采用实时定量PCR检测供体细胞植入一个具有竞争力的小鼠骨髓移植模型

摘要

确定供体细胞移植在小鼠骨髓移植模型中，缺乏定义的表型标记提出了挑战。我们描述了一种方法来量化男性捐赠者的细胞植入女性移植受体小鼠。此方法可用于研究HSC功能在所有的小鼠品系。

摘要

小鼠骨髓移植模型提供了一个重要的工具，在测量造血干细胞（HSC）功能，并确定基因/分子，调节造血干细胞。在这些移植模型系统，是由这些细胞的能力，嫁接和重组致死剂量照射的受体小鼠的造血干细胞的功能。一般情况下，供体细胞的贡献/植活测定用流式细胞仪供体特异性的细胞表面蛋白的抗体。然而，该方法在很大程度上依赖于特异性和区分来自供体的细胞的细胞表面标志物的能力，从收件人起源的细胞，这可能不是可用于所有的小鼠品系。考虑到各种不同的背景在市场上的转基因小鼠品系，该细胞表面/流量流式细胞仪为基础的方法具有显着的局限性，特别是在缺少界定良好的从同类系收件人策单独的供体细胞的表面标志物的小鼠品系LLS。在这里，我们报道了基于PCR的技术来确定移植的受体小鼠的体细胞移植/贡献。男性捐赠者的骨髓造血干细胞移植到致死剂量照射的同源雌性小鼠。在不同时间点移植后外周血标本收集。在实验结束后获得的骨髓标本。分离基因组DNA和Y染色体的特定基因，Zfy1，采用实时定量PCR扩增。在女性受体小鼠的植入男性捐赠者来源的细胞对标准曲线的男性与女性的DNA与已知的百分比计算。 Bcl2蛋白被用作参照基因正常化的总DNA量。我们的数据表明，这种方法可靠地确定供体细胞植入，并提供了一​​个有用的，但简单的方法，测量造血干细胞重建小鼠骨髓移植模型。我们的方法可以在大多数实验室常规进行的，因为没有需要昂贵的设备，如流式细胞仪。

引言

小鼠骨髓（BM）移植模型最早是在20世纪60年代^1。这个模型已被广泛用于造血干细胞（HSC）在宿主受体小鼠的生物学研究。小鼠骨髓移植模型为我们提供了宝贵的知识HSC功能及其调控，造血干细胞的研究是必不可少的。异基因骨髓移植模型，例如C57BL/6J ^H2B-BALB / C的^H2D或同源移植模型如C56Bl/6J ^CD45.2 B6.SJL ^CD45.1中使用的许多实验室研究基因的功能，影响HSC活动² HSC功能³或移植相关的疾病，如移植物抗宿主病^（GvHD）4上的药物治疗。

通常用于区分来自供体的细胞，从收件人-起源的细胞的细胞表面标志物，如MHC单倍型或CD45.1。 C57BL/6J ^H2B，CD45.2 ，BALB / C ^H2D和B6.SJL的^CD45.1是最常用的小鼠品系，在骨髓移植的供体细胞的贡献，因为可以很容易地用流式细胞仪，CD45.1 与 CD45.2或H2B与评估H2D。 FVB / NJ ⁵ C3H然而，许多其他菌株也经常被用来生成基因工程转基因或基因敲除小鼠。这些小鼠可回交自交系和保持在混合的遗传/ MHC背景。在这种情况下，确定供体细胞移植和造血干细胞的功能可能是困难的，因为供体特异性的细胞表面标志物可能无法使用。

Y-染色体特异DNA探针来检测Southern杂交性别不匹配的骨髓移植供体雄性细胞最早是由美和博士的研究小组^6。然后，在实时PCR的性别决定区Y被认为是准确的和高度特异性的方法来定量毫安乐胎儿细胞在母体血液系统^7。这个概念被改编由博士Schwarzenberger的研究小组开发的实时PCR技术在小鼠骨髓移植模型，以确定供体细胞植入^8。我们进一步修改FVB / NJ小鼠骨髓移植模型中的体细胞移植的测量方法。这种方法是目前广泛使用于本集团PIM1激酶在造血干细胞生物学作用的研究。

