마이크로 혈액 흐름의 속도 분포 측정을위한 마이크로 입자 이미지 유속계

요약

마이크로 입자 영상 속도계 (μPIV)의 정확한 속도 프로파일을주고 간 상관 관계 혈액 흐름에 파종 마이크로 입자의 쌍 이미지를 시각화하는 데 사용됩니다. 임상 응용을 가지고 각각의 전단 속도, 최대 속도, 속도 프로파일 형태, 유량, 이러한 측정에서 파생 될 수 있습니다.

초록

마이크로 입자 영상 속도계 (μPIV)은 혈액 흐름에 파종 마이크로 입자의 쌍 이미지를 시각화하는 데 사용됩니다. 이미지는 정확한 속도 프로파일을 제공하는 교차 상관 관계이다. 프로토콜은 마이크로 혈액의 흐름 μPIV 측정에 표시됩니다. 미세 혈관의 규모, 혈액은 혈장, 뉴턴 유체에 떠있는 유연한 입자의 현탁액이기 때문에, 균일 한 유체로 간주 할 수 없습니다. 전단 속도, 최대 속도, 속도 프로파일 형태, 유량이 측정에서 파생 될 수 있습니다. 같은 초점 깊이 입자 농도 및 시스템 적합성과 같은 몇 가지 중요한 매개 변수는 다양한 hematocrits 및 유동 조건에 대한 예제와 대표 결과와 함께 정확하고 유용한 데이터를 보장하기 위해 제공됩니다.

서문

인간의 몸은 혈액과 조직 사이의 주요 교류 사이트입니다 직경이 50 μm의와 많은 혈관을 포함하고 있습니다. 이러한 혈관에서 혈액 흐름의 연구는 측정의 규모와 혈액의 유체 속성을 모두에 의해 상당한 도전을 나타냅니다. 압력 구배, 벽에서의 전단 및 소동맥과 소정맥의 속도 프로파일 등이 측정은 생리적 반응과 연결된 중요한 요소입니다. 이러한 측정 문제를 해결하기 위해 전례없는 기회를, 미세 혈관을 공부하고이 다중 스케일 문제를 해결하기 위해 마이크로 스케일에서 새로운 실험 기술 덕분에 지금있다.

마이크로 입자 영상 속도계 (μPIV)은 상호 관계를 통해 마이크로 혈액 흐름의 속도 프로파일을 평가하는 데 사용되는 입자 기반 유동 가시화 기술입니다. 첫 번째 산티아고 등.에 의해 개발 μPIV는, hemorheology와 함께 사용되었습니다Sugii 등 이후 연구. 2001 년에 100 μm의 라운드 유리 튜브 ^1,2 혈액 흐름을 측정하는 기법을 사용합니다. μPIV 존재하는 다양한 방법. 고속 카메라는 적혈구 (적혈구)의 움직임을 연관하는 데 사용될 수 있으며, 펄스 이미지는 추적 입자의 움직임을 연관하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 옵션 중 하나는 응용 프로그램에 따라 수직 또는 거꾸로 현미경과 결합 할 수 있습니다. 두 경우 모두 결과는 2D 속도 프로파일입니다. 또 다른 방법은 2D 및 3D 프로파일을 달성하기 위해 공 촛점 현미경을 사용하는 것입니다. 이 방법은 혈액 ^3,4,5에 적용되었습니다.

