Velocímetro de Micro-partículas para Velocity perfil mediciones de flujos de sangre Micro

Resumen

Velocimetría de imágenes de micro-partículas (μPIV) se utiliza para visualizar imágenes pareadas de micro partículas sembradas en los flujos sanguíneos que son correlación cruzada para dar un perfil exacto de velocidad. Velocidad de cizallamiento, la velocidad máxima, la forma del perfil de velocidad, y la velocidad de flujo, cada uno de los cuales tiene aplicaciones clínicas, se pueden derivar de estas mediciones.

Resumen

Velocimetría de imágenes de micro-partículas (μPIV) se utiliza para visualizar imágenes pareadas de micro partículas sembradas en los flujos sanguíneos. Las imágenes son de correlación cruzada para dar un perfil exacto de velocidad. Un protocolo se presenta para μPIV mediciones de los flujos sanguíneos en microcanales. En la escala de la microcirculación, la sangre no puede ser considerado como un fluido homogéneo, ya que es una suspensión de partículas flexibles suspendidas en el plasma, un fluido newtoniano. Velocidad de cizallamiento, la velocidad máxima, la forma del perfil de velocidad, y la velocidad de flujo se pueden derivar de estas mediciones. Varios parámetros clave tales como la profundidad focal, la concentración de partículas, y el sistema de cumplimiento, se presentan con el fin de garantizar, datos útiles precisos junto con ejemplos y resultados representativos de los diferentes hematocritos y condiciones de flujo.

Introducción

El cuerpo humano contiene numerosos vasos con diámetros de menos de 50 micras, que son el principal sitio de intercambio entre la sangre y los tejidos. El estudio del flujo sanguíneo en los vasos representa un reto considerable, tanto por la magnitud de las medidas y las propiedades de los fluidos de la sangre. Estas medidas, incluido el gradiente de presión, la fuerza cortante en la pared, y perfiles de velocidad en las arteriolas y vénulas, son factores clave relacionados con las respuestas fisiológicas. En la actualidad hay oportunidades sin precedentes para resolver estos desafíos de medición, gracias a las nuevas técnicas experimentales a escala micro para estudiar la microcirculación y resolver este problema multiescala.

Velocimetría de imágenes de micro-partículas (μPIV) es una técnica de visualización de flujo basado en partículas que se utiliza para evaluar los perfiles de velocidad de flujo de sangre en microcanales a través de la correlación cruzada. μPIV, desarrollada por primera vez por Santiago et al., se ha utilizado con hemorheologyestudios desde Sugii et al. en 2001 utilizaron la técnica para medir el flujo de sangre en tubos de vidrio de 100 micras redondas ^1,2. Diferentes enfoques para existir μPIV. Cámaras de alta velocidad se pueden utilizar para correlacionar el movimiento de las células rojas de la sangre (glóbulos rojos), y las imágenes de impulsos se pueden utilizar para correlacionar el movimiento de las partículas trazadoras. Cualquiera de estas opciones se puede acoplar con un microscopio en posición vertical o invertida, dependiendo de la aplicación. En ambos casos, el resultado es un perfil de velocidad 2D. Otro enfoque es el uso de un microscopio confocal para lograr perfiles 2D y 3D. Este método ha sido aplicado a la sangre ^3,4,5.

Micro escala PIV tiene varias complicaciones en comparación con la macro PIV. En macro PIV los datos pueden limitarse a un único plano a través de las hojas de la luz, pero en el micro iluminación volumen de escala es necesario. Iluminación de volumen es un problema mayor para la formación de imágenes de los flujos de sangre micro, como los propios glóbulos rojos son grandes en comparación con el Channels, y el uso de los glóbulos rojos como las partículas trazadoras conduce a una profundidad de correlación (DOC) que puede disminuir significativamente la exactitud de los resultados de correlación cruzada ^6,7,8. Tras Wereley et al. (1998), el DOC para un canal de 40 m de altura con RBC como trazadores es de 8,8 micras, mientras que con una partícula de 1 m trazador del DOC es de 6,7 micras. Esta diferencia se vuelve más pronunciada cuando se cambia la altura de canal y magnificación. Además, los glóbulos rojos son opacas, y el aumento de la densidad de los glóbulos rojos en el flujo provoca dificultades de formación de imágenes. Fluorescentes partículas trazadoras, utilizadas por primera vez por Santiago et al. (1998), se han defendido como una herramienta para disminuir la influencia de las partículas fuera de foco, al utilizar las partículas más pequeñas posibles. Uso de 1 m de diámetro micropartículas fluorescentes acoplado con un láser es un método que puede disminuir la profundidad de foco problema en micro imágenes de flujo de sangre ^10. Hay varias opiniones actuales del estado de μPIV technology, cada uno de los cuales se destaca la importancia de μPIV de estudios del flujo sanguíneo ^11,12. Varias consideraciones importantes deben tenerse en cuenta cuando se utiliza μPIV para la sangre. En el nivel micro, la escala de la microcirculación, la sangre no puede ser considerado como un fluido homogéneo, ya que es una suspensión de células flexibles rojas de la sangre (glóbulos rojos), grandes células blancas de la sangre, plaquetas y otras proteínas en suspensión en un fluido newtoniano (plasma) .

