De alto rendimiento, extracción automática de ADN y RNA de muestras clínicas utilizando la tecnología TruTip en común Robots Manejo de líquidos

Resumen

TruTip es una tecnología de extracción de ácidos nucleicos muy simple por la unión de la matriz porosa, monolítica se inserta en una punta de pipeta. Por consiguiente, el formato de preparación de la muestra es compatible con la mayoría de instrumentos para la manipulación de líquidos, y se puede utilizar para muchos medio a las aplicaciones clínicas de alto rendimiento y tipos de muestras.

Resumen

TruTip es una tecnología de extracción de ácidos nucleicos muy simple por la unión de la matriz porosa, monolítica se inserta en una punta de pipeta. La geometría del monolito puede ser adaptado para puntas de pipeta específicas que varían en volumen de 1,0 a 5,0 ml. La gran porosidad del monolito permite muestras viscosas o complejo para pasar fácilmente a través de él con contrapresión de fluido mínima. Flujo bidireccional maximiza el tiempo de residencia entre el monolito y la muestra, y permite a las grandes volúmenes de muestra para ser procesada dentro de un solo TruTip. Los pasos fundamentales, independientemente de su volumen de la muestra o la geometría TruTip, incluyen la lisis celular, unión de ácidos nucleicos a los poros interiores de la TruTip monolito, lavando componentes de la muestra no unidos y tampones de lisis, y eluir los ácidos nucleicos purificados y se concentró en un tampón apropiado. Los atributos y la adaptabilidad de TruTip se demuestran en tres protocolos de procesamiento de muestras clínicas automatizadas utilizando un Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR y STARPLUS robots de manipulación de líquidos, como el aislamiento de ARN de aspirado nasofaríngeo, el aislamiento de ADN genómico a partir de sangre total, y la extracción de ADN fetal y el enriquecimiento de grandes volúmenes de plasma materno (respectivamente).

Introducción

Purificación de ácidos nucleicos es necesario para el diagnóstico molecular más, la investigación sólo utilizar, y aplicaciones de ciencias de la vida. Varios enfoques han surgido desde el momento de extracciones con fenol / cloroformo, muchos de los cuales se basan en el principio fundamental de la unión de ácidos nucleicos a la sílice en presencia de sales caotrópicas ^1. El proceso de extracción se ha simplificado y automatizado a través del uso de diversos formatos-y el talón basados ​​en membranas, con filtros de espín, perlas magnéticas y enfoques relacionados que dominan la industria de ciencias de la vida (ver ejemplos en ^2-13). Aunque eficaz, las partículas y las membranas han sabido limitaciones cuando se enfrentan a difíciles matrices clínicos. Por ejemplo, las membranas y columnas basados ​​en perlas son compatibles, tienen pequeños tamaños de poro (por lo tanto, altas presiones de la espalda), y requieren algún tipo de apoyo con el fin de ser procesados ​​por un sistema de centrífuga o de vacío. Las características físicas de las membranas y columnas de perlas de resultado enresistencia fluídica significativa, lo que limita el tipo de muestras que se puede procesar de manera eficiente sin obstruir el consumible, y / o el volumen total de la muestra (entrada) que pueden ser uni-direccionalmente procesado a través de la trayectoria de flujo. Por el contrario, las partículas magnéticas deben ser distribuidas a lo largo de la muestra por agitación. La necesidad de distribuir homogéneamente las partículas magnéticas dentro de una solución limita el volumen de la muestra total de entrada que puede ser procesado con los consumibles de talón más magnéticos. Atributos de muestras clínicas (tales como la viscosidad o la complejidad) pueden conducir a la concentración de partículas magnéticas ineficiente en el lado de un tubo o varilla. Además, las partículas finas de sílice pueden desprenderse de las cuentas durante el proceso de extracción, perdiendo su magnetización y la contaminación de la muestra final.