매크로 PIV와 비교할 때 마이크로 스케일 PIV는 여러 가지 합병증을 가지고 있습니다. 매크로 PIV에 데이터가 빛의 장을 통해 하나의 평면으로 제한 할 수 있지만, 마이크로 스케일 볼륨 조명에 필요합니다. 적혈구 자체가 C에 비해 큰만큼 볼륨 조명, 마이크로 혈액 흐름의 이미징을위한 더 큰 문제hannels 및 추적 입자로 적혈구를 사용하여 크게 교차 상관 관계 결과 ^6,7,8의 정확성을 줄일 수 상관의 깊이 (DOC)로 연결됩니다. 1 μm의 추적 입자와 DOC가 6.7 ㎛ 인 반면 추적기로 RBC와 40 μm의 높이 채널 Wereley 등. (1998) DOC에 이어, 8.8 μm의 수 있습니다. 채널 높이와 배율을 변경할 때이 차이는 더 두드러집니다. 또한, 적혈구는 불투명하고, 흐름 적혈구의 농도를 증가 시키면 영상의 어려움이 발생합니다. 가장 작은 입자를 사용하는 경우 첫 번째 산티아고 하였다. (1998)에 의해 사용되는 형광 추적 입자, 포커스 아웃 입자의 영향을 감소하는 도구로 주장되었다. 1 ㎛ 직경의 형광을 사용하여 레이저와 결합 된 미립자는 마이크로 혈류 영상 ¹⁰ 초점 문제의 깊이를 줄일 수있는 하나 방법입니다. μPIV 절반의 상태를 몇 가지 현재 리뷰가 있습니다혈액의 흐름 연구 ^11,12에 μPIV의 중요성을 강조 각각의 hnology는. 혈액 μPIV를 사용할 때 몇 가지 중요한 사항을 고려해야합니다. 마이크로 수준에서 미세 혈관의 규모는 혈액이 뉴턴 유체 (플라즈마)에 떠있는 유연한 적혈구 (적혈구), 대형 백혈구, 혈소판 및 다른 단백질의 현탁액이기 때문에, 균일 한 유체로 간주 할 수 없습니다 .

여기에서 측정 된 속도 프로파일은 마이크로 혈액 흐름의 특정 특성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. microhemorheology에서 중요한 요인은 혈액의 흐름 속도, 속도 프로파일의 형태, 용기의 벽 전단 응력이다. 미세 혈관은 신체의 영양 교환을위한 사이트이기 때문에이 정보는 임상 적 의미를 가지고 있으며,이 교환은 전단에 따라 다릅니다. 미세 혈관 연구의 상태에 대한 몇 가지 현재 검토 연구뿐만 ^{아니라, 13가}14,15.

여기에 제시된 것은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 마이크로 혈액의 흐름 μPIV 측정을위한 프로토콜입니다. PDMS 채널 프로토콜의 제 1의 소스에 따라 자체적으로 제작 하였다. 돼지의 혈액 샘플은 공인 도살장에서 얻은 프로토콜의 2 절에 따라 정리 하였다. 모든 데이터는 프로토콜의 3 항에 명시된 LaVision MITAS μPIV 시스템을 사용하여 얻은 것입니다. YAG 레이저 (뉴 웨이브 리서치, USA)와 CCD 카메라 (이미지 강렬한, Lavision) 프로그램 트리거 유닛, 3 축에서 이동 무대와 결합 형광 현미경, 컴퓨터에 의해 제어 : 셋업 다코타의 구성 고속 카메라 (DALSA 1M150, 네덜란드) 외에 적혈구 자체의 시각화를 위해 추가되었습니다. 두 카메라 2 포트에 광 상자 (혈구에 의해 정의, 독일)에 연결되어 있습니다. 혈액 흐름의 생체 측정에서 일반적으로 직립 현미경은 적혈구에게를 추적하는 데 사용됩니다mselves, 생체 응용 프로그램에서 일반적으로 거꾸로 현미경을 추적 입자를 추적하는 데 사용하는 동안. 셋업이 독특한 이중에서, 광학 상자는 두 추적기가 거꾸로 현미경을 사용하여 이미지를 만들 수 있습니다. 혈액 정밀 주사기 펌프 (Nexus3000, Chemyx 주식, USA)를 통해 마이크로 칩에 도입되었다. 시스템의 다이어그램은 그림의 상단 부분은 PDMS의 제조 40 μm의 사각 채널에서 140 μm의를 나타냅니다 그림 1과 같이하고 아래 부분은 모두 카메라, 레이저, 주사기 펌프 등 전체 시스템을 나타냅니다 현미경.