Los perfiles de velocidad medidos aquí se pueden utilizar para medir ciertas características de los flujos de sangre micro. Los factores importantes en microhemorheology son la velocidad de flujo de la sangre, la forma del perfil de velocidad, y la tensión de cizallamiento en la pared del vaso. Esta información tiene implicaciones clínicas, como la microcirculación es el sitio para el intercambio de nutrientes en el cuerpo, y de este intercambio es dependiente de cizalladura. Hay varios estudios de revisión en curso sobre el estado de la investigación en la microcirculación y ^13,14,15.

Se presenta aquí es un protocolo para μPIV mediciones de los flujos sanguíneos en microcanales polidimetilsiloxano (PDMS). Canales PDMS fueron fabricados en la casa después de las fuentes en la sección 1 del protocolo. Muestras de sangre de porcinos se obtuvieron a partir de un matadero autorizado y limpiar la sección 2 del protocolo siguiente. Todos los datos se obtuvieron usando el sistema de MITAS μPIV LaVision, tal como se describe en el apartado 3 del protocolo. La puesta a punto consiste en un láser Nd: YAG (New Wave Research, EE.UU.) y cámara CCD (Imagen intensa, LaVision) controlado por una unidad programable de activación, un microscopio de fluorescencia junto con una etapa de movimiento en 3 ejes, y un ordenador, además de una cámara de alta velocidad (Dalsa 1M150, Países Bajos) se añadió para la visualización de los propios glóbulos rojos. Ambas cámaras están conectadas a una caja óptica 2 puertos (Personalizado por Zeiss, Alemania). En típico en mediciones in vivo de flujo de sangre, un microscopio vertical se utiliza para realizar un seguimiento de los glóbulos rojos de lamselves, mientras que, en el típico en aplicaciones in vitro un microscopio invertido se utiliza para rastrear las partículas trazadoras. En este singular doble configuración, el cuadro de la óptica permite que ambos trazadores para obtener imágenes con el microscopio invertido. La sangre se introduce en los microchips a través de una bomba de jeringa de alta precisión (Nexus3000, Chemyx Inc., EE.UU.). Un diagrama del sistema se muestra en la Figura 1, donde la porción superior de la figura representa el 140 micras por 40 micras canales rectangulares fabricadas de PDMS, y la parte inferior representa todo el sistema, incluyendo ambas cámaras, el láser, la bomba de jeringa y el microscopio.

ΜPIV actual configuraciones disponibles, por lo general con el software propietario, incluyen TSI, Dantec Dynamics, y LaVision. Algoritmos de correlación cruzada se puede adquirir a través de numerosas opciones de software, incluyendo el MATLAB. El software no es la clave, entender lo que los cuadros de diálogo corresponden a matemáticamente servirá el usor mucho mejor. En este protocolo Davis, se utilizan software propietario de LaVision o MATLAB. El protocolo no es un software específico, pero las opciones de menú puede estar en diferentes lugares en diferentes paquetes de software.

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Protocolo

1. Microchip Fabrication

El primer paso es crear o comprar su microcanal. Hay muchas opciones para el material de microchip.

Uno de los materiales más comunes elegidos es el poli (dimetilsiloxano) (PDMS). Hay muchas publicaciones sobre direcciones para PDMS fabricación mediante litografía blanda ^16,17,18.