研究方案

1。骨髓细胞分离

1. 安乐死男性捐赠者FVB / NJ小鼠和雌性FVB / NJ小鼠使用CO _2的方法，随后用颈脱位。竞争力的细胞将被用作阴FVB / NJ骨髓细胞。
2. 用小剪刀和镊子，解剖小鼠和股骨和tibiaes，将它们放置在60毫米组织培养皿含6毫升冰冷的5％热灭活FBS培养液。使用kimwipe组织，去除肌肉和其他组织。在盘子里，切断两端的每个骨干。
3. 用23G针3毫升注射器的一端连接的骨，冲洗掉骨髓与5％热灭活FBS的RPMI1640入菜。个体骨髓组织中重复使用同一个针头的愿望。细胞悬浮液转移到15毫升离心管中。
4. 降速的细胞在400×g离心5分钟，除去上清液，细胞悬浮在1ml室温红血细胞溶解缓冲液（155毫米Potassium碳酸氢钠，氯化铵的10mM，0.1mM的EDTA，PH = 7.4），并在室温下孵育5分钟，然后加入5-10毫升，用5％热灭活的FBS的RPMI 1640。
5. 通过细胞通过细胞过滤网。收集流过到新的试管中。自旋向下的5分钟，于400×g。去除上清，细胞沉淀，不应该包含任何红色。红色的情况下指示一个完整的红血细胞的去除。与5％热灭活的FBS，细胞沉淀重悬在10毫升的RPMI1640。轻轻涡旋以确保细胞悬浮液是完全均匀的。分装在一个血球细胞计数。计算多少体积所需的骨髓移植和等分试样足够的细胞的细胞，并与竞争对手的雌性细胞在以5:2的比例混合男性供体细胞。降速在400×g离心5分钟，用PBS洗涤，重悬浮在PBS中的供体细胞的最终浓度在5×10 ^6个 / ml和竞争对手的细胞以2×10 ^6个 /毫升。

2。竞争骨髓移植

1. 照射雌性受体小鼠（8-12周龄），铯-137伽玛射线散热器在一个单一的剂量为11Gy骨髓移植前的4-6小时。
2. 放置在小鼠阻挡照射的雌性小鼠。经尾静脉注入混合的供体和竞争对手的细胞在0.1毫升的总体积，使得每个鼠标接收5×10 ^5个供体细胞和2×10 ⁵的竞争对手骨髓细胞。

3。样品采集

情侣周后，骨髓移植，收集雌性受体小鼠外周血样本（约50微升）从麻醉状态下的眼窝出血。样品被收集到EDTA涂层管。 BM样品也被收集在实验结束时，通常至少为4个月后移植，用相同的方法与前面描述的（步骤1），通常为20-40％的1胫骨骨髓细胞足以让足量的DNA。也收集血液或骨髓样本从年龄匹配的正常雌性和雄性小鼠制备标准曲线。

4。基因组DNA提取

1. 加入4倍体积的：室温红细胞裂解缓冲液（200微升），各血液试样。搅拌均匀，室温孵育5分钟。加入1毫升的PBS，然后停止旋转，以去除大部分的裂解RBC的。
2. 使用血液DNA提取试剂盒（QIAmp DNA血液提取试剂盒）提取DNA。预温（AE）的洗脱缓冲液在37℃下洗脱的DNA，以提高产率。同样是孤立的男性和女性DNA的标准曲线。
3. （可选）的基因组DNA可以进一步纯化，或在3 M醋酸钠（pH = 5.5）的存在下，用乙醇沉淀法浓缩。然后将DNA沉淀再悬浮在40-50微升蒸馏水立即进行分析，或储存在-20℃下，以备将来使用。
4. 测量的DNA concentr“ATION的NanoDrop ND-1000光谱光度计。样品OD 260/280之间的,1.8-2 .0用于进一步的分析。
5. 稀释的DNA与DNA酶游离H _{2 O}以4ng/μl在总体积为50μl。

