Micro-partículas Velocimetry Imagem para a velocidade Medidas de fluxos de sangue Micro Perfil

Resumo

Velocimetria de imagem de micro-partículas (μPIV) é utilizado para visualizar as imagens de micro partículas emparelhadas semeadas nos fluxos de sangue que são interligado para dar um perfil da velocidade precisa. Taxa de cisalhamento, a velocidade máxima, a forma do perfil de velocidade e taxa de fluxo, cada uma das quais tem aplicações clínicas, podem ser derivadas a partir destas medições.

Resumo

Velocimetria de imagem de micro-partículas (μPIV) é usado para visualizar imagens pareadas de micro partículas semeadas nos fluxos sanguíneos. As imagens são interligado para dar um perfil de velocidade precisa. Um protocolo é apresentada para medições μPIV dos fluxos sanguíneos em microcanais. Na escala da microcirculação, o sangue não pode ser considerado como um fluido homogéneo, uma vez que é uma suspensão de partículas flexíveis suspensas no plasma, um fluido newtoniano. Taxa de cisalhamento, a velocidade máxima, a forma do perfil de velocidade e taxa de fluxo pode ser obtida a partir destas medições. Vários parâmetros de chave, tais como a profundidade de foco, a concentração de partículas, e a compatibilidade do sistema, são apresentados a fim de assegurar, dados úteis precisos, juntamente com exemplos e resultados representativos para vários hematócritos e as condições de escoamento.

Introdução

O corpo humano contém numerosos vasos com diâmetro inferior a 50 um, que são o principal local de permuta entre o sangue e tecidos. O estudo do fluxo de sangue nesses vasos representa um desafio considerável, devido tanto à escala das medições e as propriedades dos fluidos de sangue. Estas medições, incluindo o gradiente de pressão, o corte na parede e perfis de velocidade nas arteríolas e vénulas, são factores principais relacionados com as respostas fisiológicas. Há agora oportunidades sem precedentes para resolver esses desafios de medição, graças às novas técnicas experimentais no micro escala para estudar a microcirculação e resolver este problema multiescala.

Velocimetria de imagem de micro-partículas (μPIV) é uma técnica de visualização de fluxo baseado em partículas, que é utilizado para avaliar perfis de velocidade de fluxo sanguíneo em microcanais por meio de correlação cruzada. μPIV, desenvolvido pela primeira vez por Santiago et al., tem sido utilizado com hemorreologiaestudos desde Sugii et al., em 2001, utilizou a técnica para medir o fluxo de sangue em 100 mM tubos de vidro redondo ^1,2. Diferentes abordagens para existir μPIV. Câmaras de alta velocidade pode ser utilizado para relacionar o movimento das células vermelhas do sangue (RBC), e as imagens por impulsos pode ser utilizado para relacionar o movimento das partículas de marcadores. Qualquer destas opções podem ser acoplados com um microscópio vertical ou invertida, dependendo da aplicação. Em ambos os casos, o resultado é um perfil de velocidade 2D. Outra abordagem é a utilização de um microscópio confocal para atingir perfis 2D e 3D. Este método tem sido aplicado para o sangue ^3,4,5.

Micro escala PIV tem várias complicações, quando comparado com macro PIV. Em macro PIV os dados podem ser limitados a um único plano de luz através das folhas, mas a iluminação de volume micro escala é necessário. Volume de iluminação é um problema maior para a imagiologia de micro fluxos sanguíneos, como os próprios GVs são grandes em comparação com o channels, e utilizando os glóbulos vermelhos como os marcadores partículas conduz a uma profundidade de correlação (DOC), o que pode diminuir significativamente o rigor dos resultados de correlação cruzada de ^6,7,8. Após Wereley et ai. (1998), o DOC para um canal de altura com 40 um RBC como marcadores é de 8,8 mM, enquanto que com um traçador de partícula de 1 um a DOC é de 6,7 mM. Esta diferença torna-se mais pronunciado quando se muda a altura do canal e ampliação. Além disso, os glóbulos vermelhos são opacas, e aumentando a densidade dos GVs no fluxo provoca dificuldades de imagem. Traçadores fluorescentes partículas, utilizadas pela primeira vez por Santiago et al. (1998), têm sido defendidos como uma ferramenta para diminuir a influência de partículas fora do foco, quando usando as partículas mais pequenas possíveis. Utilização de 1 um de diâmetro micropartículas fluorescência acoplado com um laser é uma abordagem que pode diminuir a profundidade de foco no problema de micro imagiologia fluxo sanguíneo ^10. Existem várias opiniões atuais do estado de μPIV technology, cada um dos quais destaca a importância da μPIV para estudos de fluxo de sangue ^11,12. Várias considerações importantes devem ser tidas em conta quando se utiliza μPIV de sangue. No nível micro, a escala da microcirculação, o sangue não pode ser considerado como um fluido homogéneo, uma vez que é uma suspensão de células flexíveis vermelhas do sangue (eritrócitos), as grandes células brancas do sangue, plaquetas e outras proteínas suspensas num fluido newtoniano (plasma) .

