA, pH = 7,4) e incubare a temperatura ambiente per 5 min quindi aggiungere 5-10 ml di RPMI 1640 con 5% di FBS inattivato al calore.
5. Far passare le cellule attraverso un colino cellula. Raccogliere il flusso attraverso una nuova provetta. Centrifugare per 5 min a 400 x g. Rimuovere il surnatante, il pellet cellulare non dovrebbe contenere alcun colore rosso. L'assenza di colore rosso indica una rimozione completa di globuli rossi. Risospendere il pellet in 10 ml di RPMI1640 con FBS inattivato al calore 5%. Delicatamente vortex per assicurarsi che la sospensione cellulare è completamente uniforme. Prelevare un 'aliquota e contare le cellule in un emocitometro. Calcolare quanto il volume di cellule necessarie per il trapianto di midollo osseo e delle cellule aliquote abbastanza e mescolare cellule del donatore di sesso maschile con le cellule concorrenti femminili in un rapporto di 5:2. Centrifugare per 5 min a 400 xg, lavate con PBS, Risospendere in PBS alla concentrazione finale di cellule donatrici a 5 × 10 ⁶ cellule / ml e concorrente a 2 x 10 ⁶ / ml.

2. Competitivo di midollo osseo

1. Irradiano topi riceventi femmine (8-12 settimane di età) con radiatore 137Cs raggi gamma alla dose singola di 11Gy 4-6 ore prima del trapianto di midollo osseo.
2. Mettere i topi irradiati femminile in un dispositivo di immobilizzazione del mouse. Iniettare il donatore mista e cellule concorrenti con vena della coda in 0,1 ml di volume totale tale che ciascun topo riceve 5 x 10 ⁵ cellule donatrici e 2 × 10 ⁵ concorrente cellule di midollo osseo.

3. Raccolta dei campioni

Coppie settimane dopo il trapianto di midollo osseo, raccogliere campioni di sangue periferico (~ 50 ml) di topo ricevente femminile di retro-orbitale sanguinamento in condizioni di anestesia. I campioni vengono raccolti in tubi rivestiti EDTA. BM campioni possono essere raccolti alla fine della sperimentazione, di solito almeno 4 mesi dopo il trapianto, con modalità identiche a prima descritte (Fase 1);% di solito 20-401 tibia cellule BM sono abbastanza per fare una quantità sufficiente di DNA. Campioni di sangue o di BM di pari età topi normali femminili e maschili sono raccolti anche per preparare la curva standard.

4. Isolamento del DNA genomico

1. Aggiungere 4 × volume della camera lisi temperatura del tampone RBC (~ 200 pl) per ogni campione di sangue. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 1 ml di PBS, poi girare verso il basso per rimuovere la maggior parte del lisato RBC.
2. Isolare DNA utilizzando un kit del DNA del sangue di estrazione (kit del DNA QIAmp Sangue estrazione). Pre-riscaldare il tampone di eluizione (AE) a 37 ° C per migliorare la resa di DNA eluito. DNA di sesso maschile e femminile per la curva standard sono isolati in modo simile.
3. (Facoltativo) DNA genomico può essere ulteriormente purificato o concentrati usando EtOH metodo di precipitazione in presenza di 3 M acetato di sodio (pH = 5,5). I pellet di DNA vengono quindi risospese in 40-50 microlitri di acqua distillata per analisi immediatamente o conservato a -20 ° C per utilizzo futuro.
4. Misurare la Concentrazione DNAzione con Nanodrop ND-1000 fotometro spettri. I campioni con OD 260/280 tra 1,8-2,0 vengono utilizzati per ulteriori analisi.
5. Diluire con DNA DNAasi libera H ₂ O a 4ng/μl in un volume totale di 50 microlitri.