5。标准曲线的制备

男性DNA和女性DNA稀释4纳克/微升的浓度，并根据表1的DNA混合物中

％的女性背景的男性DNA	4ng/μl男性DNA的体积（μl）	4ng/μl女性DNA的体积（μl）	总体积（μl）
0.2	1	499	500
0.5	1	199	200
2.5	5	195	200
12.5	25	175	200
50	100	100	200
87.5	175	25	200
100	200	0	200

表1。样品制备标准曲线。正常男性和女性的FVB / NJ小鼠在年龄8 12wks的牺牲。收集血液和骨髓细胞。从雄性细胞和雌性细胞的DNA中分离出，并将其再悬浮在浓度4ng/μl。男性和女性的DNA在不同的比例混合，以产生DNA标准样品混合物。

6。实时PCR

1. 设置PCR SYBR Green超与引物和基因组DNA的试剂混合的反应板。反应体积（20微升）包含400 nM的各引物和5微升的血细胞的基因组DNA（4ng/μlX5的微升= 20毫微克）在每一个反应。 DNA桑普成立于一式三份文件和标准。引物序列示于表2。

基因名称	前	逆转
Bcl2的	5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA	5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG
Zfy1	5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA的	5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC

表2中。RT-PCR引物序列Bcl2和Zfy1小鼠。

2. 进行PCR反应，使用Biorad公司iQ5 PCR机具备以下条件：95℃3分钟，42个扩增循环：95°C为10秒，58℃下为25秒和72℃，持续15秒，然后通过熔融曲线步骤。
3. 获取由Bio-Rad iQ5 2.1标准版光学系统的循环阈值（Ct）值。计算ΔCT（CT ^{Zfy1 <}/ SUP>-CT ^Bcl2的 ）值，和Zfy1表达水平的计算公式为^2-δCT值的。
4. 建立标准曲线，从已知的男/女标准混合使用^2-ΔCT阅读的每个系列反应。所产生的标准曲线绘制^2-ΔCT值的平均值的一式三份的已知％男性DNA的混合物用线性回归拟合。

结果

图1和图2显示对男性的DNA的百分比，平均^2-ΔCT值绘制标准曲线的例子， 图1A中显示的特定的熔点温度Bcl2和Zfy1的扩增子定位于78.5℃和88.5℃，分别。 Bcl2蛋白被用作参照基因正常化加载的每个PCR反应的DNA的总量。 Bcl2的扩增曲线（日志视图），对于每个标准样品合并男性DNA浓度与彼此独立，表示加载的DNA（ 图1B）的等量。然而，Zfy1迁移的扩增曲线的左?...

讨论

我们目前的研究目标是提供观众一个基于PCR技术定量供体细胞移植在竞争激烈的小鼠骨髓移植模型。一些研究已经用RT-PCR检测供体细胞移植模型^9-10。第一博士Schwarzenberger的研究小组开发出了小鼠骨髓移植模型，采用实时PCR扩增Y染色体特定的^8。这种方法被用来研究GLI-1在造血干细胞的功能活动^11。然后，我们进一步修改了协议，在可视化的格式，并提供了一​​个详细的，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论（可选）
RPMI 1640	Hyclone公司	SH30255.01
FBS	Invitrogen公司	16140-017	热灭活
氯化铵	MP Biomedicaals	194806
碳酸氢钾	费舍尔	P184-500
的QIAamp DNA血液MINIKIT	Qiagen公司	51106
细胞过滤器	BD生物科学
iQ SYBR Green超	Biorad公司	170-8882
iQ5实时PCR仪	Biorad公司
光谱光度计	的NanoDrop ND-1000	ND-1000