La tecnología TruTip fue desarrollado para superar algunas de estas limitaciones de ácidos nucleicos de muestra y limitaciones de procesamiento ^14. Mediante la incorporación de un monolito poroso dentro de unpunta de la pipeta, contrapresión de fluido se reduce, lo que permite el control de flujo de vacío (es decir, una pipeta de aspiración). Esta característica permite que el proceso de extracción y de la instrumentación requerida para purificar ácidos nucleicos a partir de los tipos de muestras difíciles de ser simplificado en gran medida (Figura 1). La geometría y la porosidad del monolito se adapta para reducir al mínimo la obstrucción, mientras que el espesor del monolito proporciona la capacidad de unión de ácido nucleico suficiente para volúmenes de muestra que van de 1,0 a 5,0 ml. De flujo bidireccional de la muestra durante la aspiración y la dispensación permite tiempos de residencia prolongados entre el extracto de la muestra y el monolito de unión para la recuperación de ácido nucleico eficiente y elución, y permite relativamente grandes volúmenes de muestra para ser procesada que exceda la capacidad de volumen de la propia punta de la pipeta. Hemos informado anteriormente de la elaboración y aplicación de un procedimiento TruTip manual para purificar ARN influenza en muestras nasofaríngeas utilizando un único o multi-canal Rainin pipeta ^15. Eficiencia de extracción equivalentes se obtuvieron entre automatizado QIAcube y métodos TruTip manuales a 10 ⁶ copias de genes de influenza A por ml aspirado nasofaríngeo. El objetivo de este estudio fue demostrar, procedimientos de mediano y alto rendimiento automatizadas TruTip purificación de ácidos nucleicos de aspirado nasofaríngeo (NPA) y otros tipos de muestras clínicamente relevantes, utilizando robots de manipulación de líquidos que se encuentran comúnmente en los laboratorios clínicos de referencia.

Protocolo

Tres protocolos automatizados de extracción TruTip se describen y demuestran aquí: 1) extracción de medio rendimiento ARN a partir de NPA en un Eppendorf epMotion 5070; 2) de alto rendimiento de extracción de ADN genómico a partir de pequeños volúmenes de sangre entera en el Hamilton STAR, y 3) aislamiento selectivo y el enriquecimiento de ADN fetal fragmentada a partir de grandes volúmenes de plasma materno en el Hamilton STARPLUS. Los scripts automatizados están disponibles Akonni y sólo los descriptores de programas de alto nivel se ofrecen a continuación. Los reactivos de extracción y la elución se dispensan automáticamente de canales de reactivos a granel a placas de 96 pocillos por el script automatizado (s) antes de que se procesan las muestras clínicas.

1. Extracción automática de ARN de aspirado nasofaríngeo

El método manual descrito anteriormente TruTip ¹⁵ está adaptado para funcionar en un epMotion 5070 robot de manipulación de líquidos Eppendorf, utilizando una matriz grande TruTip poros incrustado en 1,0 ml Eppendorf tubostte consejos, ml una placa de 2 pozos profundos (EE.UU. Scientific), Akonni TruTip reactivos de extracción, y el PAN, el tipo de muestra. El epMotion 5070 robot de manipulación de líquidos con capacidad para 8 consejos a la vez, por lo que un protocolo automatizado de línea de base se describe para 8 extracciones paralelo. Sin embargo, hasta 24 muestras se pueden procesar en un solo programa en una placa de muestras de 96 pozos en pozos profundos. Un programa de epMotion independiente está disponible (y requerido) con el fin de procesar 16 o 24 muestras. El protocolo se describe a continuación es una muestra de 8 script automatizado.

Disposición

1. Llevar las muestras nasofaríngeas a RT antes de iniciar la extracción.
2. Vierta 100 l aspirado nasofaríngeo más 150 l de agua libre de nucleasa en la columna 1 de la placa de la muestra (Figura 2A).
3. Coloque la placa de la muestra en la posición B1 en la mesa de trabajo epMotion (Figura 2B).
4. Coloque las puntas de pipeta, TruTips y 30 ml valles reactivo en sus respectivos Worktab epMotionle posiciones (Figura 2B).
5. Abra el software de Eppendorf epBlue, seleccione el archivo de ejecución proporcionado por Akonni de 8 muestras, y cargar el método haciendo clic en el botón Ejecutar de la pestaña RUN.
6. En Configuración del sensor de nivel, seleccione Niveles y consejos, y haga clic en el botón RUN.
7. Introduzca el volumen de la muestra en el software y haga clic en Ejecutar.
8. La secuencia de comandos epMotion le pedirá al usuario añadir reactivos de extracción y la elución a los depósitos de reactivos situados en la posición B2 en la mesa de trabajo. Añadir los volúmenes recomendadas de cada reactivo a la cubeta respectiva. Para 8 muestras, los volúmenes mínimos de reactivos son:

