Micro-particules vélocimétrie par image de profil de vitesse pour mesures de débits Micro sang

Résumé

Vélocimétrie d'image micro-particule (μPIV) est utilisé pour visualiser des images paires de micro-particules ensemencées dans des flux sanguins qui sont en corrélation croisée pour donner un profil de vitesse précise. Taux de cisaillement, de la vitesse maximale, la forme du profil de vitesse, et la vitesse d'écoulement, dont chacun a des applications cliniques, peuvent être obtenus à partir de ces mesures.

Résumé

Vélocimétrie d'image micro-particule (μPIV) est utilisé pour visualiser des images paires de micro-particules ensemencées dans des écoulements sanguins. Les images sont en corrélation croisée pour donner un profil précis de la vitesse. Un protocole est présenté pour les mesures μPIV des flux sanguins dans les microcanaux. À l'échelle de la microcirculation, le sang ne peut pas être considéré comme un fluide homogène, car il s'agit d'une suspension de particules souples suspension dans le plasma, un fluide newtonien. Taux de cisaillement, de la vitesse maximale, la forme du profil de vitesse, et la vitesse d'écoulement peut être déduit de ces mesures. Plusieurs paramètres clés tels que la profondeur focale, la concentration de particules, et de la conformité du système, sont présentés afin d'assurer, des données utiles précises avec des exemples et des résultats représentatifs des différents hématocrites et des conditions d'écoulement.

Introduction

Le corps humain contient de nombreux vaisseaux ayant un diamètre inférieur à 50 pm, qui sont le site principal d'échange entre le sang et les tissus. L'étude du débit sanguin dans ces vaisseaux représente un défi considérable en raison à la fois de l'ampleur des mesures et les propriétés des fluides de sang. Ces mesures, y compris le gradient de pression, le cisaillement à la paroi, et les profils de vitesse dans les artérioles et veinules, sont des facteurs clés liés aux réactions physiologiques. Il ya maintenant des possibilités sans précédent pour résoudre ces problèmes de mesure, grâce à de nouvelles techniques expérimentales à l'échelle micro d'étudier la microcirculation et de résoudre ce problème multi-échelle.

Vélocimétrie d'image micro-particule (μPIV) est une technique de visualisation écoulement à base de particules qui est utilisé pour évaluer les profils de vitesse du débit sanguin dans des microcanaux par l'intermédiaire de la corrélation croisée. μPIV, d'abord développé par Santiago et al., a été utilisé avec hémorhéologieétudes depuis Sugii et al., en 2001 ont utilisé la technique pour mesurer le débit sanguin dans 100 um de cuves rondes ^1,2. Différentes approches d'exister μPIV. Caméras à haute vitesse peut être utilisé pour établir une corrélation entre le mouvement de globules rouges (GR), et les images pulsées peuvent être utilisées pour établir une corrélation entre le mouvement des particules de traceur. Chacune de ces options peut être couplé avec un microscope droit ou inversé, selon l'application. Dans les deux cas, le résultat est un profil de vitesse 2D. Une autre approche consiste à utiliser un microscope confocal à obtenir des profils 2D et 3D. Cette méthode a été appliquée pour le sang ^3,4,5.

Micro échelle PIV a plusieurs complications par rapport aux macro PIV. En macro PIV les données peuvent être limités à un seul plan à travers des feuilles de lumière, mais à l'échelle du volume illumination micro est nécessaire. illumination du volume est un problème plus important pour l'imagerie des flux sanguins micro, comme les globules rouges eux-mêmes sont grandes par rapport à la channels, et en utilisant les globules rouges que les particules traçantes conduit à une profondeur de corrélation (DOC) qui peut diminuer de manière significative la précision des résultats de corrélation croisée ^6,7,8. Après Wereley et al. (1998), le DOC pour un grand canal de 40 um avec RBC comme traceurs est de 8,8 um, alors qu'avec une um 1 traceur le DOC est de 6,7 um. Cette différence s'accentue lors du changement de hauteur du canal et l'agrandissement. En outre, les globules rouges sont opaques, et l'augmentation de la densité des globules rouges dans la circulation entraîne des difficultés d'imagerie. Fluorescentes particules traçantes, d'abord utilisé par Santiago et al. (1998), ont été préconisées comme un outil pour réduire l'influence des particules out-of-focus, lorsque vous utilisez les plus petites particules possibles. Utilisation de 1 um de diamètre microparticules fluorescent couplé à un laser est une approche qui peut diminuer la profondeur de problème de mise au point en micro imagerie de débit sanguin ^10. Il ya plusieurs critiques actuelles de l'état de μPIV technology, dont chacun souligne l'importance de μPIV à des études de flux sanguin ^11,12. Plusieurs facteurs importants doivent être pris en compte lors de l'utilisation μPIV de sang. Au niveau microéconomique, l'ampleur de la microcirculation, le sang ne peut pas être considéré comme un fluide homogène, car elle est une suspension de cellules flexibles rouges du sang (globules rouges), les grands globules blancs, les plaquettes et d'autres protéines en suspension dans un fluide newtonien (plasma) .

