Micro-Particle Image Velocimetry für Velocity Micro Profil Messungen der Blut fließt

Zusammenfassung

Micro-Particle Image Velocimetry (μPIV) wird verwendet, um gepaart Bilder von Mikro-Partikel im Blut fließt die kreuzkorrelierten um eine genaue Geschwindigkeitsprofil geben sind ausgesät visualisieren. Schergeschwindigkeit, maximale Geschwindigkeit, Geschwindigkeit Profilform und Strömungsgeschwindigkeit, von denen jede klinische Anwendungen hat, können aus diesen Messungen abgeleitet werden.

Zusammenfassung

Micro-Particle Image Velocimetry (μPIV) wird verwendet, um gepaart Bilder von Mikro-Partikel im Blut fließt ausgesät visualisieren. Die Bilder sind kreuzkorrelierten eine genaue Geschwindigkeitsprofil geben. Ein Protokoll für μPIV Messungen von Blut fließt in Mikrokanälen dargestellt. Am Umfang der Mikrozirkulation, kann das Blut nicht als eine homogene Flüssigkeit sein, da es eine Suspension von Teilchen in flexible Plasma, einer Newtonschen Flüssigkeit suspendiert ist. Schergeschwindigkeit, maximale Geschwindigkeit, Geschwindigkeit Profilform und Durchflussmenge kann aus diesen Messungen abgeleitet werden. Mehrere wichtige Parameter wie Brennweite, Partikelkonzentration und System-Compliance, präsentiert werden, um eine genaue, nützliche Daten zusammen mit Beispielen und repräsentative Ergebnisse für verschiedene Hämatokrit-und Strömungsverhältnisse zu gewährleisten.

Einleitung

Der menschliche Körper enthält zahlreiche Gefäße mit Durchmessern von weniger als 50 um, dem wichtigsten Ort Austausch zwischen Blut und Gewebe. Die Untersuchung der Durchblutung in diesen Gefäßen stellt eine erhebliche Herausforderung dar, sowohl das Ausmaß der Messungen und die Flüssigkeit von Blut. Diese Messungen, einschließlich der Druckgradient, der Schere an der Wand, und Geschwindigkeitsprofile in Arteriolen und Venolen, sind wichtige Faktoren, die mit physiologischen Reaktionen verknüpft. Es gibt jetzt noch nie dagewesene Möglichkeiten, um diese Herausforderungen zu lösen Messung dank neuer experimenteller Techniken auf Mikroebene, um die Mikrozirkulation zu studieren und lösen dieses Problem multiscale.

Mikropartikel-Geschwindigkeitsmessung (μPIV) ein Teilchen-basierte Strömungsvisualisierung Technik, die verwendet werden, um Geschwindigkeitsprofile des Blutflusses in Mikrokanälen über Kreuzkorrelation auszuwerten. μPIV, die zuerst von Santiago et al. entwickelt wurde, hat mit Hämorheologie verwendet wordenStudien seit Sugii et al. im Jahr 2001 verwendet die Technik, um den Blutfluss in 100 um rund ^1,2 Glasröhren messen. Verschiedene Ansätze zur μPIV existieren. High-Speed-Kameras können verwendet werden, um die Bewegung von roten Blutkörperchen (Erythrozyten) zu korrelieren, und gepulste Bilder können verwendet werden, um die Bewegung von Tracer-Partikeln korrelieren. Jede dieser Optionen kann mit einer aufrechten oder umgekehrten Mikroskop eingekoppelt werden, abhängig von der Anwendung. In beiden Fällen ist das Ergebnis ein 2D Geschwindigkeitsprofil. Ein weiterer Ansatz ist, ein konfokales Mikroskop zu verwenden, um 2D-und 3D-Profile zu erreichen. Diese Methode ist, um Blut ^3,4,5 angewendet worden.