Una vez que el canal de PDMS se fabrica, hay varios tratamientos superficiales disponibles para invertir su hidrofobicidad natural. Tratamiento de plasma oxigenado es una opción común.

Zhou, Ellis, y Voelcker (2009) ofrecen una revisión de tratamientos superficiales y cómo afectan PDMS. Estos resultados son de agua, sin embargo, y la sangre tiene propiedades diferentes. Un estudio sobre lo que significa que el tratamiento de superficie de la sangre se ha hecho por Pitts et al. (2012a).

Para los resultados presentados aquí, superficies microchip y los portaobjetos de vidrio que eranunido a ambos fueron expuestos al plasma oxigenado durante 45 segundos y luego se pulsa junto con firmeza lo que resulta en una unión permanente.

2. Preparación Sangre

1. Recoger muestras de sangre de un centro acreditado. Por ejemplo sangre de cerdo se puede utilizar con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como un anticoagulante. Añadir 1 g de EDTA con 4 ml de agua, y luego añadir la solución a 1 L de sangre entera, mezclando suavemente 10 veces.

Al recoger muestras de sangre, deje que se enfríen lentamente a RT. Las muestras de sangre deben ser frescos, y lo ideal es utilizar el día en que se recogen para conservar las propiedades reológicas de la sangre.

Las muestras se pueden refrigerar una vez a temperatura ambiente, sin embargo, toda la sangre sin anticoagulante no se podrá utilizar después de la refrigeración. Dependiendo del anticoagulante, los glóbulos rojos pueden mantenerse refrigerados durante un máximo de 42 días, y la sangre entera pueden mantenerse refrigeradas durante 35 días, pero la contaminación sería posible en un no-minstalación edical ^21.

Además, tener cuidado con el método de recogida de muestras con las especies bovina o porcina, y evitar la contaminación por la médula ósea.

2. Centrifugar las muestras de sangre 3x a 3.000 rpm durante 10 minutos cada vez. Después de la primera centrifugación, eliminar el plasma y la capa leucocitaria, desechar. En general, es más fácil de eliminar el plasma primero, y luego descartar o mantener para uso futuro, a continuación, para eliminar la capa leucocitaria solo.

Introducir la pipeta lentamente, con el fin de no mezclar la capa leucocitaria de nuevo en la sangre. Después de la eliminación de la capa leucocitaria, añadir aproximadamente 20 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y mezclar suavemente, centrifugar. Repita el último paso. Después de la tercera centrifugación, eliminar la capa leucocitaria PBS y la restante, desechar.

También es posible utilizar el plasma nativo en lugar de PBS si desea mantener las propiedades de agregación de la sangre. Asegúrese de no mezclar cualquier capa leucocitaria o blancocélulas de la sangre en el plasma.

3. Tome las células rojas de la sangre (glóbulos rojos limpios) y suspender en PBS o plasma a concentraciones deseadas (hematocrito). Compruebe hematocritos con una microcentrífuga (CritSpin FisherSci, EE.UU.).

Sangre en 10 a 20% de hematocrito debe ser más fácil de visualizar que 40 o 50% (hematocrito fisiológica). En la microcirculación, la sangre es generalmente la mitad del hematocrito de la circulación macro, por lo que H = 20 es adecuada ^15.

4. Añadir fluorescente partículas trazadoras en la concentración deseada de las muestras de sangre. Una regla general es tener 10 partículas en una ventana de correlación, que pueden ser calculados antes de tiempo.

Por ejemplo, 30 l de partículas se añaden a 1 ml de solución de sangre para la puesta a punto representado en el vídeo. Alternativamente, los propios glóbulos rojos pueden ser etiquetados con fluorescencia.

5. Además, hacer una solución de calibración con agua y la gripeorescing partículas. Será necesario calibrar el sistema con una solución newtoniana.

Por ejemplo, cuando se utiliza un objetivo de 10X con un canal en la escala de 100 micras, una concentración adecuada es de 300 l de partículas mezcladas con 15 ml de agua destilada. Otra opción es el uso de glicerol diluido con agua destilada a una viscosidad de 3CP, que está más cerca a la viscosidad de la sangre macro.