Les profils de vitesse mesurés ici peuvent être utilisés pour mesurer certaines caractéristiques des flux sanguins micro. Les facteurs importants dans microhemorheology sont le taux d'écoulement du sang, de la forme du profil de vitesse, et la contrainte de cisaillement à la paroi de la cuve. Cette information a des implications cliniques, comme la microcirculation est le site d'échange des nutriments dans le corps, et cet échange est dépendant du cisaillement. Il existe plusieurs études d'évaluation sur l'état actuel de la recherche dans la microcirculation et ^13,14,15.

Présenté ici est un protocole de mesures μPIV des flux sanguins dans polydiméthylsiloxane (PDMS) microcanaux. Chaînes PDMS ont été fabriqués en interne après les sources de l'article 1 du protocole. Des échantillons de sang de porc ont été obtenues à partir d'un abattoir agréé et nettoyés après l'article 2 du protocole. Toutes les données ont été obtenues en utilisant le système μPIV MITAS LaVision, comme décrit dans l'article 3 du protocole. Le set-up est constitué d'un laser Nd: YAG (New Wave Research, USA) et d'une caméra CCD (image Intense, Lavision) commandé par une unité programmable de déclenchement, un microscope à fluorescence couplé avec une scène en mouvement sur 3 axes, et un ordinateur, en plus d'une caméra à haute vitesse (Dalsa 1M150, Pays-Bas) a été ajouté pour la visualisation des globules rouges eux-mêmes. Les deux caméras sont reliées à un boîtier optique 2 ports (personnalisée par Zeiss, Allemagne). Dans typique des mesures in vivo de la circulation sanguine, un microscope droit est utilisé pour suivre les globules rouges dumselves, tandis que dans typique des applications in vitro d'un microscope inversé est utilisé pour suivre les particules traçantes. Dans cette unique à double set-up, la boîte optique permet à la fois traceurs à imager en utilisant le microscope inversé. Le sang a été introduit dans les puces via une pompe seringue à haute précision (Nexus3000, Chemyx Inc., USA). Un schéma du système est illustré à la figure 1, où la partie supérieure de la figure représente le 140 um par 40 um canaux rectangulaires fabriquées de PDMS, et la partie inférieure représente l'ensemble du système, y compris les deux appareils, le laser, la pompe de la seringue et le microscope.

ΜPIV actuel set-up disponibles, généralement avec les logiciels propriétaires, comprendre STI, Dantec Dynamics, et LaVision. Algorithmes de corrélation croisée standard peuvent être atteints grâce à de nombreuses options de logiciels, y compris le MATLAB. Le logiciel n'est pas la clé, la compréhension de ce que les boîtes de dialogue correspondent à la volonté de servir mathématiquement l'utilisationr beaucoup mieux. Dans ce protocole Davis, logiciel propriétaire ou MATLAB de LaVision sont utilisés. Le protocole n'est pas un logiciel spécifique, mais les options de menu peut-être à des endroits différents dans différents progiciels.

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Protocole

1. Microchip Fabrication

La première étape consiste à créer ou acheter votre microcanaux. Il ya plusieurs options pour le matériel puce.

L'un des matériaux les plus couramment choisie est poly (diméthyl) (PDMS). Il existe de nombreuses publications sur les orientations pour PDMS fabrication par lithographie douce ^16,17,18.

Une fois le canal PDMS est fabriqué, il existe plusieurs traitements de surface disponibles pour renverser son hydrophobie naturelle. Traitement de plasma oxygéné est une option courante.

