Micro-Измерение скорости Изображения Частиц для профиля скорости Измерения Micro приливает кровь

Резюме

Micro-Измерение скорости Изображения Частиц (μPIV) используется для визуализации парных изображений микрочастиц высевают в потоках крови, которые являются взаимной корреляции дать точный профиль скорости. Скорость сдвига, максимальная скорость, форма профиля скорости, а скорость потока, каждый из которых имеет клинического применения, могут быть получены из этих измерений.

Аннотация

Micro-Измерение скорости Изображения Частиц (μPIV) используется для визуализации парных изображений микрочастиц высевают в течет кровь. Изображения взаимной корреляции, чтобы дать точный профиль скорости. Протокол представляется для измерений μPIV крови потоков в микроканалов. На уровне микроциркуляции, кровь не может считаться однородной жидкости, поскольку она представляет собой суспензию гибкий частиц, взвешенных в плазме ньютоновской жидкости. Скорость сдвига, максимальная скорость, форма профиля скорости, и скорость потока может быть получена из этих измерений. Несколько ключевых параметров, таких как глубина очага, концентрации частиц и системы соответствия, представлены в целях обеспечения точного, полезные данные вместе с примерами и репрезентативные результаты для различных гематокрита и условий обтекания.

Введение

Организм человека содержит многочисленные сосуды с диаметром менее 50 мкм, которые являются основной сайт обмена между кровью и тканями. Исследование кровотока в этих сосудах представляет собой значительную проблему как за счет масштаба измерения и свойства жидкости крови. Эти измерения, в том числе градиент давления, сдвига на стене, и профилей скорости в артериол и венул, являются ключевыми факторами, связанными с физиологическими реакциями. Есть в настоящее время беспрецедентные возможности, чтобы решить эти проблемы оценки, благодаря новой экспериментальной техники на микроуровне для изучения микроциркуляции и решить эту многомасштабная проблемы.

Микро-изображения частицы велосиметрии (μPIV) является частица на основе визуализации потока метод, который используется для оценки профилей скорости кровотока в микроканалов через кросс-корреляции. μPIV, впервые разработанная Сантьяго и др.., был использован с гемореологииИсследования с Сугии соавт. в 2001 году использовал технику для измерения кровотока в 100 мкм круглые стеклянные трубки ^1,2. Различные подходы к μPIV существует. Камеры высокого скорости может использоваться для корреляции, движение красных кровяных телец (эритроцитов) и импульсного изображения могут использоваться для корреляции движения меченых частиц. Любой из этих вариантов могут быть соединены с прямой или инвертированный микроскоп, в зависимости от применения. В обоих случаях результатом является 2D профиль скорости. Другой подход заключается в использовании конфокальной микроскопии для достижения 2D и 3D профилей. Этот метод был применен к крови ^3,4,5.

Микроуровне PIV имеет несколько осложнений по сравнению с макро PIV. В макро PIV данных может быть ограничена одной плоскости через листы света, но в микро освещения объем шкала является необходимым. Объем освещения большей проблемой для визуализации микро потоками крови, так как эритроциты самой большой по сравнению с Сhannels и используя эритроциты как маркерные частицы приводит к глубине корреляции (DOC), которые могут существенно снизить точность взаимной корреляции результатов ^6,7,8. После Wereley соавт. (1998) DOC для 40 мкм высокий канал с РБК как индикаторов составляет 8,8 мкм, в то время как с 1 мкм частицы Tracer DOC составляет 6,7 мкм. Эта разница становится более выраженным при изменении высоты канала и увеличения. Кроме того, эритроциты являются непрозрачными и увеличения плотности эритроцитов в потоке приводит изображений трудности. Флуоресцирующего трассирующих частиц, впервые использовал Сантьяго и соавт. (1998), были выступал в качестве инструмента для снижения влияния несфокусированный частиц, при использовании мельчайших частиц возможно. Использование диаметром 1 мкм флуоресцирующих микрочастиц в сочетании с лазерным является одним из подходов, которые могут уменьшить глубину резкости проблема в микро визуализации кровотока ^10. Есть несколько текущие обзоры состояния μPIV TEChnology, каждый из которых подчеркивает важность μPIV кровотоку исследования ^11,12. Несколько важных соображения должны быть приняты во внимание при использовании μPIV крови. На микроуровне, масштаб микроциркуляции, кровь не может считаться однородной жидкости, поскольку она представляет собой суспензию гибкий красных кровяных телец (эритроцитов), большие лейкоциты, тромбоциты и другие белки суспендировали в ньютоновской жидкости (плазмы) .