Micro Skala PIV hat mehrere Komplikationen, wenn sie mit Makro PIV verglichen. In Makro PIV können die Daten in einer einzigen Ebene durch Blätter des Lichts beschränkt ist, sondern im Mikromaßstab Volumen Beleuchtung erforderlich ist. Volume Beleuchtung ein größeres Problem für die Abbildung von Mikro Blut fließt, da die roten Blutkörperchen sich im Vergleich groß sind, um die channels und mit den RBCs als Tracer-Partikel führt zu einer Tiefe von Korrelation (DOC), die signifikant verringern kann die Genauigkeit der Kreuzkorrelation Ergebnisse ^6.7.8. Nach Wereley et al. (1998) die DOC für eine 40 um groß Kanal mit RBC als Tracer ist 8,8 um, während mit einer 1 um Tracerpartikel die DOC ist 6,7 um. Dieser Unterschied wird noch deutlicher, wenn Kanalwechsel Höhe und Vergrößerung. Zusätzlich sind RBCs opak, und die Erhöhung der Dichte der RBCs in der Strömung bewirkt Bildgebung Schwierigkeiten. Fluoreszierende Tracer-Partikel, die zuerst von Santiago et al. (1998) verwendet werden, haben als ein Werkzeug, um den Einfluss von out-of-focus Partikel verringern befürwortet worden, wenn mit den kleinsten Teilchen möglich. Mit 1 Mikrometer Durchmesser fluoreszierende Mikropartikel gekoppelt mit einem Laser ist ein Ansatz, der die Tiefenschärfe Problem in Mikro Blutfluss Bildgebung ^{10. Mai} verringern. Es gibt mehrere aktuelle Bewertungen des Zustands der μPIV technik, von denen jeder die Bedeutung der μPIV hebt, um den Blutfluss Studien ^11,12. Mehrere wichtige Aspekte müssen berücksichtigt werden, wenn μPIV für Blut. Auf der Mikro-Ebene, das Ausmaß der Mikrozirkulation, kann das Blut nicht als eine homogene Flüssigkeit sein, da es eine Suspension von flexiblen roten Blutkörperchen (Erythrozyten), große weiße Blutkörperchen, Blutplättchen und anderen Proteinen in einer Newtonschen Flüssigkeit (Plasma) suspendiert ist .

Die Geschwindigkeitsprofile gemessen hier kann verwendet werden, um bestimmte Eigenschaften der Mikro-Blut fließt zu messen. Die wichtigsten Faktoren sind in microhemorheology die Strömungsgeschwindigkeit des Blutes, die Form des Geschwindigkeitsprofils und die Scherspannung an der Wand des Gefäßes. Diese Information hat klinische Implikationen, da der Mikrozirkulation ist die Website für Stoffaustausch in den Körper, und dieser Austausch ist scherabhängige. Es gibt mehrere Studien über aktuelle Bewertung den Stand der Forschung in der Mikrozirkulation sowie ^13,14,15.

Präsentiert hier ist ein Protokoll für μPIV Messungen der Blut fließt in Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikrokanäle. PDMS-Kanälen wurden in-house nach den Quellen in Abschnitt 1 des Protokolls hergestellt. Schweine wurden Blutproben von einer akkreditierten Schlachthof erhalten und gereinigt nach § 2 des Protokolls. Alle Daten wurden unter Verwendung des LaVision MITAS μPIV System, wie in Abschnitt 3 des Protokolls beschrieben. Das Set-up besteht aus einem Nd: YAG-Laser (New Wave Research, USA) und CCD-Kamera (Bild Intensiv, LaVision) gesteuert durch einen programmierbaren Auslöseeinheit ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Bühne bewegt sich in 3 Achsen gekoppelt ist, und einem Computer, zusätzlich zu einer Hochgeschwindigkeitskamera (Dalsa 1M150, Niederlande) wurde für die Visualisierung der roten Blutkörperchen selbst aufgenommen. Beide Kameras sind mit einem 2-fach Optik-Box (Custom von Zeiss, Deutschland) verbunden. In typischen in vivo Messungen des Blutflusses, ist eine aufrechte Mikroskop zu verfolgen der Erythrozyten diemselves, während in typischen Anwendungen in vitro ein invertiertes Mikroskop wird verwendet, um den Tracer-Partikeln zu verfolgen. In diesem einzigartigen Dual-Set-up ermöglicht die Optik Box beide Tracer abzubildenden mit dem inversen Mikroskop werden. Blut wurde in den Mikrochips über eine hochpräzise Spritzenpumpe (Nexus3000, Chemyx Inc., USA) eingeführt. Ein Diagramm des Systems wird in Abbildung 1, wobei der obere Teil der Figur repräsentiert die 140 um 40 um durch rechteckige Kanäle PDMS hergestellt gezeigt, und der untere Teil stellt das gesamte System einschließlich der beiden Kameras, den Laser, der Spritzenpumpe und das Mikroskop.