Zhou, Ellis, et Voelcker (2009) donnent un avis sur les traitements de surface et comment ils affectent PDMS. Ces résultats sont toutefois pour l'eau, et le sang a des propriétés différentes. Une étude sur ce qui signifie que le traitement de surface de sang a été faite par Pitts et al. (2012a).

Pour les résultats présentés ici, les surfaces puce et les lames de verre, ils étaientlié à la fois ont été exposés à plasma oxygéné pendant 45 secondes, puis pressées fermement résultant en une liaison permanente.

2. Préparation de sang

1. Prélever des échantillons de sang provenant d'une installation accréditée. Par exemple le sang de porc peut être utilisé avec de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) comme anticoagulant. Ajouter 1 g EDTA avec 4 ml d'eau, puis ajouter la solution à 1 L de sang total, en mélangeant doucement 10x.

Pour ramasser des échantillons de sang, laissez-les refroidir lentement à température ambiante. Les échantillons sanguins doivent être frais, et idéalement utilisé le jour où elles sont collectées afin de conserver les propriétés rhéologiques du sang.

Les échantillons peuvent être réfrigérés une fois à température ambiante, mais le sang entier sans anticoagulant sera inutilisable après réfrigération. Selon l'anticoagulant, globules rouges peuvent être conservés au réfrigérateur pendant 42 jours, et le sang total peut être conservé au réfrigérateur pendant 35 jours, mais la contamination serait possible dans un non-minstallation édicale ^21.

De plus, soyez vigilant sur la méthode de collecte des échantillons bovine ou porcine, et d'éviter la contamination par la moelle osseuse.

2. Centrifuger les échantillons de sang 3x à 3000 rpm pendant 10 minutes à chaque fois. Après la première centrifugation, retirer le plasma et la couche leucocytaire, jetez-le. Il est généralement plus facile de retirer le plasma d'abord, puis les jeter ou les conserver pour un usage ultérieur, puis de retirer la couche leuco-plaquettaire seul.

Introduire la pipette lentement, afin de ne pas mélanger la couche leuco-plaquettaire nouveau dans le sang. Après avoir enlevé la couche leuco-plaquettaire, ajouter environ 20 ml de tampon phosphate salin (PBS) et mélanger doucement, recentrifuger. Répétez l'étape précédente. Après la troisième centrifugation, retirer la couche leuco-plaquettaire et PBS restant, jetez-le.

Il est également possible d'utiliser le plasma natif au lieu de PBS si vous souhaitez conserver les propriétés d'agrégation du sang. Assurez-vous de ne pas mélanger toute couche leuco-plaquettaire ou blanccellules sanguines dans le plasma.

3. Prendre des globules rouges (hématies nettoyées) et suspendre dans PBS ou de plasma à des concentrations souhaitées (hématocrite). Vérifiez hématocrites avec une micro (CritSpin FisherSci, USA).

Le sang de 10 à 20% d'hématocrite devrait être plus facile à visualiser que 40 ou 50% (hématocrite physiologique). Dans la microcirculation, le sang est généralement la moitié de l'hématocrite de la circulation macro, si H = 20 est suffisant ^15.

4. Ajouter fluorescence des particules de traceur à la concentration souhaitée pour les échantillons de sang. Une règle générale est d'avoir 10 particules dans une fenêtre de corrélation, qui peuvent être calculées à l'avance.

Par exemple, 30 pl de particules sont ajoutés à 1 ml de solution de sang pour le set-up représenté dans la vidéo. Alternativement, les globules rouges eux-mêmes pourraient être marquées par fluorescence.

5. En outre, préparer une solution d'étalonnage avec de l'eau et de la grippeorescing particules. Il sera nécessaire de calibrer le système avec une solution newtonienne.

Par exemple, lorsque vous utilisez un objectif 10X avec un canal à l'échelle de 100 um, une concentration appropriée est de 300 pi de particules mélangées avec 15 ml d'eau distillée. Une autre option est d'utiliser le glycérol dilué avec de l'eau distillée à une viscosité de 3Cp, qui est plus proche de macro de la viscosité du sang.