Профили скорости измеряется здесь может быть использован для измерения определенных характеристик микро потоками крови. Важными факторами являются microhemorheology скорость потока крови, форма профиля скорости, а напряжение сдвига на стенке сосуда. Эта информация имеет клиническое значение, так как микроциркуляции является местом для питательных обмена в организме, и этот обмен сдвига-зависимыми. Есть несколько современных исследований мнение о состоянии исследований в микроциркуляции, а также ^13,14,15.

Представленные здесь протокол для измерения μPIV крови потоков в полидиметилсилоксана (PDMS) микроканалов. PDMS каналы были изготовлены в доме после источников в разделе 1 Протокола. Образцы крови свиней были получены от аккредитованного бойню и убрали следующий раздел 2 протокола. Все данные были получены при использовании LaVision MITAS μPIV системы, как описано в разделе 3 протокола. Установка состоит из Nd: YAG лазера (New Wave Research, США) и ПЗС-камеры (изображение Intense, Lavision), управляемый программируемым запуском блока, флуоресцентного микроскопа в сочетании с этапом перемещения по 3 осям, и компьютер, В дополнение к высокой скорости камеры (Dalsa 1M150, Нидерланды) добавляют для визуализации эритроцитов собой. Обе камеры подключены к порту 2-оптические окна (Пользовательский по Zeiss, Германия). В типичных в естественных условиях измерения кровотока, прямой микроскоп используется для отслеживания эритроцитыmselves, в то время как в типичных приложениях в пробирке инвертированный микроскоп используется для отслеживания трассирующих частиц. В этой уникальной двойной установки, коробки оптика позволяет как индикаторов для включения в образ использованием инвертированного микроскопа. Кровь была введена в микрочипами с помощью насоса высокого шприц точности (Nexus3000, Chemyx Инк, США). Схема системы показана на рисунке 1, где в верхней части фигуры представляет 140 мкм на 40 мкм прямоугольных каналов изготовлены из PDMS, а нижняя часть представляет всю систему, включая обе камеры, лазерный, шприцевой насос и микроскопом.

Текущий μPIV установок доступны, как правило, с проприетарного ПО, включают TSI, Дантек Динамика и LaVision. Стандартный кросс-корреляции алгоритмов может быть достигнуто путем многочисленных вариантов программного обеспечения, в том числе MATLAB. Программное обеспечение не является ключевым, понимая, что диалоговые окна соответствуют математически будет служить использованиеR намного лучше. В этом протоколе Дэвис, проприетарное программное обеспечение LaVision или MATLAB используются. Этот протокол не является конкретным программным обеспечением, но меню пункты могут быть в разных местах, в разных пакетах программного обеспечения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Изготовление Microchip

Первый шаг заключается в создании или покупке микроканальным. Есть много вариантов для материала микрочипа.

Один из наиболее распространенных материалов, выбранных представляет собой поли (диметилсилоксан) (PDMS). Есть много публикаций по направлениям PDMS для изготовления мягкой литографии через ^16,17,18.

Как только канал PDMS изготовлен, есть несколько способов обработки поверхности доступны отменить свое природных гидрофобность. Кислород плазменную обработку распространенный вариант.

Чжоу, Эллиса и Voelcker (2009) дают обзор обработки поверхности и как они влияют PDMS. Эти результаты для воды однако, и кровь обладает различными свойствами. Исследование по каким то обработка поверхности средства для крови было сделано Питтс и др.. (2012a).

По результатам, представленным здесь, микрочип поверхностей и предметные стекла они былисвязан с оба были подвержены кислородом плазмы в течение 45 секунд, а затем плотно прижаты друг к другу приводит к долговременной связи.

2. Препаратов крови

1. Соберите образцы крови от аккредитованного объекта. Например свиной крови может быть использован с этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в качестве антикоагулянта. Добавляют 1 г ЭДТА с 4 мл воды, а затем добавить раствор до 1 л цельной крови, смешивание осторожно 10x.

Забирая образцы крови, дать им остыть до комнатной температуры медленно. Образцы крови должны быть свежими, а в идеале используемый день они собраны, чтобы сохранить реологических свойств крови.

Образцы могут храниться при комнатной температуре один раз, однако цельной крови без антикоагулянта будет испорчен после охлаждения. В зависимости от антикоагулянт, эритроциты могут храниться в холодильнике в течение до 42 дней, и цельную кровь можно хранить в холодильнике в течение 35 дней, но заражение было бы возможно в не-мedical объекта ^21.

Кроме того, будьте осторожны с методом сбора с бычьей или свиной образцов, и во избежание загрязнения костного мозга.

2. Центрифуга образцы крови 3x при 3000 оборотах в минуту в течение 10 минут каждый раз. После первого центрифугирования, удаления плазмы и лейкомассы, отбросить. Обычно наиболее легким для удаления плазмы, а затем отменить или сохранить для использования в будущем, то, чтобы удалить слой светлого сгустка крови в покое.