Aktuelle μPIV Set-ups zur Verfügung, in der Regel mit proprietärer Software umfassen TSI, Dantec Dynamics und LaVision. Standard-Kreuz-Korrelations-Algorithmen können durch zahlreiche Software-Optionen, einschließlich der MATLAB erreicht werden. Die Software ist nicht der Schlüssel, zu verstehen, was die Dialogboxen zu mathematisch wird die Nutzung dienen entsprechenr viel besser. In diesem Protokoll DaVis werden LaVision proprietäre Software oder MATLAB eingesetzt. Das Protokoll ist nicht speziellen Software, aber die Menüoptionen könnte an verschiedenen Orten in verschiedenen Software-Pakete sein.

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Protokoll

1. Microchip Fabrication

Der erste Schritt besteht darin, zu erstellen oder kaufen Sie Ihre Mikrokanalstruktur. Es gibt viele Optionen für die Mikrochip-Material.

Eines der am häufigsten gewählten Materialien Poly (dimethylsiloxan) (PDMS). Es gibt viele Publikationen über Richtungen für PDMS Herstellung durch Softlithographie ^16,17,18.

Sobald das PDMS Kanal hergestellt ist, gibt es mehrere Oberflächenbehandlungen seiner natürlichen Hydrophobie umzukehren. Oxygenierte Plasmabehandlung ist eine weit verbreitete Möglichkeit.

Zhou, Ellis und Voelcker (2009) geben einen Überblick über Oberflächenbehandlungen und wie sie Einfluss auf PDMS. Diese Ergebnisse sind für Wasser aber, und Blut hat unterschiedliche Eigenschaften. Eine Studie über, was das bedeutet, Oberflächenbehandlung für Blut wurde von Pitts et al. (2012a) getan worden.

Für die hier vorgestellten Ergebnisse, Mikrochip Oberflächen und die Glasplatten waren siegebunden wurden sowohl Sauerstoff-Plasma für 45 Sekunden belichtet und dann fest zusammen, was zu einer dauerhaften Bindung gedrückt.

2. Blut Vorbereitung

1. Sammeln von Blutproben von einer akkreditierten Einrichtung. Zum Beispiel Schweineblut mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als Antikoagulanz verwendet werden. 1 g EDTA mit 4 ml Wasser, und fügen Sie dann die Lösung auf 1 l Vollblut, vorsichtiges Mischen 10x.

Beim Abholen Blutproben, damit sie langsam auf RT. Blutproben sollten frisch und idealerweise nutzten den Tag, sie gesammelt, um die rheologischen Eigenschaften des Blutes zu erhalten sind.

Die Proben können gekühlt werden einmal bei RT, jedoch Vollblut ohne gerinnungshemmende unbrauchbar wird nach Kühlung. Abhängig von der Antikoagulans kann RBCs gekühlt aufbewahrt für bis zu 42 Tage, und Vollblut gekühlt gehalten für 35 Tage, aber Kontamination wäre in einem nicht-m möglichedizinische Anlage ^21.

Außerdem darauf achten, der Erhebungsmethode mit Rindern oder Schweinen Proben, und keine Verunreinigungen durch Knochenmark.

2. Zentrifuge die Blutproben 3x bei 3.000 UpM für je 10 min. Nach der ersten Zentrifugation, entfernen Sie das Plasma und Buffy-Coat, verwerfen. Es ist in der Regel am einfachsten, das Plasma zunächst entfernen und dann verwerfen oder für künftige Verwendung aufbewahren, dann die Buffy-Coat allein zu entfernen.

Führen Sie die Pipette langsam, um so nicht mischen Leukozytenmanschette zurück ins Blut. Nach dem Entfernen des Buffy-Coat, fügen Sie etwa 20 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und vorsichtig mischen, zentrifugieren. Wiederholen letzten Schritt. Nach der dritten Zentrifugation, entfernen Sie die restlichen PBS und Buffy-Coat, verwerfen.