3. μPIV mesures

1. Sécurité laser: Vérifier la température et de l'humidité. Portez des lunettes de sécurité laser appropriés. Fermez le rideau de laser ou d'allumer le signe du laser sur la porte du laboratoire à empêcher les personnes non protégées contre toute exposition.
2. Procédure avec le logiciel Davis est montré dans la vidéo. Pour plus de détails reportez-vous au manuel d'utilisation d'un système spécifique.
3. Avant de prendre des données, l'échelle de l'appareil doit être calibré à l'aide d'un micromètre.
4. Pour réduire la conformité de l'installation, utiliser le court laps de tubes d'und le plus petit de seringue rigide possible, comme un ul Hamilton Gastight seringue 15 ou 50. Pour réduire les fuites de sang ou d'admission d'air dans le système, sceller le tube de la seringue et à la puce. Cela peut être fait avec de la colle, PDMS ou de la vaseline (en faisant attention de ne pas contaminer le sang).

Pour remplir la micro-seringue avec de l'eau lacé avec des particules traçantes utiliser la méthode de reflux parce que le volume de la micro-seringue est généralement beaucoup plus faible que le volume à remplir.

Notre procédé de reflux consiste à remplir le micro-seringue et le canal ainsi que par l'intermédiaire de la sortie du canal à l'aide d'une seringue en matière plastique secondaire. Pour cela, retirez d'abord le micro-piston de la seringue, puis pousser le liquide en utilisant la seringue en plastique classique fixé à la sortie du canal, laisser couler de liquide sur la micro-seringue jusqu'à ce que tous les microbulles sont hors de la micro-seringue, tube ou puce, a finalement mis sur le piston, et débranchez la seringue en plastique. La présence or absence de microbulles peut être vérifiée avec un microscope.

5. Niveler le pousse-seringue pour atteindre tube horizontal. Programmer la pompe à seringue à débit souhaité.

Soyez conscient des effets transitoires possibles, comme l'effet «goulot d'étranglement», pour le système rigide ou la conformité du système qui modifient le débit réel. Temps caractéristiques d'un système peuvent être évalués en fonction des matériaux et des dimensions du système. (Chapitre 2, pp 77-81, Tabeling, 2005)

6. Placez puce sur la platine du microscope et de démarrer la pompe. Utiliser l'eau avec des particules d'étalonner le système pour le profil de vitesse du milieu et calibrer le dT (le temps entre les images pulsées).

Les particules doivent passer entre 5 et 10 pixels entre les images pour une bonne corrélation ^11. Lors de l'étalonnage, veillez à mesurer dans le milieu du chenal. Le plan de mise au point au milieu a le plus hautvitesse ^8.

Si vous utilisez un canal tour, soyez vigilant sur les effets d'ombre.

A l'image de l'échantillon est illustré à la figure 2, en utilisant un appareil à impulsions, alors que l'image supérieure est la première impulsion et de l'image de fond est la seconde impulsion. On peut voir sur la figure que les points les plus clairs (fluorescence des particules) sont les plus in-focus.

7. OPTION: En prenant des données à différentes hauteurs un profil de vitesse 3D peut être reconstruit en additionnant les différents vecteurs en une seule image. La vidéo présente une routine qui a été développé pour l'automatisation du processus.
8. Lors de la prise de données avec le sang, remplir la seringue avec la quantité désirée de sang dans la même méthode que celle de l'eau. Programmer la pompe à seringue pour le débit souhaité, et de prendre les données souhaitées. Un exemple d'images brutes obtenues est présenté Figure 2. Soyez prudent de sédimentation RBC ainsi. Remplissage de la seringue chaque course ou chaqueautre terme permettra de réduire le tassement de la RBC.
9. Après l'acquisition d'images, une corrélation croisée est effectuée sur les paires d'images pour obtenir des champs de vecteurs de vitesse entre les images. Il est important d'avoir de bonnes images pour avoir une bonne corrélation. Avant de corrélation, de pré-traitement peut être fait pour éliminer le bruit de fond.

Corrélation croisée est effectuée entre les fenêtres dans les images adjacentes, qui peuvent varier en taille et en forme pour affecter la corrélation. Après corrélation croisée, le post-traitement de l'image peut être fait pour éliminer les vecteurs ou aberrantes erronées.