Введем пипеткой медленно, чтобы не перепутать слоем светлого сгустка крови обратно в кровь. После удаления светлого сгустка крови, добавляют 20 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) и осторожно перемешать, recentrifuge. Повторите последний шаг. После третьего центрифугирования, снимите пальто PBS и оставшиеся Баффи, отбросить.

Кроме того, можно использовать родной плазмы вместо PBS, если вы хотите сохранить агрегирования свойств крови. Удостоверьтесь, чтобы не смешать все лейкомассы или белыйклетки крови в плазму.

3. Возьмите очищены красных кровяных телец (эритроцитов) и приостановить в ФБР или плазмы при желаемой концентрации (гематокрита). Проверьте гематокриты с микроцентрифужные (CritSpin FisherSci, США).

Кровь от 10 до 20% гематокрита должно быть легче представить себе, чем 40 или 50% (физиологический гематокрит). В микроциркуляции, кровь обычно равен половине гематокрита макро циркуляции, поэтому H = 20 достаточно ^15.

4. Добавить флуоресцирующих трассирующей частиц в желаемой концентрации в крови. Общее правило иметь 10 частиц в окно корреляции, который может быть вычислен заранее.

Например, 30 мкл частиц добавляют к 1 мл крови решение для настройки показано на видео. С другой стороны, эритроциты сами по себе могут быть флуоресцентно меткой.

5. Кроме того, убедитесь калибровочный раствор водой и гриппаorescing частиц. Это будет необходимо калибровать систему с ньютоновской раствора.

Например, при использовании объектив 10X с каналом в масштабе 100 мкм, подходящей концентрации 300 мкл частиц смешивают с 15 мл дистиллированной воды. Другой вариант заключается в использовании глицерина разбавляют дистиллированной водой до вязкости 3CP, который находится ближе к макро вязкость крови.

3. Измерения μPIV

1. Лазерная безопасность: Проверьте температуру и влажность. Использовать соответствующие защитные очки лазер. Закройте занавес лазера или включить лазерный знак на двери лаборатории, чтобы не допустить людей не защищены от воздействия.
2. Процедура с Дэвисом программного обеспечения показано в видео. Для получения дополнительной информации обратитесь к руководству по эксплуатации конкретной системы.
3. Прежде чем принимать данные, камера масштабе необходимо провести калибровку с использованием микрометра.
4. Чтобы уменьшить соответствие системы, используйте кратчайшие трубг наименьшей жесткой шприц возможно, например, 15 или 50 мкл шприца Гамильтона газонепроницаемые. Чтобы уменьшить утечку крови или воздуха в системе, уплотнение трубки в шприц и чипа. Это можно сделать с клеем, PDMS или вазелином (будьте внимательны, чтобы не загрязнить кровь).

Чтобы заполнить микрошприца водой с добавкой частиц трассирующими использовать обратный метод, потому что объем микрошприца как правило, гораздо меньше, чем объем для заполнения.

Наши обратного метода состоит, чтобы заполнить шприц микро-и канал вместе через выходной канал с использованием вторичного пластиковый шприц. Для этого сначала удалить микро-поршень шприца, а затем подтолкнуть жидкости с использованием классических пластиковый шприц прикреплена к выходному отверстию канала, пусть поток жидкости из микро-шприца, пока все микропузырьки не из микрошприца, труб или чип, наконец, положить поршень назад и отсоедините пластиковый шприц. Наличие OR отсутствие микропузырьков может быть проверена с помощью микроскопа.

5. Level шприцевой насос для достижения горизонтальной трубки. Программирование шприцевой насос, чтобы требуемый расход.

Будьте осведомлены о возможных временных эффектов, как "узкое место эффект", для жесткой системы или соответствие системы, которые изменяют фактический расход. Временные характеристики системы могут быть оценены как функцию материалов и размеров системы. (Глава 2, стр. 77-81, Tabeling, 2005)

6. Поместите на микрочипе столик микроскопа и включите насос. Использование воды с частицами для калибровки системы к среднему профиль скорости и калибровки дТ (время между импульсным изображений).

Частицы должны перемещаться между 5 и 10 пикселей между кадрами для хорошая корреляция ^11. При калибровке быть осторожным, чтобы измерить в середине канала. Фокальной плоскости в середине имеет самый высокийСкорость ^8.

При использовании круглых каналов, будьте осторожны эффекты затенения.

Образец изображение показано на рисунке 2, с использованием импульсного камеру, в то время как верхний изображение первого импульса и нижней изображение второго импульса. Видно на рисунке, что наиболее яркие точки (флуоресцирующих частиц) являются наиболее в фокусе.