현재 μPIV 세트 업 가능, 일반적으로 독점 소프트웨어와 함께, TSI, DANTEC 역학 및 LaVision 있습니다. 표준 상호 상관 알고리즘은 MATLAB 등 다양한 소프트웨어 옵션을 통해 달성 될 수있다. 소프트웨어는 대화 상자가 수학적으로 사용 될 것입니다에 해당 무엇을 이해하는 열쇠 없습니다R 훨씬 더. 이 프로토콜 데이비스, LaVision의 독점 소프트웨어 나 MATLAB을 활용하고 있습니다. 프로토콜은 특정 소프트웨어 아니지만, 메뉴 옵션은 다른 소프트웨어 패키지에서 다른 장소에있을 수 있습니다.

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프로토콜

1. 마이크로 칩 제작

첫 번째 단계는 마이크로을 만들거나 구입하는 것입니다. 마이크로 칩 물자를위한 많은 옵션이 있습니다.

선택한 가장 일반적인 재료 중 하나는 (PDMS) (디메틸 실록산) 폴리. 소프트 리소그래피 ^16,17,18를 통해 PDMS 제작에 방향에 많은 출판물이있다.

PDMS 채널이 제작되면, 여러 가지 표면 처리 자연의 소수성을 취소 할 수있다. 산소 플라즈마 처리는 일반적인 옵션입니다.

저우, 엘리스, 그리고 Voelcker (2009) 표면 처리의 검토를주고 그들이 PDMS에 영향을 미치는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 결과는 그러나 물이며, 혈액은 서로 다른 속성이 있습니다. 그 표면 처리 혈액 무엇을 의미하는지에 대한 연구는 피츠 등. (2012A)에 의해 수행되었습니다.

결과는 여기에 제시된 내용은 마이크로 칩의 표면과 유리 슬라이드 그들이 있었다45초에 대한 산소 플라즈마에 노출 된 후 단단히 영구 채권의 결과 함께 눌렀는지 모두에 결합.

2. 혈액 준비

1. 공인 시설에서 혈액 샘플을 수집합니다. 예를 들어 돼지 혈액 항응고제로 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 사용할 수 있습니다. 물을 4 ml의 1g EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가하고 부드럽게 배 혼합, 전체 혈액의 1 L에 대한 솔루션을 추가합니다.

혈액 샘플을 채취 할 때, 그들이 RT 천천히 냉각 할 수 있습니다. 혈액 샘플은 신선하고, 이상적으로 그들은 혈액의 유변학 적 특성을 보존하기 위해 수집하는 하루 사용합니다.

샘플은 RT 한 번 냉동 될 수 있으며 항응고제없이하지만 전체 혈액은 냉장 후 사용할 수 없게됩니다. 항응고제에 따라 최대 사십이일에 대한 적혈구는 냉장 보관 할 수 있고, 전체 혈액 삼십오일에 대한 냉장 보관 할 수 있지만, 오염되지 않은 M에서 가능할 것이다edical 시설 ^21.

또한, 소 또는 돼지의 샘플 수집 방법에주의하고, 골수에 의한 오염을 방지.

2. 10 분마다 3,000 rpm에서 3 배 혈액 샘플을 원심 분리기. 처음으로 원심 분리 한 후, 혈장과 버피 코트를 제거 버린다. 먼저 플라즈마를 제거하기 위해 일반적으로 가장 쉬운 방법입니다, 그리고 혼자 버피 코트를 제거하려면 다음 폐기 또는 향후 사용을 위해 보관하십시오.