3. μPIV Medidas

1. Seguridad del láser: Compruebe la temperatura y la humedad. Use anteojos de seguridad de laser apropiados. Cierre la cortina láser o encender la señal de láser en la puerta del laboratorio de impedir que las personas que no están protegidos de la exposición.
2. Procedimiento con el software de Davis se muestra en el video. Para más detalles consulte el manual de usuario de un sistema específico.
3. Antes de la toma de datos, debe ser calibrado usando un micrómetro de la escala de la cámara.
4. Para reducir el cumplimiento del sistema, utilice la menor cantidad de tubos de und la más pequeña jeringa rígida posible, tal como una jeringa hermética l 15 o 50 Hamilton. Para reducir las fugas de sangre o de admisión de aire en el sistema, sellar el tubo a la jeringa y para el chip. Esto se puede hacer con pegamento, PDMS o vaselina (teniendo cuidado de no contaminar la sangre).

Para llenar el micro-jeringa con agua mezclada con partículas trazadoras utilizar método de flujo de retorno ya que el volumen de la micro-jeringa es por lo general mucho menor que el volumen a llenar.

Nuestro método consiste reflujo para llenar el micro-jeringa y el canal juntos a través de la salida del canal utilizando una jeringa de plástico secundaria. Para ello, quitar primero el micro-émbolo de la jeringa, a continuación, empuje el líquido usando la jeringa de plástico clásica unida a la salida del canal, dejar que el flujo de líquido fuera de la micro-jeringa hasta que todas las microburbujas están fuera de la micro-jeringa, tubo o chips, finalmente puso el émbolo de la jeringa, y desconecte la jeringa de plástico. La presencia or ausencia de microburbujas puede ser verificada con un microscopio.

5. Nivele la bomba de jeringa para lograr tubo horizontal. Programar la bomba de jeringa a velocidad de flujo deseada.

Sea consciente de los posibles efectos transitorios, como el "efecto de cuello de botella", para el sistema rígido o el cumplimiento del sistema que modifican el caudal real. Tiempos característicos de un sistema pueden estimarse como una función de los materiales y dimensiones del sistema. (Capítulo 2, pp 77-81, Tabeling, 2005)

6. Coloque microchip en platina del microscopio y encienda la bomba. Utilice el agua con partículas para calibrar el sistema para el perfil de velocidad media y calibrar el dT (el tiempo entre imágenes pulsadas).

Las partículas deben pasar entre 5 y 10 píxeles entre los marcos para una buena correlación ^11. Al calibrar, tener cuidado de medir en el centro del canal. El plano de enfoque en el centro tiene la más altavelocidad ^8.

Si se utiliza un canal de vuelta, tenga cuidado de sombreado efectos.

Una imagen de ejemplo se muestra en la Figura 2, el uso de una cámara de impulsos, mientras que la imagen de la parte superior es el primer impulso y la imagen inferior es el segundo pulso. Se puede observar en la figura que los puntos más brillantes (partículas fluorescentes) son los más de enfoque.

7. OPCIONAL: Al tomar los datos a diferentes alturas un perfil de velocidad 3D se puede reconstruir mediante la adición de los diferentes vectores en una sola imagen. El vídeo presenta una rutina que fue desarrollado para la automatización del proceso.
8. Cuando la toma de datos con la sangre, llenar la jeringa con la cantidad deseada de la sangre en el mismo método que el agua. Programar la bomba de jeringa a la velocidad de flujo deseada, y tomar los datos deseados. Un ejemplo de imágenes en bruto obtenidos se presenta la figura 2. Tenga cuidado de RBC sedimentación también. Rellenar la jeringa cada carrera o cadaotro plazo reducirá la sedimentación de los glóbulos rojos.
9. Después de la adquisición de imágenes, la correlación cruzada se realiza en los pares de imágenes para obtener campos de vectores de velocidad entre las imágenes. Es importante tener buenas imágenes para tener una buena correlación. Antes de correlación, pre-procesamiento se puede hacer para eliminar el ruido de fondo.

Cruz correlación se realiza entre las ventanas de las imágenes adyacentes, que se pueden variar en tamaño y forma para afectar la correlación. Después de correlación cruzada, el procesamiento posterior de las imágenes se puede hacer para eliminar vectores erróneos o atípicos.