7. ВАРИАНТ: Принимая данные на разных высотах 3D профилем скорости может быть восстановлена ​​путем добавления различных векторов в одно изображение. Видео представляет собой процедуру, которая была разработана для автоматизации процесса.
8. При приеме данных с кровью, заполнить шприц с требуемым количеством крови таким же способом, как вода. Программирование шприцевого насоса к требуемой скорости потока и принимать нужные данные. Пример сырье изображений, полученных представлена ​​рисунке 2. Будьте осторожны осаждения РБК, а также. Заправка шприцем каждый пробега или каждыедругой перспективе уменьшит оседание РБК.
9. После получения изображения, взаимная корреляция выполняется на изображение пары для получения поля вектора скорости между изображениями. Важно иметь хорошие изображения, чтобы иметь хорошую корреляцию. Перед корреляции, предварительной обработки может быть сделано для устранения фоновых шумов.

Кросс-корреляции делается между окнами в соседних изображений, которые можно варьировать по размеру и форме, чтобы повлиять на корреляции. После взаимной корреляции, обработки изображений сообщение может быть сделано для устранения ошибочных векторов или выбросов.

Подробное описание различных доступных вариантов и их точности, можно найти в Pitts и соавт. (2012b), где лучшие обработки крови было обнаружено, что метод "изображений дублирование" с окнами вытянут в длину и выровнены с потоком . Эти операции можно выполнить вручную в программу, как MATLAB, или в пакет программного обеспечения с вашей системой. программное обеспечение, не важно, математику за операции является более важным и каждая операция может влиять на точность конечного профиля скорости.

Полученные векторы могут быть усреднены в пространство через канал для получения мгновенной профили скорости, а затем снова в среднем времени, чтобы получить среднее, представитель профиль скорости. Клоостерман соавт. (2011) объяснять ошибки в измерениях μPIV где глубина поля велика. Обсуждения на погрешность обработки данных, представленные здесь, можно найти в Питтс и др.. (2012b) для импульсных измерений и Chayer соавт. (2012) для высокоскоростных измерений.

Примеры профилей скорости представлены на рисунках 3 и 4. 3 приведены одном профиле скорости для осевой 10 мкл / час потока эритроцитов при Н = 10 140 мкм широкий канал.

палатка "> Это один профиль достигается путем усреднения коррелированных векторов через Ла-Манш, чтобы получить профиль скорости, с последующим усреднением во времени, чтобы получить репрезентативную измерения. В этом случае, 100 пар были усреднены во времени по всему полю зрения.

Пример 3D реконструированного профиль приняты для калибровки расхода воды в 100 мкм, площадь канала с запрограммированной скоростью потока 30 мкл / час находится на рисунке 4. На рисунке 4, профили на расстоянии 1 мкм интервалами.

10. Необязательно: В изображены настройки изображения высокой скорости могут быть приняты на тех же условиях, переключая камеры (и систем сбора данных). Это может быть полезно для визуализации бесклеточной слой в канале, и для количественной агрегации. Анализ данных немного отличается (Chayer соавт., 2012).

Примерами белого света изображения с и без агрегации эритроцитов являются Presented на рисунке 5 при Н = 20. Верхний изображений показывает H = 20 в PBS, который удаляет способность эритроцитов к агрегации, в 1 мкл / час. Нижний рисунок представляет собой Н = 20 в родном плазмы на 0,5 мкл / час. В нижней части изображения, агрегация видна.

11. Выключите систему в безопасном порядке, когда измерения были завершены. Используйте надлежащие процедуры лазерной безопасности, пока лазерный источник питания не полностью закрыли.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На всех рисунках, поток слева направо в необработанных изображений, и вверх в расчетных профилей скорости. Пример исходные данные, полученные с кровью в гематокрита H = 10 протекающий при 10 мкл / час показан на рисунке 2. Исходные данные могут быть коррелируется без обработки данн...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Использование μPIV для измерения кровотока в масштабе микроциркуляции может дать представление большого количества соответствующих медико-биологических, механических и химических процессов машиностроения. Некоторые из ключевых факторов для учета являются плотность РБК себе, агрега...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884-100G
poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
fluorescing micro particles	Microgenics/FisherSci	R900
glycerol (OPTIONAL)	Sigma Aldrich	G6279-500 ml
microcentrifuge, i.e. CritSpin	FisherSci	22-269-291
syringe, i.e. 50 μl Gastight	Hamilton	80965
camera, i.e. Imager Intense, high speed	LaVision, Dalsa	Imager Intense
microscope, i.e. MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
syringe pump, i.e. Nexus3000	Chemyx, Inc.	Nexus-3000
flexible tubing, i.e. Tygon	FisherSci	14-169-1A
data processing software, i.e. DaVis	LaVision	DaVis
centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F