Es ist auch möglich, die nativen Plasma anstelle von PBS zu verwenden, wenn Sie die Aggregation des Blutes behalten möchten. Achten Sie darauf, sich nicht zu vermischen keine Buffy-Coat oder weißBlutzellen in das Plasma.

3. Nehmen gereinigt roten Blutkörperchen (Erythrozyten) und setzt in PBS oder Plasma bei gewünschten Konzentrationen (Hämatokrit). Überprüfen Sie mit einem Hämatokrit Mikrozentrifuge (CritSpin FisherSci, USA).

Blut bei 10 bis 20% Hämatokrit sollten leichter sichtbar als 40 oder 50% (physiologischen Hämatokrit). In der Mikrozirkulation, das Blut ist in der Regel die Hälfte der Hämatokrit des Makro-Kreislauf, so H = 20 ¹⁵ ist ausreichend.

4. In fluoreszierender Tracer-Partikel in der gewünschten Konzentration in den Blutproben. Eine allgemeine Regel ist zu 10 Teilchen in einer Korrelation Fenster, die vor der Zeit berechnet werden kann.

Beispielsweise werden 30 ul Teilchen zu 1 ml Blut Lösung für die Set-up in dem Video dargestellt worden. Alternativ können die RBCs selbst fluoreszierend markiert werden.

5. Darüber hinaus stellen Sie eine Kalibrierung mit Wasser und Grippeorescing Teilchen. Es wird notwendig sein, das System mit einer Newtonschen Lösung kalibrieren.

Wenn zum Beispiel unter Verwendung eines 10X-Objektiv mit einem Kanal in der Größenordnung von 100 um eine geeignete Konzentration 300 ul Teilchen mit 15 ml destilliertem Wasser gemischt. Eine weitere Möglichkeit ist Glycerin mit destilliertem Wasser auf eine Viskosität von 3Cp, die näher an der Makro Blut Viskosität verdünnt verwenden.

3. μPIV Messungen

1. Lasersicherheit: Prüfen Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Tragen Sie geeignete Laser-Schutzbrille. Schließen Sie die Laser-Vorhang oder schalten Sie den Laser-Schild an der Tür Labor auf den Menschen nicht davor geschützt ausgesetzt zu verhindern.
2. Verfahren mit Davis-Software ist in dem Video zu sehen. Nähere Informationen finden Sie in der Bedienungsanleitung eines bestimmten Systems.
3. Vor der Einnahme von Daten, muss die Kamera Skala kalibriert mit einem Mikrometer werden.
4. Um die Einhaltung des Systems zu reduzieren, verwenden Sie den kürzesten Schlauch eind der kleinste starren Spritze möglich, wie in 15 oder 50 ul Hamilton gasdichte Spritze. Um das Auslaufen von Blut oder Lufteinlass in das System zu reduzieren, versiegeln Sie den Schlauch auf die Spritze und auf den Chip. Dies kann mit Leim, PDMS oder Vaseline (darauf achten, daß das Blut verunreinigen) durchgeführt werden.

Um die Mikro-Spritze mit Wasser mit Tracer-Partikel geschnürt füllen verwenden Rückfluss Methode, weil das Volumen der Mikro-Spritze ist in der Regel viel kleiner als das Volumen zu füllen.

Unsere Rückfluss Verfahren besteht die Mikro-Spritze und der Kanal zusammen füllen über den Ausgang des Kanals unter Verwendung eines sekundären Kunststoffspritze. Dafür zuerst die Mikro-Kolben der Spritze, dann drücken Sie die Flüssigkeit mit der klassischen Kunststoffspritze an dem Ausgang des Kanals, lassen Sie die Flüssigkeit ausfließen der Mikro-Spritze, bis alle Mikrobläschen sind aus dem Mikro-Spritze, Schlauch oder Chip, endlich den Kolben zurück und ziehen Sie die Kunststoff-Spritze. Das Vorhandensein or Fehlen von Mikrobläschen kann mit einem Mikroskop überprüft werden.