Une description détaillée des différentes options disponibles et leurs précisions peuvent être trouvées dans Pitts et al. (2012b), où le meilleur traitement pour le sang a été trouvé à être la méthode de «l'image de chevauchement" avec des fenêtres étendu en longueur et aligné avec le flux . Ces opérations peuvent être effectuées manuellement dans un programme comme MATLAB, ou dans le logiciel avec votre système. Le logiciel n'est pas important, les maths derrière les opérations est plus important et chaque opération peut affecter la précision du profil de vitesse finale.

Les vecteurs ainsi obtenus peuvent être en moyenne dans l'espace, à travers le canal d'obtenir des profils de vitesse instantanée, et ensuite à nouveau en moyenne dans le temps pour obtenir un profil de vitesse moyenne représentative. Kloosterman et al. (2011) donnent une explication de l'erreur dans les mesures μPIV où la profondeur de champ est grande. Les discussions sur l'erreur du traitement des données présentées ici peuvent être trouvés dans Pitts et al. (2012b) pour les mesures pulsées et Chayer et al. (2012) pour les mesures à haute vitesse.

Des exemples de profils de vitesse sont présentés dans les figures 3 et 4. Figure 3 présente un profil de vitesse unique pour l'axe d'un ul / h de débit de RBC 10 à H = 10 dans un large canal 140 um.

tente "> Ce profil unique est obtenue en faisant la moyenne des vecteurs corrélés à travers le canal pour obtenir un profil de vitesse, puis en moyenne dans le temps pour obtenir une mesure représentative. Dans ce cas, 100 paires ont été moyennées dans le temps à travers le champ de vision.

Un exemple de profil 3D reconstruite pris pour un débit d'étalonnage de l'eau dans un canal carré de 100 um avec un débit programmé de 30 pl / h se trouve dans la figure 4. Dans la figure 4, les profils sont évalués à intervalles de 1 um.

10. Facultatif: Dans les images à haute vitesse représentés set-up peut être pris dans les mêmes conditions par les caméras de commutation (et les systèmes d'acquisition de données). Cela peut être utile pour visualiser la couche acellulaire dans le canal, et pour quantifier l'agrégation. L'analyse des données est légèrement différente (Chayer et al., 2012).

Exemples d'images lumineuses blanches avec et sans RBC agrégation sont presented à la figure 5 à H = 20. Les images du haut montre H = 20 dans PBS, qui supprime la capacité de la RBC au total, au 1 pl / h. L'image du bas est H = 20 dans le plasma natif à 0,5 pi / h. A l'image de fond, l'agrégation est visible.

11. Arrêtez le système d'une manière sécuritaire lorsque les mesures ont été effectuées. Utilisez les procédures appropriées de sécurité laser jusqu'à ce que la source de la puissance du laser est complètement éteint.

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Résultats

Dans toutes les figures, le débit est de gauche à droite dans les images brutes, et vers le haut dans les profils de vitesse calculée. Un exemple des données brutes obtenues avec du sang à hématocrite H = 10 circulant à 10 l / h est montré à la figure 2. Les données brutes peuvent être en corrélation croisée sans aucun traitement de données pour réaliser des profils de vitesse. L'impact des méthodes de pré-traitement et le traitement des données est discuté par Pitts, et al.,<...

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Discussion

Utiliser μPIV pour les mesures de débit sanguin à l'échelle de la microcirculation peut donner un aperçu d'un grand nombre de processus d'ingénierie biomédicale, mécaniques et chimiques pertinents. Certains des facteurs clés pour tenir compte de la densité sont de la RBC eux-mêmes, l'agrégation et la déformabilité de la RBC, l'agrégation ou le mouvement des micro-particules fluorescentes, et le règlement de la RBC dans les canaux. Tous ces éléments peuvent être comptabilisées si l...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884-100G
poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
fluorescing micro particles	Microgenics/FisherSci	R900
glycerol (OPTIONAL)	Sigma Aldrich	G6279-500 ml
microcentrifuge, i.e. CritSpin	FisherSci	22-269-291
syringe, i.e. 50 μl Gastight	Hamilton	80965
camera, i.e. Imager Intense, high speed	LaVision, Dalsa	Imager Intense
microscope, i.e. MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
syringe pump, i.e. Nexus3000	Chemyx, Inc.	Nexus-3000
flexible tubing, i.e. Tygon	FisherSci	14-169-1A
data processing software, i.e. DaVis	LaVision	DaVis
centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F