Reactivo	Volumen (ml)	A través Posición
Etanol 95%	3.5	2
Tampón de lavado D	9.0	3
Tampón de lavado E	9.0	4
Elution Buffer A2	1.3	5
Lisis y Binding Buffer D	11.0	6

9. Introduzca los volúmenes de reactivos en el cuadro presentado por el software de epMotion durante el prompt del Paso 8. El valor de entrada debe reflejar el volumen real de tampón dispensado por el usuario en cada respectivo depósito de reactivo, y debe ser mayor que o igual a los volúmenes mínimos indicados anteriormente. Entradas de volumen incorrecta podría resultar en volúmenes incorrectos entregados por el hardware epMotion a cada tubo o pocillo en la placa de 96 pocillos (s).

Programa Automatizado

10. Seleccione Ejecutar para iniciar el método automatizado. El script automatizado se moverá a través de los siguientes pasos sin la intervención del usuario:
    La lisis de muestra y distribución del reactivo:
    1. Dispense 375 l Tampón de lisis D en la columna 1 y se mezcla durante 10ciclos (apirate + dispensar = 1 ciclo). Este paso inicia el proceso de incubación de lisis, mientras que los reactivos restantes se alícuotas.
    2. Dispensar 1,6 ml de tampón de lavado D en la columna 2.
    3. Dispensar 1,6 ml de tampón de lavado E en la columna 3.
    4. Dispensar 50 l de tampón de elución A en la columna 4.
    5. Pausa durante 6 minutos para completar la muestra de 10 minutos de incubación en tampón de lisis D.
    6. Añadir 375 l de etanol a cada pocillo en la columna 1, mezclando cada muestra con etanol a través de 10 ciclos de pipeteado.
    Extracción:
    7. Cargar 8 TruTips desde la posición A2 en la mesa de trabajo, y comenzar el proceso de extracción se indica en la Figura 1.
    8. Aspirar y dispensar la muestra / mezcla de tampón / etanol lisis de la columna 1 de la placa de muestra durante siete ciclos de enlazar el ácido nucleico a la TruTip monolito. Aunque el flujo de muestra a través de la TruTip puede variar (debido a diferencias en la viscosidad de la muestra clínica), rendimiento de ácido nucleico para estas muestras habíat afectada por la variación de flujo. Opciones para mejorar el flujo de la muestra se describen en la discusión.
    9. Mover a la columna TruTips placa de muestras 2, y el ciclo de tampón de lavado D 5x sobre el monolito para eliminar tampón de lisis residual y de la matriz de la muestra.
    10. Mueva TruTips a la columna de placa de la muestra 3, y el ciclo de tampón de lavado E 5x sobre el monolito para eliminar las proteínas y otros contaminantes a partir del ácido nucleico unido.
    11. Mueva TruTips a la posición de depósito de reactivo vacío 1 (en lugar Mesa de trabajo B2) y el ciclo de 80x (a una velocidad de flujo rápido) para secar el monolito. Es importante secar a fondo el TruTip, como disolventes residuales en preparaciones de ácido nucleico eluidas afectarán negativamente a las enzimas tales como la transcriptasa inversa y la ADN polimerasa Taq.
    12. Mueva TruTips a la columna 4 muestra la placa y el ciclo 5 veces en tampón de elución A. El ácido nucleico extraído y purificado se encuentra ahora en tampón de elución en columna muestra la placa de 4 pozos.
    13. Expulsar TruTips a la basura epMotion.
    14. Cuando el programa termine, quite manualmente la placa de muestra del instrumento y transferir el ácido nucleico purificado a nuevos tubos para el almacenamiento a largo plazo o su uso posterior. Los usuarios avanzados epMotion pueden añadir instrucciones en el archivo de ejecución para transferir las muestras eluidas en tubos de almacenamiento separadas o placas de PCR, si se desea.

El programa de 16 muestras en total repetirá los pasos 10.1 por 10.13 utilizando columnas de platos de muestra 5-8. Para el programa 24 de la muestra, a través de unos pasos 10.1 10.13 se repiten 2x usando columnas de platos de muestra 5-8 y 9-12, respectivamente.