혈액으로 다시 버피 코트를 혼합하지 않는만큼, 천천히 피펫을 소개합니다. 버피 코트를 제거한 후, 인산 20 mL를 넣어 (PBS) 식염수 버퍼와, 부드럽게 recentrifuge을 섞는다. 마지막 단계를 반복합니다. 세 번째 원심 분리 한 후, PBS 및 나머지 버피 코트를 제거 버린다.

그것은 당신이 혈액의 응집 특성을 유지하고자하는 경우 대신 PBS의 기본 플라즈마를 사용하는 것도 가능하다. 모든 버피 코트 또는 흰색을 혼합하지 있는지 확인플라즈마로 혈액 세포.

3. 세척 적혈구 (적혈구) 가지고 원하는 농도 (hematocrits)에서 PBS 또는 플라즈마 일시 중지합니다. 의 microcentrifuge (CritSpin FisherSci, USA)와 hematocrits을 확인합니다.

10-20% 혈소판의 혈액이 40 75 % (생리 용적률)보다 더 쉽게 시각화 할 수 있어야한다. 미세 혈관에서 혈액은 일반적으로 매크로 순환의 절반 적혈구이므로, H = 20 ¹⁵ 적합합니다.

4. 혈액 샘플에 원하는 농도에서 추적 입자를 형광 추가합니다. 일반적인 규칙은 미리 계산 될 수있다 상관 관계 창에서 10 입자를 가지고있다.

예를 들어, 입자의 30 μL는 비디오에서 묘사 셋업위한 혈액 용액 1 ㎖에 추가됩니다. 또한, 적혈구 자체는 찬란 태그 할 수 있습니다.

5. 또한, 물과 독감 보정 용액을입자를 orescing. 그것은 뉴턴의 솔루션으로 시스템을 보정 할 필요가있을 것이다.

예를 들어, 100 μM의 규모에 채널 10X 목표를 사용하는 경우, 적절한 농도는 증류수 15 ml의 혼합 입자의 300 μL입니다. 또 다른 옵션은 혈액의 매크로 점도에 가까운 3CP의 점도 증류수로 희석 글리세롤을 사용하는 것입니다.

3. μPIV 측정

1. 레이저 안전 : 온도와 습도를 확인하십시오. 적절한 레이저 안전 안경을 착용 할 것. 레이저 커튼을 닫거나 실험실 문 노출되지 않도록 보호되지 않는 사람들을 방지하는 방법에 대한에 레이저 기호를 켭니다.
2. 데이비스 소프트웨어와 절차는 비디오에 표시됩니다. 특정 시스템의 사용자 설명서를 참조하십시오 자세한 내용은합니다.
3. 데이터를 복용하기 전에, 카메라의 스케일 마이크로 미터를 사용하여 보정해야합니다.
4. 시스템의 적합성을 줄이기 위해 튜브의 최단를 사용D와 같은 15 또는 50 μL 해밀턴 기밀 주사기 가능한 작은 단단한 주사기. 시스템에 혈액이나 공기 흡입구의 누출을 줄이기 위해 주사기와 칩 튜브를 밀봉하십시오. 이것은 접착제, PDMS 또는 바셀린 (혈액을 오염되지 않도록주의)을 수행 할 수 있습니다.

마이크로 주사기의 양이 일반적으로 채울 양보다 훨씬 작기 때문에 추적 입자로 묶여 물을 마이크로 주사기를 채우려면 역류 메서드를 사용합니다.

우리 역류 방법은 보조 플라스틱 주사기를 사용하여 채널의 출력을 통해 함께 마이크로 주사기와 채널을 채우기 위해 구성되어 있습니다. 모든 미세 기포가 마이크로 주사기, 튜브 또는 아웃 될 때까지이를 위해 우선 마이크로 주사기 플런저를 제거한 다음 채널의 출구에 부착 된 고전적인 플라스틱 주사기를 사용하여 액체를 밀어 마이크로 주사기 밖으로 액체 흐름을 보자 칩은, 결국 플런저를 다시 넣어 플라스틱 주사기를 뺍니다. 존재 O미세 기포의 R 부재는 현미경으로 확인할 수 있습니다.

