Использование Количественный ПЦР в реальном времени для определения Приживление клетки-донора в конкурентной мышиной модели трансплантации костного мозга костей

Резюме

Определение приживления донорских клеток представляет собой проблему в мышь трансплантации костного мозга модели, которые не имеют четко определенные фенотипические маркеры. Мы описали методологию количественного мужчины приживления донорских клеток у самок мышей получателей пересадки. Этот метод может быть использован во всех линий мышей для изучения HSC функций.

Аннотация

Мышиной модели трансплантации костного мозга являются важным инструментом в измерении гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и определения функций генов / молекул, которые регулируют ГСК. В этих системах пересадки модели, функции ГСК определяется способность этих клеток к прижился и восстановить летально облученных мышей получателя. Как правило, клетки-донора вклада / приживления измеряется с помощью антител к донорам конкретные белки клеточной поверхности с помощью проточной цитометрии. Однако этот метод сильно зависит от специфики и возможностей маркера поверхности клеток дифференцироваться донора клеток, полученных из получателей возник клеток, которые могут быть доступны не для всех мышей штаммами. С учетом различных особенностей, генетически модифицированные мыши штамма на рынке, это на поверхности клеток / проточной цитометрии на основе метода имеет существенные ограничения, особенно в мышь штаммы, которые не имеют четко определенных поверхностных маркеров для отдельных клеток донора из конгенных получателя сеLLS. Здесь мы сообщали, ПЦР-метод для определения донора приживления клеток / мышь вклад в пересадке реципиенту. Мы пересаживали мужчины ГСК донора костного мозга для летально облученных конгенных самок мышей. Периферической крови были собраны в разное время пересадки сообщению пунктов. Образцов костного мозга были получены в конце эксперимента. Геномной ДНК выделяли и хромосома Y конкретного гена, Zfy1, был усилен с использованием количественной ПЦР в реальном времени. Приживления мужчины-донора клеток, полученных в самок мышей получатель был рассчитан на стандартную кривую с известными процент мужчин против женщин ДНК. Bcl2 был использован в качестве справочного гена для нормализации общего количества ДНК. Наши данные показывают, что такой подход надежно определяет приживления донорских клеток и предоставляет полезную, но простой метод измерения гемопоэтические клетки восстановления в мышиных моделях трансплантации костного мозга. Наш метод может быть регулярно проводится в большинстве лабораторий, потому что нетдорогостоящим оборудованием, таким как проточной цитометрии не требуется.

Введение

Мышиного костного мозга (КМ) трансплантации модель была впервые разработана в 1960-х годах ^1. Эта модель широко используется для изучения доноров гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в биологии мыши получателя хозяина. Мышиные трансплантации костного мозга модель дала нам ценные знания о HSC функций и их регуляции и незаменим в HSC исследований. Аллогенной трансплантации костного мозга модели, как C57BL/6J ^H2b-Balb / C ^H2d или конгенных модель пересадки, как C56Bl/6J ^{CD45.2-B6.SJL CD45.1} используются во многих лабораториях для изучения функций генов на деятельность HSC ^2, эффект медикаментозного лечения на HSC функция ³ или трансплантации заболеваний, таких как трансплантат против хозяина (РТПХ) ^4.

Маркеров клеточной поверхности, такие как MHC гаплотип или CD45.1 обычно используется для различения донора клеток, полученных из получателей возник клеток. C57BL/6J ^{H2b, CD45.2} , Balb / C ^H2d и B6.SJL ^CD45.1 являются наиболее часто используемых линий мышей в трансплантации костного мозга, поскольку вклад донорских клеток можно легко оценить с помощью проточной цитометрии измерения CD45.1 против CD45.2 или H2b против H2D. Однако, многие другие штаммы, такие как FVB / NJ ⁵ и C3H также часто используются для создания генетически модифицированных трансгенных мышей или нокаутом. Эти мыши может быть backcrossed к инбредной линии и поддерживается в смешанной генетической / MHC фоне. В этих случаях для определения донора приживления клеток и HSC функция может быть сложно, как донор конкретным-клеточных маркеров поверхности не могут быть недоступны.