2. De 96 pocillos de extracción de ADN genómico a partir de sangre entera

Un ESTRELLA robot de manipulación de líquidos Hamilton se utiliza para demostrar extracción automatizada de 96 muestras simultáneamente de la sangre entera. El Hamilton ESTRELLA difiere del sistema epMotion en que un calentador opcional / unidad agitadora está disponible en la cubierta, que es importante para la digestión enzimática de ciertas clínicasmatrices de cal, tales como sangre completa. Debido a que el sistema puede estar equipado con un cabezal de pipeta de 96 canales, hay una placa de 96 pocillos dedicado para cada uno de los pasos TruTip y reactivos.

Disposición

1. Encienda el instrumento STAR y equipo.
2. Abra el software de control de ejecución Hamilton.
3. Abrir el archivo de ejecución proporcionada por Akonni para 96 ​​muestras.
4. Lugar material de laboratorio sobre la cubierta ESTRELLA como se muestra en la Figura 3.
5. Dispensar reactivos en sus correspondientes canales (volúmenes denotan el mínimo requerido para procesar 96 muestras):

Reactivo	Volumen (ml)	A través Posición
Lisis y Binding Buffer C	75	5
Etanol 95%	100	6
Tampón de lavado J	175	7
LavarBuffer K	175	8
Elution Buffer A2	12	9
Proteinasa K (20 mg ml -1)	8	15

6. Dejar que las muestras alcancen la temperatura ambiente.

7. Colocar los tubos de muestra en los bastidores portadores de ejemplo (posición de la cubierta 4 en la Figura 3). Muestra 1 Coloque en la parte trasera del vehículo de la izquierda y pasar secuencialmente por cada compañía con la Muestra 96 ​​que termina en la posición delantera derecha.

Programa Automatizado

8. Seleccione el botón PLAY en la esquina superior izquierda de la ventana del archivo Run e introduzca el número de muestras que se procesan. El script automatizado se desplazará a través de los siguientes pasos sin la intervención del usuario:
   La lisis de muestra y reactivo de Distribución
   1. Transferir 200 l de cada tubo de muestra a la placa de incubación en la posición 14 en la queater / módulo agitador (Figura 3).
   2. Dispensar 80 l de proteinasa K en cada pocillo de muestra de la placa de incubación.
   3. Dispensar 600 l Tampón de Lisis F en cada pocillo de la placa de incubación.
   4. Mezclar la solución durante 10 ciclos, y luego se incuba durante 20 min a 70 ° C y 500 rpm. Los resultados de 70 ° C de temperatura situado en un ~ 60 ° C temperatura de la muestra dentro de la placa de pozo profundo, que está dentro del intervalo de actividad de la proteinasa K. Mientras que las muestras están incubando, el sistema de tratamiento de líquidos sigue operativo mediante la supresión de los reactivos en sus correspondientes placas y pozos:
      • 100 l de tampón de elución A en cada pocillo de la placa de pozo profundo en la posición 13.
      • 800 l de etanol en cada pocillo de la placa de pozo profundo en la posición 10.
      • 1,6 ml de tampón de lavado K en cada pocillo de la placa de pozo profundo en la posición 12.
      • 1,6 ml de tampón de lavado de J en cada pocillo de la placa de pozo profundo en la posición 11.
   5. Después de la incubación de 20 min, la mezcla de la muestra se transfiere desde la placa de incubación a la placa de pozo profundo en la posición 10, y se mezcla a través de 12 ciclos de pipeteado.
   6. Expulsar consejos de reactivos en el cubo de la basura.
      Extracción
      Esta parte del procedimiento de la sangre gDNA es muy similar al protocolo de la gripe epMotion, a excepción de la composición de reactivos de lavado y números de ciclo. Los consejos de Hamilton TruTips son de color negro, por lo que el flujo de líquidos a través de la TruTip no es visible.
   7. Cargue 96 TruTips de la posición cubierta 3.
   8. Aspirar y dispensar la muestra / tampón / etanol lisis mezcla en la posición 10 de 10 ciclos para unir ácidos nucleicos a la TruTip monolito.
   9. Mueva TruTips a la posición 11 y el ciclo de tampón de lavado J 5x sobre el monolito para eliminar tampón de lisis residual y la matriz de la muestra.
   10. Mueva TruTips a la posición 12 y el ciclo de 5x tampón de lavado K para eliminar las proteínas y otros contaminantes a partir del ácido nucleico unido.
   11. Ciclo del TruTip 40x a alta velocidad se seque al aire.
   12. Mueva TruTips a la posición 13 y el ciclo de 5x tampón de elución en A2. El ácido nucleico extraído y purificado está ahora en tampón de elución en la placa de pozo profundo.
   13. Expulsar TruTips en el cubo de la basura.