5. 수평 배관을 달성하기 위해 주사기 펌프 수준입니다. 원하는 유량을 주사기 펌프를 프로그램입니다.

견고한 시스템이나 실제 유량을 수정하는 시스템의 준수 "병목 효과"와 같은 가능한 일시적인 효과를 인식해야합니다. 시스템의 특성 시간은 시스템의 재료와 크기의 함수로 추정 할 수있다. (제 2 호, pp 77-81, Tabeling, 2005)

6. 현미경 스테이지에 마이크로 칩을 배치하고 펌프를 시작합니다. 중간 속도 프로파일에 시스템을 보정하고 DT의를 (펄스 이미지 사이의 시간) 보정 입자로 물을 사용합니다.

입자는 좋은 상관 관계를 ¹¹ 프레임 사이의 5 ~ 10 픽셀을 이동해야합니다. 교정 할 때, 채널의 중간에 측정에주의해야합니다. 중간에 초점 평면은 가장가속도 ^8.

라운드 채널을 사용하는 경우 효과를 미행주의해야합니다.

샘플 이미지는 상단 이미지가 첫 번째 펄스이며 하단 이미지가 두 번째 펄스 반면, 펄스 카메라를 사용하여 그림 2에 표시됩니다. 그것은 밝은 점 (입자를 형광) 초점에서 가장이라는 그림에서 볼 수 있습니다.

7. 선택 사항 : 다른 높이로 데이터를 취함으로써 3D 속도 프로파일은 하나의 이미지에 다른 벡터를 추가하여 재구성 할 수 있습니다. 비디오 프로세스의 자동화를 위해 개발 된 루틴을 제공합니다.
8. 피와 데이터를 찍을 때, 물과 동일한 방법으로 혈액의 원하는 수량과 주사기를 채우십시오. 원하는 유량을 주사기 펌프를 프로그램 및 원하는 데이터를 가져 가라. 획득 RAW 이미지의 예제는 그림 2 표시됩니다. 뿐만 아니라 적혈구 침강주의하십시오. 주사기를 채우는 모든 실행하거나 모든다른 실행은 RBC의 정착을 줄일 수 있습니다.
9. 영상을 획득 한 후, 교차 상관 관계 이미지 사이의 속도 벡터 필드를 얻기 위해 이미지 쌍에서 수행됩니다. 그것은 좋은 상관 관계를 가지고 좋은 이미지를 가지고하는 것이 중요합니다. 연관 전에 사전 처리는 배경 잡음을 제거 할 수 있습니다.

교차 상관 관계의 크기와의 상관 관계에 영향을 미치는 형태로 변화 될 수있다 인접한 이미지에서 창 사이를 수행합니다. 교차 상관 관계 후 이미지 후 처리는 오류 벡터 또는 이상 값을 제거 할 수 있습니다.

사용 가능한 다른 옵션과 정확도에 대한 자세한 설명은 피츠 등에서 찾을 수 있습니다. (2012b), 혈액 최적의 처리가 창 길이 연장과 "이미지 중복"의 방법을 발견하고 흐름에 부합 된 곳 . 이러한 작업은 MATLAB과 같은, 또는 시스템의 소프트웨어 패키지 내 프로그램에서 수동으로 수행 할 수 있습니다. 소프트웨어가 중요하지 않습니다, 작업 뒤에 수학보다 중요하며, 각 작업은 최종 속도 프로파일의 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다.

결과 벡터는 평균, 대표 속도 프로파일을 얻기 위해 순간 속도 분포를 구하여 시간에 다시 평균 할 채널을 통해 공간을 평균 할 수 있습니다. Kloosterman 등. (2011) 피사계 심도가 큰 μPIV 측정의 오류에 대한 설명을 제공합니다. 여기에 제시된 데이터 처리의 오류에 대한 논의는 고속 측정을 위해 펄스 측정 및 Chayer 등. (2012)에 대한 피츠 하였다. (2012b)에서 찾을 수 있습니다.