Использование Y-хромосоме конкретного зонда ДНК для выявления доноров мужчин клеток южной пятном в секс-несоответствие трансплантация костного мозга была впервые разработана группой д-р Miwa ^6. Тогда, ПЦР в реальном времени для секс-области, определяющей Y оказался точным и весьма специфический метод для количественного мале клетки плода в материнской системе крови ^7. Эта концепция была адаптирована группа доктора Шварценбергер для развития ПЦР в реальном времени техника в мышиной модели трансплантации костного мозга костей, чтобы определить приживления донорских клеток ^8. Мы также изменение этого метода для измерения приживления донорских клеток в FVB / NJ мыши кости модели трансплантации костного мозга. Этот метод в настоящее время широко используется в нашу группу для изучения роли PIM1 киназы в HSC биологии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Клеток костного мозга изоляции

1. Усыпить мужчины-донора FVB / NJ мышей и самок FVB / NJ мышей с использованием CO ₂ метода следует смещения шейных позвонков. Женский FVB / NJ клеток костного мозга будет использоваться в качестве конкурентного клеток.
2. Используйте небольшие ножницы и пинцет, рассекают из бедра и tibiaes от мышей и разместить их в 60 мм блюдо культуры ткани содержащий 6 мл ледяного RPMI1640 с 5% инактивированной нагреванием FBS. Используйте Kimwipe ткань для удаления мышц и других тканей. Отрежьте оба конца каждой кости вала в блюдо.
3. Подключите конец кости с 23G иглу на шприц 3 мл, избавиться от костного мозга с RPMI1640 с 5% инактивированной нагреванием FBS в блюдо. Разбивку тканей костного мозга повторяется устремлений, используя тот же иглу. Передача клеточной суспензии до 15 мл центрифужные пробирки.
4. Спином вниз клетки в течение 5 мин при 400 мкг, удалить супернатант, ресуспендируют клеток в 1 мл комнатной температуре красного буфера для лизиса клеток крови (155 мм рotassium бикарбонат натрия, 10 мМ хлорид аммония, 0,1 мМ ЭДТА, рН = 7,4) и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин, затем добавить 5-10 мл RPMI 1640 с 5% инактивированной нагреванием FBS.
5. Передайте клетки через ячейки сетчатого фильтра. Сбор потока через в новую пробирку. Спином вниз в течение 5 мин при 400 х г. Удалить супернатант, осадок клеток не должны содержать никаких красного цвета. Отсутствие красного цвета указывает на полное удаление красных кровяных клеток. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл RPMI 1640 с 5% инактивированной нагреванием FBS. Аккуратно вихрь, чтобы убедиться суспензию клеток является полностью однородным. Возьмите и посчитайте аликвоты клеток в гемацитометре. Посчитайте, сколько объема клеток, необходимых для пересадки костного мозга и аликвоту достаточно клеток и смешать мужских клеток донора с конкурентом женских клеток в соотношении 5:2. Спином вниз в течение 5 мин при 400 х г, промывают PBS, ресуспендируют в PBS с конечной концентрации донорских клеток в 5 × 10 ⁶ / мл и конкурентов клеток на 2 × 10 ⁶ / мл.

2. Конкурентные трансплантации костного мозга

1. Облучения самок мышей получателя (8-12 недель возраста) с 137Cs гамма-лучи, радиатор на одной дозы 11Gy 4-6 часа до пересадки костного мозга.
2. Поместите облученных самок мышей в мышей фиксатор. Inject смешанных доноров и конкурентов клетки через хвостовую вену в 0,1 мл общего объема таких, что каждая мышь получает ⁵ × 10 5 клеток донора и 2 × 10 ⁵ конкурентом клеток костного мозга.

3. Сбора проб

Пары недель после трансплантации костного мозга, сбор образцов периферической крови (~ 50 мкл) из женских мыши получателя, ретроорбитального кровотечение под наркозом состоянии. Образцы собираются в EDTA покрытием труб. BM образцы могут быть собраны в конце эксперимента, как правило, не менее 4 месяцев после трансплантации, с таким же процедурам, описанным предыдущим (шаг 1), обычно 20-40%1 голени BM клеток достаточно, чтобы сделать достаточное количество ДНК. Кровь или BM образцов из соответствующей возрастной нормального женского и мужского мышей также собираются подготовить стандартной кривой.