Os perfis de velocidade medidos aqui pode ser utilizado para medir certas características das micro-circulações sanguíneas. Os factores importantes na microhemorheology são a taxa de fluxo do sangue, a forma do perfil de velocidade, e a tensão de cisalhamento na parede do recipiente. Esta informação tem implicações clínicas, tal como a microcirculação é o local para a troca de nutrientes no corpo, e esta troca é dependente do cisalhamento. Existem vários estudos de revisão atuais sobre o estado da investigação na microcirculação, bem ^13,14,15.

Apresentado aqui é um protocolo para medições μPIV dos fluxos sanguíneos em polidimetilsiloxano (PDMS) microcanais. Canais de PDMS foram fabricados em casa seguindo as fontes na seção 1 do protocolo. Amostras de sangue de suínos foram obtidos a partir de um matadouro credenciado e limpos seguindo seção 2 do protocolo. Todos os dados foram obtidos usando o sistema MITAS μPIV LaVision, conforme descrito na seção 3 do protocolo. A montagem é composto por um laser Nd: YAG (New Wave Research, EUA) e câmara CCD (imagem intensa, Lavision), controlada por uma unidade programável de disparo, um microscópio de fluorescência acoplado a um estágio movendo-se em três eixos, e um computador, para além de uma câmara de alta velocidade (Dalsa 1M150, Holanda) foi adicionado para a visualização dos próprios eritrócitos. Ambas as câmeras são conectadas a uma caixa de ótica 2 portas (Custom por Zeiss, Alemanha). Em típico medidas in vivo do fluxo de sangue, um microscópio vertical é usado para rastrear as hemácias domselves, enquanto que, na típica aplicações in vitro um microscópio invertido é usado para controlar as partículas de marcadores. Neste única dupla set-up, a caixa de óptica permite que ambos os traçadores de ser fotografada usando um microscópio invertido. O sangue foi introduzido nos microchips através de uma bomba de seringa de alta precisão (Nexus3000, Chemyx Inc., EUA). Um diagrama do sistema é mostrada na Figura 1, onde a parte de cima da figura representa a 140 mM por 40 mM canais rectangulares fabricadas de PDMS, e a porção inferior representa todo o sistema, incluindo ambas as câmaras, o laser, a bomba de seringa e do microscópio.

ΜPIV atual set-ups disponíveis, geralmente com software proprietário, incluem TSI, Dantec Dynamics, e LaVision. Algoritmos de correlação cruzada standard pode ser conseguido através de numerosas opções de software, incluindo o MATLAB. O software não é a chave, a compreensão de que as caixas de diálogo correspondem matematicamente servirá o usor muito melhor. Neste protocolo Davis, software proprietário da LaVision ou MATLAB são utilizados. O protocolo não é um software específico, mas as opções do menu pode estar em lugares diferentes, em diferentes pacotes de software.

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Protocolo

1. Microchip Fabrication

O primeiro passo é criar ou comprar o seu microcanais. Há muitas opções de material de microchip.

Um dos materiais mais comuns escolhidos é o poli (dimetilsiloxano) (PDMS). Existem muitas publicações sobre as indicações para PDMS fabricação através de litografia suave ^16,17,18.