Una vez finalizado el programa, retire la placa de elución del instrumento y transferir las muestras extraídas a los tubos apropiados para el almacenamiento o aplicaciones posteriores.

3. Extracción de ADN de muestras de plasma de gran volumen

El instrumento Hamilton STARPLUS se utiliza para demostrar un protocolo automatizado para la extracción de ADN fetal que circula libremente a partir de 5 ml de plasma materno. El sistema STARPLUS puede soportar dos brazos del canal pipeta automática, una con 8 canales x 5 ml y uno con 8 canales x 1 ml. Estos brazos pueden funcionar en paralelo para el procesamiento escalonada en lotes de 8 muestras de cada uno. A 5 ml TruTip se utiliza para la l inicialextracción arge-volumen, y un ml TruTip 1 se utiliza para la separación de tamaño y una mayor concentración del ácido nucleico extraído.

Puesta en marcha

1. Encienda el instrumento STARPLUS y el ordenador.
2. Abra el software de control de ejecución Hamilton.
3. Abra el archivo Run proporcionada por Akonni de 8 grandes muestras de plasma de volumen.
4. Coloque el material de laboratorio en la cubierta STARPLUS como se muestra en la Figura 4.
5. Dispense reactivos en sus correspondientes depósitos:

Reactivo	Volumen (ml)	A través Posición
NC-W1	17	5A
NC-W2	17	5B
NC-W4	21	5C
Proteinasa K (20 mg ml -1)	5	6A
EBB	17	6B
EBA2	5	6C
NC-W3	5	6D
NC-B2	5	6E
NC-B3	5	6F
NC-L1	52	7
NC-B1	175	8

6. Permita que la muestra se equilibre a temperatura ambiente.
7. Colocar los tubos de muestra en los bastidores portadores de ejemplo (posición de la cubierta 3 en la Figura 4). Muestra 1 Coloque en la parte trasera y se mueven secuencialmente hacia la parte delantera de la cubierta.

Programa Automatizado

Debido al gran volumen de la muestra de entrada, lisis y homogeneización pasos deben realizarse fuera del instrumento Hamilton STARPLUS en un baño de agua. Los pasos que requieren la intervención del usuario en el sistema automatizado de protocolo se indican con un asterisco (*) en la beginning de la sentencia, y negrita.

La lisis de muestra y reactivo Distribución: La muestra se incubó con proteinasa K y el tampón de lisis para homogeneizar la muestra y liberar el ADN.

8. Seleccione el botón PLAY en la esquina superior izquierda de la ventana del archivo Run. Introducir el número de muestras que se están procesando, la ubicación de la punta de la pipeta en la cubierta, y la ubicación de TruTips en la cubierta.
9. El script automatizado añade 615 l de proteinasa K, 5 ml de plasma, y ​​6,2 ml de tampón de lisis CN-L1 a cada tubo cónico de 50 ml, y luego PAUSA.
10. * Eliminar los tubos cónicos de 50 ml de la cubierta de la muestra y agitar durante 30 segundos a velocidad alta, e incubar fuera de línea durante 30 minutos a 60 ° C en un baño de agua o bloque de calor. Después de los tubos cónicos se eliminan de la cubierta Hamilton, reanudar el script automatizado para continuar dispensar reactivos en sus respectivas placas y pozos (Figura 4B y 4C):
    • 2 ml CN-W1 a cada otro así en la posición 9 de la columna 1.
    • 2 ml CN-W2 a cualquier otro bien de la columna 9 la posición 2.
    • 2 ml CN-W4 a cualquier otro bien de la columna 9 la posición 3.
    • 250 l EBA2 a todos los demás y en la posición 9 columnas 4 y 5.
    • 495 l CN-B2 a cada otro así en la posición 10 de la columna 1.
    • 1 ml EBB a todos los demás y en la posición 10 de la columna 2.
    • 500 l CN-W3 a cada otro así en la posición 10 de la columna 3.
    • 500 l CN-W4 a cada otro así en la posición 10 de la columna 4.
    • 50 l EBA2 a todos los demás y en la posición 10 de la columna 5.