5. Richten Sie die Spritzenpumpe auf horizontale Rohr zu erreichen. Programmieren Sie die Spritzenpumpe auf die gewünschte Durchflussmenge.

Seien Sie sich der möglichen Auswirkungen vergänglich, wie der "Flaschenhals-Effekt", für starre System oder die Einhaltung des Systems, die die tatsächliche Durchflussmenge ändern. Charakteristische Zeiten eines Systems in Abhängigkeit von den Materialien und Abmessungen des Systems bestimmt werden. (Kapitel 2, S. 77-81, Tabeling, 2005)

6. Zeigen Mikrochip auf Mikroskoptisches und starten Sie die Pumpe. Verwenden Sie das Wasser mit Partikeln, um das System in der Mitte Geschwindigkeitsprofil kalibrieren und kalibrieren dT (die Zeit zwischen gepulsten Bilder).

Die Partikel sollten zwischen 5 und 10 Pixeln zwischen den Rahmen für eine gute Korrelation ¹¹ zu bewegen. Bei der Kalibrierung, vorsichtig sein, um in der Mitte des Kanals zu messen. Der Fokus Flugzeug in der Mitte hat die höchsteGeschwindigkeit ^8.

Wenn Sie einen runden Kanal, achten Schatteneffekte.

Eine Probe wird in Bild 2 dargestellt ist, unter Verwendung eines gepulsten Kamera, während das obere Bild ist der erste Impuls und der unteren Bild ist der zweite Impuls. Es kann in der Figur, dass die hellsten Punkte (fluoreszierende Partikel) die in-Fokus sind zu sehen.

7. OPTIONAL: Durch die Daten in unterschiedlichen Höhen ein 3D Geschwindigkeitsprofil kann durch Zugabe der verschiedenen Vektoren in einem einzigen Bild rekonstruiert werden. Das Video zeigt eine Routine, die für die Automatisierung des Prozesses entwickelt.
8. Bei der Aufnahme von Daten mit dem Blut füllen Spritze mit der gewünschten Menge an Blut in dem gleichen Verfahren wie dem Wasser. Programmieren Sie die Spritzenpumpe auf die gewünschte Durchflussmenge und nehmen die gewünschten Daten. Ein Beispiel für RAW-Bilder erhaltene Abbildung 2 dargestellt. Seien Sie vorsichtig mit RBC Sedimentation sowie. Nachfüllen der Spritze jeden Lauf oder jedeandere Sicht verringert sich die Ansiedlung der RBC.
9. Nach der Übernahme von Bildern wird Kreuzkorrelation auf die Bildpaare durchgeführt, um Geschwindigkeitsvektorfelder zwischen den Bildern zu erhalten. Es ist wichtig, gute Bilder zu haben, um eine gute Korrelation aufweisen. Vor Korrelation können Pre-Processing durchgeführt, um Hintergrundgeräusche zu entfernen.

Kreuzkorrelation zwischen den Fenstern in den benachbarten Bildern, die in Form und Größe, um die Korrelation beeinflussen variiert werden kann getan. Nach Kreuzkorrelation können Bild-Nachbearbeitung getan, um fehlerhafte Vektoren oder Ausreißer zu entfernen.

Eine detaillierte Beschreibung der verschiedenen verfügbaren Optionen und deren Genauigkeiten in Pitts et al. (2012b), wo die beste Verarbeitung für Blut gefunden wurde, um die Methode der "Bild überlappen" mit Fenstern in der Länge erweitert werden und ausgerichtet mit dem Strom . Diese Vorgänge können manuell in einem Programm erfolgen wie MATLAB oder innerhalb der Software mit Ihrem System. Die Software ist nicht wichtig, ist die Mathematik hinter den Operationen immer wichtiger und jede Operation kann für die Richtigkeit der Endgeschwindigkeit Profil beeinflussen.

Die resultierenden Vektoren können im Raum über den Kanal gemittelt werden, um momentane Geschwindigkeit Profile zu erhalten, und dann gemittelt wieder in der Zeit, eine durchschnittliche, repräsentativ Geschwindigkeitsprofil zu erhalten. Kloosterman et al. (2011) eine Erklärung des Fehlers in μPIV Messungen, bei denen die Schärfentiefe groß ist. Die Diskussionen über die Fehler der Datenverarbeitung präsentiert hier in Pitts et al. (2012b) für die gepulste Messungen und Chayer et al. (2012) für die High-Speed-Messungen gefunden werden.