Una descripción detallada de las diferentes opciones disponibles y sus exactitudes se puede encontrar en Pitts et al. (2012b), donde se encontró la mejor procesamiento de la sangre a ser el método de "imagen superpuesta" con ventanas extiende en longitud y se alinea con el flujo . Estas operaciones se pueden realizar de forma manual en un programa como MATLAB, o dentro del paquete de software con su sistema. La software no es importante, las matemáticas detrás de las operaciones es más importante y cada operación puede afectar a la precisión del perfil de velocidad final.

Los vectores resultantes se pueden promediar en el espacio a través del canal para obtener perfiles de velocidad instantánea y, a continuación, de nuevo promediado en el tiempo para obtener una, el perfil de velocidad promedio representante. Kloosterman et al. (2011) da una explicación del error en las mediciones de μPIV donde la profundidad de campo es grande. Las discusiones sobre el error del procesamiento de datos presentado aquí se pueden encontrar en Pitts et al. (2012b) para las mediciones pulsadas y Chayer et al. (2012) para las mediciones de alta velocidad.

Los ejemplos de perfiles de velocidad se presentan en las Figuras 3 y 4. Figura 3 presenta un perfil único de velocidad para la línea central de un 10 l / h de flujo de RBC en H = 10 en un canal de 140 micras de ancho.

tienda de campaña "> Este único perfil se consigue haciendo un promedio de los vectores correlacionados a través del canal para obtener un perfil de velocidad, y luego promediado en el tiempo para obtener una medición representativa. En este caso, 100 pares fueron promediados en el tiempo a través del campo de vista.

Un ejemplo del perfil de 3D ​​reconstruida tomado por un flujo de agua de calibración en un canal cuadrado 100 micras con una velocidad de flujo programada de 30 l / h se encuentra en la Figura 4. En la Figura 4, los perfiles se midieron a intervalos de 1 m.

10. OPCIONAL: En las imágenes de alta velocidad representados set-up puede ser tomada en las mismas condiciones por las cámaras de conmutación (y los sistemas de adquisición de datos). Esto puede ser útil para la visualización de la capa libre de células en el canal, y para cuantificar la agregación. El análisis de los datos es ligeramente diferente (Chayer et al., 2012).

Ejemplos de imágenes de luz blanca con y sin agregación de RBC son preseNtEd en la Figura 5 en H = 20. Las imágenes superiores muestran H = 20 en PBS, que elimina la capacidad de los glóbulos rojos para agregar, a 1 l / hr. La imagen de fondo es H = 20 en el plasma nativo a 0,5 l / hr. En la imagen inferior, la agregación es visible.

11. Cierre el sistema de una manera segura cuando se han completado las mediciones. Siga los procedimientos adecuados de seguridad láser hasta que la fuente de energía láser se apaga por completo.

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Resultados

En todas las figuras, el flujo es de izquierda a derecha en las imágenes en bruto, y hacia arriba en perfiles de velocidad calculados. Un ejemplo de los datos sin procesar obtenidos con la sangre en el hematocrito H = 10 que fluye a 10 l / h se muestra en la Figura 2. Los datos en bruto pueden correlación cruzada sin ningún tipo de procesamiento de datos para lograr perfiles de velocidad. El impacto de los métodos de preprocesamiento y procesamiento de datos se discute por Pitts, et al., (2...

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Discusión

Usando μPIV para mediciones de flujo sanguíneo en la escala de la microcirculación puede dar una idea de un gran número de procesos de ingeniería biomédica, mecánica y química pertinentes. Algunos de los factores claves para tener en cuenta son la densidad de los propios glóbulos rojos, la agregación y la deformabilidad de los glóbulos rojos, la agregación o el movimiento de las micro partículas fluorescentes, y la sedimentación de los glóbulos rojos en los canales. Todo esto puede explicarse si se siguen...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884-100G
poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
fluorescing micro particles	Microgenics/FisherSci	R900
glycerol (OPTIONAL)	Sigma Aldrich	G6279-500 ml
microcentrifuge, i.e. CritSpin	FisherSci	22-269-291
syringe, i.e. 50 μl Gastight	Hamilton	80965
camera, i.e. Imager Intense, high speed	LaVision, Dalsa	Imager Intense
microscope, i.e. MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
syringe pump, i.e. Nexus3000	Chemyx, Inc.	Nexus-3000
flexible tubing, i.e. Tygon	FisherSci	14-169-1A
data processing software, i.e. DaVis	LaVision	DaVis
centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F