Debido a que los canales de 5 ml son demasiado ancho para utilizar pozos adyacentes para cada muestra, los programas automatizados dispensa reactivos en cada pocillo de la placa de pozo profundo en la posición de la cubierta 9. El brazo mecánico que se utiliza para los canales 1 ml también requiere el uso de cualquier otro pocillo en placas de reactivos para la exclusión y st concentraciónEPS del protocolo.

Después de reactivos de dispensación, el programa hará una pausa.

11. * Después de la 30 min, 60 ° C de incubación, colocar los tubos cónicos de 50 ml en hielo durante 5 min.
12. * Devolver los tubos cónicos de 50 ml a sus posiciones originales en el rack portamuestras en la posición cubierta 4 y reanudar el script automatizado.
13. Añadir 12 ml de tampón de unión CN-B1 a cada tubo de muestra y mezclar 10x.

Large Extracción Volumen: 5 ml TruTips se utilizan para la extracción de ADN total de la muestra de plasma lisadas.

14. Recoge 5 TruTips ml de la posición 2 para la extracción de ácidos nucleicos de gran volumen.
15. Ciclo de la muestra mixture15 veces en el tubo cónico de 50 ml, comenzando en la parte inferior del tubo y en movimiento 3 mm más alta después de cada ciclo de pipeteado. Este paso se une el ácido nucleico total al TruTip monolito.
16. Mueva TruTips a las placas de pocillos profundos en la posición 6 de la columna 1, y cycle 1x de tampón de lavado CN-W1.
17. Mueva TruTips a la posición 9 la columna 2 y el ciclo de lavado en 1x NC-W2.
18. Mueva TruTips a la posición 9 la columna 3 y 2x en ciclo de lavado NC-W4.
19. Mueva TruTips a la posición 9 la columna 4 y el ciclo de 40x a alta velocidad para secar matriz de unión.
20. Mover a la posición 9 TruTips columna 5 y el ciclo de 10x para eluir los ácidos nucleicos unidos de los ml TruTips 5. Esta es la elución de gran volumen # 1.
21. Mueva TruTips a la columna 6 y repetir el paso a la segunda alícuota de tampón de elución. Esta es la elución de gran volumen # 2.
22. Traslado elución # 2 en la columna 9 la posición 5 combinarlo con elución # 1, y descartar los TruTips.

La exclusión y la concentración: El ADN de alto peso molecular se eliminan de la muestra extraída, y el ADN restante se aísla y se concentraron.

23. Añadir eluyente combinado de la etapa 22 a la posición 10 de la columna 1 y mezclar bien 10 veces.
24. Levantar 1 ml Trutips desde la posición 13 y el ciclo de 20x para enlazar el ADN de alto peso molecular al monolito.
25. Mover los TruTips a la posición 10 la columna 2 y el ciclo de 5x para enjuagar la punta y eliminar el ADN de alto peso molecular. Los TruTips se conservan y vuelven a colocar en el estante de la punta en la posición 13.
26. Con puntas de reactivos desde la posición 12, añadir 575 l de tampón de unión CN-B3 a la muestra en la posición 10 y la columna 1 de la mezcla 10 veces.
27. Recoge los TruTips de paso 25, volver a la posición 10 la columna 1, y el ciclo de 20x de obligar a la ADN restante de la muestra a la 1 ml TruTip.
28. Mueva TruTips colocar 10 columnas 4 y el ciclo de lavado 1x CN-W3 para eliminar los inhibidores restantes.
29. Mover los TruTips a la posición 10 y la columna 5 ciclo de lavado en 1x NC-W4 para enjuagar sales residuales de la NC-W3.
30. Levante TruTips sobre la posición 10 la columna 5 y el aire pasar por los consejos de 35x para secar el monolito.
31. Mueva TruTips a la posición 10 la columna 6 y el ciclo de 10 veces en EBA2 para eluir el purificada, tamaño-selecciónted y el ácido nucleico concentrado.
32. Deseche TruTips.
33. Transferir la muestra eluida de la columna de tubos 6 a 1,5 ml en la posición 11. Muestras extraídas están listos para su almacenamiento o procesamiento aguas abajo.