4. Геномной ДНК изоляции

1. Добавить 4 × объем комнатной температуре РБК буфера для лизиса (~ 200 мкл) каждого образца крови. Все хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить 1 мл PBS, а затем спином вниз, чтобы удалить большую часть лизированных РБК.
2. Изолировать ДНК с помощью ДНК крови добычи комплект (QIAmp ДНК крови добычи комплект). Предварительно теплой элюции буфером (AE) при 37 ° С для повышения доходности Элюированную ДНК. Мужской и женский ДНК для стандартной кривой выделяют аналогично.
3. (Необязательно) геномной ДНК может быть дополнительно очищенной или концентрируют с использованием этанола методом осаждения в присутствии 3 М ацетата натрия (рН = 5,5). ДНК гранулы затем суспендируют в 40-50 мкл дистиллированной воды для анализа немедленно или хранят при температуре -20 ° C для дальнейшего использования.
4. Измерьте ДНК концентрничество с NanoDrop ND-1000 спектров фотометр. Образцы с ОП 260/280 между 1.8-2.0 используются для дальнейшего анализа.
5. Развести ДНК с ДНК-азы бесплатно H ₂ O в 4ng/μl в общем объеме 50 мкл.

5. Стандартная подготовка кривой

Разбавить мужской и женской ДНК ДНК в концентрации 4 нг / мкл, и сделать смесь ДНК в соответствии с Table1

% От мужского ДНК в Женский фон	Объем (мкл) 4ng/μl мужской ДНК	Объем (мкл) 4ng/μl ДНК женщины	Общий объем (мкл)
0,2	1	499	500
0,5	1	199	200
2,5	5	195	200
12,5	25	175	200
50	100	100	200
87,5	175	25	200
100	200	0	200

Таблица 1. Пробоподготовка к стандартным кривой. Нормальный мужчина и женщина FVB / NJ мышей в возрасте 8-12wks были принесены в жертву. Кровь и BM клетки были собраны. ДНК из клеток мужской и женской клетки были выделены и ресуспендировали в концентрации 4ng/μl. Мужской и женский ДНК смешивают в различных соотношениях для создания стандартных смесей ДНК образца.

6. ПЦР в реальном времени

1. Установите пластину ПЦР путем смешивания SYBR Green СУПЕРМИКС реагента с грунтовки и геномной ДНК. Реакционного объема (20 мкл) содержится 400 нМ каждого праймера, 5 мкл клеток крови геномной ДНК (4ng/μl x5 мкл = 20 нг) в каждой реакции. ДНК SAMPле и стандарты были установлены в трех экземплярах. Последовательности праймеров приведены в таблице 2.

Гена имя	Вперед	Обратный
Bcl2	5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA	5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG
Zfy1	5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA	5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC

Таблица 2. RT-PCR праймера для мышиных Bcl2 и Zfy1.

2. Выполните ПЦР-реакции с использованием Biorad iQ5 ПЦР машины при следующих условиях: 95 ° C 3 мин, 42 циклов амплификации 95 ° С в течение 10 сек, 58 ° C в течение 25 сек и 72 ° C в течение 15 секунд, после таяния кривой шагу.
3. Получить порогового цикла (Ct) значения, Bio-Rad iQ5 2,1 Standard Edition оптической системы. Расчет δCt (Ct ^{Zfy1 <}/ SUP>-Ct ^Bcl2) значение, и Zfy1 уровень экспрессии рассчитывается как стоимость ^{2-δ Ct.}
4. Создание стандартных кривых для каждой реакции серий с использованием ^2-δCt чтение из известных мужчин / женщин стандартных смесей. Стандартные кривые создаются путем построения среднего ^2-δCt значение трех повторах с известными% мужчин ДНК в смеси с линейной регрессии установки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Рисунок 1 и 2 показали примеры стандартных кривые со средними значениями ^2-δCt против проценты мужской ДНК. Рис. 1А показали определенную температуру плавления Bcl2 и Zfy1 ампликонов локализован на 78,5 ° C и 88,5 ° С соответственно. Bcl2 используется в качестве справочного г...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Цель нашего текущего исследования заключается в предоставлении аудитории ПЦР технику количественного приживления донорских клеток в конкурентной мышиной модели трансплантации костного мозга костей. Несколько исследований сообщили, используя RT-PCR для обнаружения донорских клеток в...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
RPMI 1640	Hyclone	SH30255.01
FBS	Invitrogen	16140-017	Тепло инактивированная
Хлористый аммоний	MP Biomedicaals	194806
Двууглекислое кали	Рыбак	P184-500
QIAamp ДНК крови MINIKIT	Qiagen	51106
Сотовый фильтр	BD Bioscience
IQ SYBR Green СУПЕРМИКС	Biorad	170-8882
iQ5 ПЦР в реальном времени машины	Biorad
Spectra фотометр	NanoDrop ND-1000	ND-1000