Uma vez que o canal de PDMS é fabricado, há vários tratamentos de superfície disponível para inverter a sua hidrofobicidade natural. Tratamento com plasma oxigenado é uma opção comum.

Zhou, Ellis, e Voelcker (2009) dar uma revisão de tratamentos de superfície e como eles afetam PDMS. Estes resultados são no entanto para a água, e o sangue tem propriedades diferentes. Um estudo sobre o que significa que o tratamento de superfície para o sangue foi feito através de Pitts et al. (2012a).

Para que os resultados aqui apresentados, as superfícies microchip e as lâminas de vidro que eramligado a ambos foram expostas ao plasma oxigenada durante 45 segundos e, em seguida, pressionado firmemente em conjunto, resultando numa ligação permanente.

2. Preparação de Sangue

1. Coletar amostras de sangue de uma unidade credenciada. Por exemplo, o sangue de suíno pode ser utilizado com o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) como anticoagulante. Adicionar 1 g de EDTA, com 4 ml de água, e, em seguida, adicionar a solução a 1 litro de sangue completo, misturando suavemente 10x.

Ao escolher-se amostras de sangue, eles permitem a arrefecer lentamente até à temperatura ambiente. As amostras de sangue devem ser frescos e, de preferência usado no dia em que são recolhidas para conservar as propriedades reológicas do sangue.

As amostras podem ser conservadas sob refrigeração à temperatura ambiente, uma vez, no entanto sangue total sem anticoagulante será inutilizado após refrigeração. Dependendo do anticoagulante, GVs pode ser mantido refrigerado durante até 42 dias, e de sangue total pode ser mantido refrigerado durante 35 dias, mas seria possível contaminação de uma forma não-mfacilidade edical ^21.

Além disso, tenha cuidado com o método de coleta de amostras de bovinos ou suínos, e evitar a contaminação pela medula óssea.

2. Centrifugar as amostras de sangue de 3x a 3.000 rpm durante 10 min de cada vez. Depois da primeira centrifugação, remover o plasma e crosta inflamatória, descarte. Geralmente, é mais fácil de remover o plasma em primeiro lugar, e, em seguida, descartar ou guardar para uso futuro, em seguida, para remover a cobertura amarelada sozinho.

Introduzir a pipeta lentamente, de modo a não misturar o creme leucocitário volta para a corrente sanguínea. Após a remoção da cobertura amarelada, adicionar cerca de 20 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e misturar suavemente, recentrifuge. Repita o último passo. Após a terceira centrifugação, remover a crosta inflamatória PBS e restante, descarte.

Também é possível utilizar o plasma nativo em vez de PBS se deseja manter as propriedades de agregação do sangue. Certifique-se de não misturar qualquer buffy coat ou brancocélulas do sangue para o plasma.

3. Aqui as células vermelhas do sangue (RBC limpos) e suspender em PBS ou plasma em concentrações desejadas (hematócrito). Verificar com hematócritos numa microcentrífuga (CritSpin FisherSci, EUA).

Sangue em 10 a 20% de hematócrito deve ser mais fácil de visualizar do que 40 ou 50% (hematócrito fisiológica). Na microcirculação, o sangue é geralmente metade do hematócrito da circulação macro, para H = 20 é adequada ^15.

4. Adicionar partículas traçadores fluorescentes para a concentração desejada para as amostras de sangue. A regra geral é que 10 partículas em uma janela de correlação, que podem ser calculados antes da hora.

Por exemplo, 30 ul de partículas são adicionados a 1 ml de solução de sangue para a configuração descrita no vídeo. Alternativamente, as próprias GVs podem ser marcadas por fluorescência.

5. Além disso, faça uma solução de calibração com água e gripeorescing partículas. É necessário calibrar o sistema, com uma solução newtoniano.

Por exemplo, quando se utiliza uma objectiva 10X com um canal na escala de 100 mm, uma concentração adequada é de 300 ul de partículas misturadas com 15 ml de água destilada. Uma outra opção é utilizar o glicerol diluída com água destilada para uma viscosidade de 3CP, que está mais próxima à viscosidade do sangue macro.