속도 프로파일의 예는 그림 3과 그림 4에 제시되어있다. 그림 3은 H에서 RBC의 10 μL / 시간 흐름의 중심선에 대해 하나의 속도 프로파일 140 μm의 폭 넓은 채널 = 10을 제공합니다.

십t ">이 단일 프로파일이 속도 프로파일을 얻을 수있는 채널을 통해 상호 벡터를 평균하여 달성하고 대표적인 측정을 얻으려면 시간 평균입니다.이 경우에는 100 쌍의 시야에 걸쳐 시간을 평균 하였다.

30 μL / HR의 프로그램 유량 100 μm의 사각 채널에서 물 교정 흐름 찍은 3D 복원 프로필의 예는 그림 4에서 발견된다. 그림 4에서, 프로파일은 1 ㎛ 간격으로 측정됩니다.

10. 선택 사항 : 셋업 묘사 고속 이미지를 전환 카메라 (및 데이터 수집 시스템)에 의해 동일한 조건에서 수행 할 수 있습니다. 이 채널의 세포가없는 층을 시각화 및 집계를 정량화하는 데 유용 할 수 있습니다. 데이터 분석 (Chayer 외., 2012) 약간 다릅니다.

과 및 RBC 집계없이 흰색 빛 이미지의 예는 prese입니다H = 20 그림 5 nted. 상단 이미지를 집계 RBC의 능력을 제거하는 PBS,에 H = 20 1 μL / 시간에 보여줍니다. 아래 이미지는 0.5 μL / HR에서 기본 플라즈마 H = 20입니다. 아래 그림에서 집합이 표시됩니다.

11. 측정이 완료되었을 때 안전하게 시스템을 종료합니다. 레이저 전원이 완전히 종료 될 때까지 적절한 레이저 안전 절차를 사용합니다.

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결과

모든 그림에서, 흐름은 원시 이미지 및 계산 된 속도 프로파일에서 위쪽 왼쪽에서 오른쪽으로있다. 혈소판 H = 10 10 μL / 시간에서 흐르는에서 혈액으로 얻은 원시 데이터의 예는 그림 2에 표시됩니다. 원시 데이터 속도 프로파일을 달성하기 위해 모든 데이터 처리를하지 않고 상호 연관 될 수 있습니다. 사전 처리 및 데이터 처리 방법의 영향 피츠, 외., (2012b)에 의해 설명되어 있...

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토론

미세 혈관의 규모 혈류 측정 μPIV를 사용하여 관련 생물 의학 기계 및 화학 공학 프로세스의 큰 숫자에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 에 대한 계정에 핵심 요소 중 일부는 RBC 자체 형광 마이크로 입자의 RBC, 집계 또는 운동의 집계 및 변형성, 그리고 채널 RBC의 정착의 밀도이다. 이들 모두는 위에 뻗어 일반적인 지침을 준수하는 경우에 대해 설명 할 수 있습니다. 이 시스템을 사용하는 좋은 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884-100G
poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
fluorescing micro particles	Microgenics/FisherSci	R900
glycerol (OPTIONAL)	Sigma Aldrich	G6279-500 ml
microcentrifuge, i.e. CritSpin	FisherSci	22-269-291
syringe, i.e. 50 μl Gastight	Hamilton	80965
camera, i.e. Imager Intense, high speed	LaVision, Dalsa	Imager Intense
microscope, i.e. MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
syringe pump, i.e. Nexus3000	Chemyx, Inc.	Nexus-3000
flexible tubing, i.e. Tygon	FisherSci	14-169-1A
data processing software, i.e. DaVis	LaVision	DaVis
centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F