5. Preparazione Curva standard

Diluire DNA maschio e femmina DNA ad una concentrazione di 4 ng / mL, e rendere la miscela di DNA secondo la Table1

% Di DNA maschile in background Femmina	Volume (pl) di 4ng/μl DNA maschile	Volume (pl) di 4ng/μl DNA femminile	Volume totale (pl)
0,2	1	499	500
0,5	1	199	200
2,5	5	195	200
12,5	25	175	200
50	100	100	200
87,5	175	25	200
100	200	0	200

Tabella 1. Preparazione del campione per la curva standard. Normali maschili e femminili FVB / NJ topi all'età di 8-12wks sono stati sacrificati. Cellule del sangue e BM sono stati raccolti. DNA da cellule maschili e femminili cellule sono state isolate e risospese ad una concentrazione di 4ng/μl. I DNA maschili e femminili sono stati miscelati in rapporti diversi per generare le miscele standard del campione di DNA.

6. Real-time PCR

1. Impostare la piastra di reazione PCR mediante miscelazione dei reagenti SYBR Green Supermix con primer e del DNA genomico. Il volume di reazione (20 pl) contenente 400 nM di ciascun primer e 5 microlitri di DNA genomico delle cellule del sangue (4ng/μl pl x5 = 20 ng) in ciascuna reazione. DNA samples e gli standard sono stati istituiti in triplice copia. Le sequenze dei primers sono mostrati nella Tabella 2.

Nome del gene	Avanti	Invertire
Bcl2	5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA	5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG
Zfy1	5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA	5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC

Tabella 2. RT-PCR per la sequenza del primer Bcl2 murino e Zfy1.

2. Effettuare reazione di PCR utilizzando Biorad iQ5 macchina PCR con le seguenti condizioni: 95 ° C 3 min, 42 cicli di amplificazione di 95 ° C per 10 sec, 58 ° C per 25 sec e 72 ° C per 15 secondi, seguito da una curva di fusione- passo.
3. Ottenere ciclo soglia (Ct) i valori da Bio-Rad iQ5 2.1 Sistema Standard Edition ottico. Calcola ACT (Ct ^{Zfy1 <}/ Sup>-Ct ^Bcl2) valore, e Zfy1 livello di espressione viene calcolato come valore di ^{2-δ Ct.}
4. Stabilire curve standard per ogni serie di reazione con ^2-ACT lettura di note miscele standard maschio / femmina. Le curve standard sono generati tracciando la media di ^2-ACT valore triplicati al DNA% noto maschio nella miscela con raccordo regressione lineare.

Risultati

Figura 1 e 2 mostrato esempi di curve standard tracciate con valori medi di ^2-ACT contro percentuali di DNA maschile. Figura 1A mostrato specifica temperatura di fusione per Bcl2 e Zfy1 ampliconi localizzati a 78,5 ° C e 88,5 ° C, rispettivamente. Bcl2 è utilizzato come gene di riferimento per normalizzare la quantità totale di DNA caricato in ciascuna reazione PCR. Bcl2 curve di amplificazione (vedi Log) per ciascun campione standard fondersi tra loro indipendente dalla ...

Discussione

L'obiettivo del nostro studio è quello di fornire il pubblico una tecnica PCR per quantificare l'attecchimento delle cellule del donatore in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo. Diversi studi sono stati riportati con RT-PCR per rilevare le cellule del donatore in modelli di trapianto ^9-10. Gruppo del Dr. Schwarzenberger primo sviluppato un modello murino di midollo osseo trapianto con real-time PCR per amplificare y-cromosoma-specifici ^8. Questo metodo è stato utilizz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
RPMI 1640	Hyclone	SH30255.01
FBS	Invitrogen	16140-017	Inattivato al calore
Cloruro di ammonio	MP Biomedicaals	194806
Bicarbonato di potassio	Pescatore	P184-500
QIAamp DNA sangue minikit	Qiagen	51106
Cella filtro	Bioscienze BD
iQ SYBR Green Supermix	Biorad	170-8882
iQ5 real time PCR macchina	Biorad
Spectra fotometro	Nanodrop ND-1000	ND-1000