3. μPIV Medidas

1. De segurança do laser: Verifique a temperatura e umidade. Use óculos de segurança apropriados a laser. Feche a cortina do laser ou ligar o sinal de laser na porta do laboratório para evitar que pessoas que não estão protegidas de serem expostos.
2. Processo de software de Davis é mostrado no vídeo. Para mais detalhes, consulte o manual do usuário de um sistema específico.
3. Antes de levar os dados, a escala de câmera precisa ser calibrado utilizando um micrômetro.
4. Para reduzir a conformidade do sistema, use o mais curto espaço de uma tubulaçãod a seringa mais pequena possível rígida, tal como uma pi Hamilton Gastight seringa de 15 ou 50. Para reduzir a perda de sangue ou de admissão de ar para o sistema, para selar o tubo da seringa e para o chip. Isto pode ser feito com a cola, ou vaselina PDMS (sendo cuidadoso para não contaminar o sangue).

Para preencher o micro-seringa com água misturada com partículas de usar o método de traçador de refluxo visto que o volume da micro-seringa é geralmente muito mais pequeno do que o volume a preencher.

O método consiste refluxo para encher a seringa e micro-canal em conjunto através da saída do canal, utilizando uma seringa de plástico secundário. Para isso, em primeiro lugar remover o micro-êmbolo de seringa, em seguida, apertar o líquido utilizando a seringa clássica ligado à saída do canal, que o fluxo de líquido para fora da micro-seringa até que todas as microbolhas estão fora da micro-seringa ou tubagem chips, finalmente, colocar o êmbolo para trás, e desconecte a seringa de plástico. A presença or ausência de microbolhas pode ser verificado com um microscópio.

5. Nivelar a bomba de seringa para atingir tubagem horizontal. Programar a bomba de seringa a taxa de fluxo desejada.

Estar ciente dos possíveis efeitos transitórios, como o "efeito gargalo", para o sistema rígido ou a conformidade do sistema que modifique o fluxo real. Tempos característicos de um sistema pode ser estimado como função dos materiais e as dimensões do sistema. (Capítulo 2, pp 77-81, Tabeling, 2005)

6. Coloque microchip no palco microscópio e ligar a bomba. Utilizar a água com partículas para calibrar o sistema para o perfil de velocidade média e calibrar o dT (o tempo entre as imagens pulsadas).

As partículas devem mover-se entre 5 e 10 pixels entre os quadros para uma boa correlação ^11. Ao calibrar, ter o cuidado de medir no meio do canal. O plano de foco no meio tem a maiorvelocidade ^8.

Se estiver usando um canal de volta, tome cuidado com os efeitos de sombreamento.

Uma imagem da amostra é mostrado na Figura 2, usando uma câmara de impulsos, enquanto que a parte superior da imagem é o primeiro impulso e a imagem de fundo é o segundo impulso. Pode ser visto na figura, que os pontos brilhantes (partículas fluorescentes) são os mais em foco.

7. OPCIONAL: Tomando os dados a diferentes alturas de um perfil de velocidade em 3D pode ser reconstituída por adição dos diferentes vectores para uma única imagem. O vídeo apresenta uma rotina que foi desenvolvido para a automatização do processo.
8. Quando a tomada de dados com o sangue, encher a seringa com a quantidade desejada de sangue com o mesmo método como a água. Programar a bomba de seringa para a taxa de fluxo desejada, e levar os dados desejados. Um exemplo de imagens em bruto obtidos são apresentadas na Figura 2. Tenha cuidado com RBC sedimentação bem. Recarregando a seringa cada corrida ou a cadaoutro prazo, irá reduzir a resolução da RBC.
9. Após a obtenção de imagens, a correlação cruzada é executada nos pares de imagem para obter campos vector de velocidade entre as imagens. É importante ter boas imagens para ter uma boa correlação. Antes de correlacionar, pré-processamento pode ser feito para eliminar o ruído de fundo.

Correlação cruzada é feito entre as janelas nas imagens adjacentes, que podem ser variadas em tamanho e forma a afectar a correlação. Depois de correlação cruzada, pós-processamento de imagem pode ser feito para eliminar vetores errôneos ou outliers.