Beispiele Geschwindigkeitsprofile sind in den 3 und 4 dargestellt. Abbildung 3 zeigt eine einzelne Geschwindigkeitsprofil für die Mittellinie einer 10 ul / h Strom von RBC bei H = 10 in einem 140 um breiten Kanal.

Zelt "> Diese einzelnen Profils durch Mittelung der korrelierten Vektoren über den Kanal, um ein Geschwindigkeitsprofil zu erzielen, und dann im zeitlichen Mittel um eine repräsentative Messung zu erhalten. In diesem Fall 100 Paare in der Zeit über das Sichtfeld wurden gemittelt.

Ein Beispiel für die 3D rekonstruierten Profil für eine Wasser Kalibrierstromleitung in einer 100 um im Quadrat Kanal mit einem programmierten Flussrate von 30 ul / h genommen wird in Abbildung 4 gefunden. In Abbildung 4 sind die Profile bei 1 um-Intervallen gemessen.

10. OPTIONAL: In der abgebildeten Set-up mit hoher Geschwindigkeit Bilder können zu den gleichen Bedingungen durch Umschalten Kameras (und Datenerfassungssysteme) entnommen werden. Dies kann nützlich sein für die Visualisierung des zellfreien Schicht in den Kanal, und zur Quantifizierung der Aggregation. Die Analyse der Daten ist etwas anders (Chayer et al., 2012).

Beispiele von weißem Licht Bilder mit und ohne RBC Aggregation presented in Abbildung 5 bei H = 20. Die Top-Bilder zeigt H = 20 in PBS, die die Fähigkeit des RBC entfernt zu aggregieren, um 1 ul / hr. Das untere Bild ist H = 20 in nativen Plasma bei 0,5 ul / hr. Im unteren Bild ist die Aggregation sichtbar.

11. Fahren Sie das System in einer sicheren Weise, wenn Messungen abgeschlossen sind. Verwenden Sie die richtigen Laser Sicherheitsverfahren bis Laserleistung Quelle vollständig heruntergefahren ist.

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Ergebnisse

In allen Figuren wird die Strömung nach rechts in RAW-Bildern, und oben in berechneten Geschwindigkeitsprofile links. Ein Beispiel für die Rohdaten mit Blut Hämatokrit H = 10 fließt bei 10 ul / h erhalten, ist in 2 gezeigt. Raw-Daten können ohne Datenverarbeitung zu erreichen Geschwindigkeitsprofile kreuzkorreliert werden. Die Auswirkungen der Vor-und Datenverarbeitung Methoden wird durch Pitts, et al. (2012b) diskutiert. Ein Beispiel für eine resultierende Geschwindigkeit Profile Daten ?...

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Diskussion

Mit μPIV für Messungen des Blutflusses an der Skala der Mikrozirkulation können Einblick in eine große Anzahl von relevanten biomedizinischen, mechanischen und chemischen Engineering-Prozesse zu geben. Einige der wichtigsten Faktoren zu berücksichtigen sind die Dichte des RBC selbst, die Aggregation und Verformbarkeit des RBC, Aggregation oder Bewegung der fluoreszierenden Mikropartikeln, und die Ansiedlung der RBC in den Kanälen. Alle diese Faktoren können für wenn die allgemeinen Leitlinien festgelegt oben bef...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884-100G
poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
fluorescing micro particles	Microgenics/FisherSci	R900
glycerol (OPTIONAL)	Sigma Aldrich	G6279-500 ml
microcentrifuge, i.e. CritSpin	FisherSci	22-269-291
syringe, i.e. 50 μl Gastight	Hamilton	80965
camera, i.e. Imager Intense, high speed	LaVision, Dalsa	Imager Intense
microscope, i.e. MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
syringe pump, i.e. Nexus3000	Chemyx, Inc.	Nexus-3000
flexible tubing, i.e. Tygon	FisherSci	14-169-1A
data processing software, i.e. DaVis	LaVision	DaVis
centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F