Uma descrição detalhada das diversas opções disponíveis e os seus precisões podem ser encontrados em Pitts et al. (2012b), onde o melhor tratamento para o sangue foi considerado o método de "imagem de sobreposição" com janelas estendido em comprimento e alinhada com o fluxo . Estas operações podem ser feitas manualmente em um programa como o MATLAB, ou dentro do pacote de software com seu sistema. O software não é importante, a matemática por trás das operações é mais importante e cada operação pode afectar a precisão do perfil final velocidade.

Os vectores resultantes podem ser calculadas no espaço entre o canal para obter perfis de velocidade instantânea e, em seguida, novamente a média no tempo para obter, de um perfil de velocidade média representativa. Kloosterman et ai. (2011) dão uma explicação do erro nas medições μPIV onde a profundidade de campo é grande. As discussões sobre o erro de processamento de dados aqui apresentado pode ser encontrada na Pitts et al. (2012b) para as medições pulsadas e Chayer et al. (2012) para as medições de alta velocidade.

Exemplos de perfis de velocidade são apresentados nas Figuras 3 e 4. Figura 3 apresenta-se um único perfil de velocidade para a linha central de uma 10 ul / h de fluxo de RBC em H = 10 em um canal de largura de 140 um.

tenda "> O perfil único é alcançada pela média dos vectores correlacionados através do canal para obter um perfil de velocidade, e então a média no tempo para obter uma medida representativa. Neste caso, 100 pares foram, em média, o tempo em todo o campo de vista.

Um exemplo do perfil de reconstrução 3D feita por um fluxo de água de calibração num canal 100 um quadrado, com uma taxa de fluxo programado, de 30 uL / hr é encontrado na Figura 4. Na Figura 4, os perfis são medidos em intervalos de 1 uM.

10. OPCIONAL: Nas imagens de alta velocidade descritos set-up podem ser tomadas nas mesmas condições por câmeras de comutação (e sistemas de aquisição de dados). Isto pode ser útil para a visualização da camada livre de células no canal, e para quantificar a agregação. A análise dos dados é ligeiramente diferente (Chayer et ai., 2012).

Exemplos de imagens de luz branca com e sem agregação de RBC são presented na Figura 5 em H = 20. As imagens superiores mostram H = 20 em PBS, que remove a capacidade do agregado para o RBC, a 1 mL / hr. A imagem de fundo é H = 20 em plasma nativa em 0,5 mL / hr. Na imagem inferior, a agregação é visível.

11. Desligue o sistema de uma forma segura, quando as medições foram concluídos. Use procedimentos adequados de segurança do laser até fonte de energia do laser é completamente desligado.

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Resultados

Em todas as figuras, o fluxo é da esquerda para a direita nas imagens em bruto, de baixo para cima e de perfis de velocidade calculados. Um exemplo dos dados em bruto obtidos com sangue de hematócrito H = 10, com um caudal de 10 ml / h é mostrado na Figura 2. Os dados brutos podem ser interligado, sem qualquer processamento de dados para obter perfis de velocidade. O impacto dos métodos de pré-tratamento e de processamento de dados é discutida por Pitts et al., (2012b). Um exemplo de um p...

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Discussão

Usando μPIV para medições de fluxo de sangue na escala da microcirculação pode dar insights sobre um grande número de processos de engenharia biomédica, mecânica e química relevantes. Alguns dos principais fatores para contabilizar são a densidade da RBC-se, a agregação e deformabilidade do RBC, agregação ou movimento das micro partículas fluorescentes, ea fixação da RBC nos canais. Todos estes podem ser explicados se as orientações gerais estabelecidas acima forem seguidas. Há uma lista de verifica?...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884-100G
poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
fluorescing micro particles	Microgenics/FisherSci	R900
glycerol (OPTIONAL)	Sigma Aldrich	G6279-500 ml
microcentrifuge, i.e. CritSpin	FisherSci	22-269-291
syringe, i.e. 50 μl Gastight	Hamilton	80965
camera, i.e. Imager Intense, high speed	LaVision, Dalsa	Imager Intense
microscope, i.e. MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
syringe pump, i.e. Nexus3000	Chemyx, Inc.	Nexus-3000
flexible tubing, i.e. Tygon	FisherSci	14-169-1A
data processing software, i.e. DaVis	LaVision	DaVis
centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F