Resultados

Datos de PCR en tiempo real para la gripe extracción de RNA de NPA se muestran en la Figura 5A. Estima que la eficacia de extracción de ácido nucleico es similar a los resultados obtenidos con la versión manual del protocolo ^15. Una respuesta lineal en promedio valores C _t se observa entre 10 ⁴ y 10 ⁶ copias del gen ml ^-1 modificado influenza (R ₂ = 0,99 y 0,98 para la influenza A y B, respectivamente), con desviaciones estándar en media C _t valores inferiores a 1 ciclo. La ausencia de contaminación cruzada con el sistema de epMotion se demuestra en la Figura 5B, donde 12 muestras NPA positivas que contienen 10 copias del gen ⁶ ml ^-1 NPA se intercalan con 12 espacios en blanco tampón. El promedio de C _t para los controles positivos fue 30,16 ± 0,14, y todos los espacios de amortiguamiento fueron negativos. El tiempo total de procesamiento de la muestra es 16, 28 y 40 min para 8, 16 y 24 muestras, respectivamente.Debido a que una típica aspirado nasofaríngeo clínica o un hisopo contendrán 10 ⁷ gen copias ml ^-1 (suponiendo 1000 viriones por TCID ₅₀ y ^16> 10 ⁴ TCID ₅₀ ml ^-1 gripe ^17), se espera que el protocolo de epMotion automatizado para ser eficaz en la mayoría de especímenes clínicos NPA.

Teniendo en cuenta la gama de pruebas moleculares realizados sobre el ADN genómico humano, el objetivo principal de extracción de ácidos nucleicos de la sangre entera es para producir ADN genómico libre de contaminantes, de alto peso molecular. El protocolo automatizado para 96 muestras se completa en 1 hora, que es una mejora con respecto a otros sistemas automatizados (por ejemplo, Promega MagneSil = 90 min y Qiagen QIAamp DNA Blood BioRobot sistema MDx = 2,5 h). Figura 6A muestra los perfiles de absorbancia de UV / VIS para 45 muestras de sangre positivas procesados ​​simultáneamente con 45 espacios en blanco de reactivos en el protocolo de Hamilton STAR, con un promedio Un _{260/280 proporción de 1.96 y el promedio de una relación de 260/230 de 1,93. Una relación A 260/280 entre 1,7-2,0 y A 260/230 ratio> 1,7 son generalmente indicativos de ADN muy puro, libre de sales residuales, proteínas o disolventes, y aceptable para aplicaciones moleculares más abajo. El gel de agarosa al 1% en la Figura 6B muestra que el gDNA resultante es de alto peso molecular (> 24 kb), con cizallamiento mínima. El rendimiento promedio de ácido nucleico a partir de todo el conjunto de 45 muestras positivas es de 5,26 ± 0,46 g ADN humano por 200 l de sangre entera, sobre la base de las Tecnologías de Quantifiler kit de cuantificación de ADN humano vida. Estudios de contaminación cruzada similares a los mostrados en la Figura 5B se realizaron con espacios en blanco tampón de control negativo intercalados con las muestras positivas y se extrajo en paralelo; todos los espacios en blanco volvieron a ser negativos por PCR (no se muestra). El purificado ADNg también es adecuado para otros numerosos análisis basados ​​en la PCR (no se muestra).}

Resultados en tiempo real de ocho muestras repetidas de una muestra de plasma de la madre agrupado procesado con el procedimiento TruTip de gran volumen se muestran en la Figura 7. El protocolo completo (incluyendo fuera de línea proteinasa K de incubación) se terminó en aproximadamente 2,5 horas, similar a la del manual de circulación Kit de Qiagen Nucleic Acids (no comparables kits de extracción automatizados están disponibles aún). El promedio de los valores C _t más de todas las repeticiones son 34,58 ± 0,66 y 29,76 ± 0,50 para el varón fetal (CHi) y el total de ADN (CH1), respectivamente, lo que demuestra una excelente repetibilidad del método de extracción automatizado. La concentración de ADN fetal dentro de la piscina total de ADN (en equivalentes de genoma), se calcula sobre la base de análisis de punto de comparación ajuste a las normas, con la media% ADN fetal resultante a través de todas las muestras de 2,8%. El ADN fetal% real para esta muestra es desconocido porque las muestras se agruparon antes de realizar la extracción. Composición de ADN fetalen muestras de plasma no agrupados extraídos utilizando el método TruTip son típicamente 1,5 veces mayor en comparación con los resultados con una circulación Kit de Qiagen Nucleic Acids (no se muestra).

Figura 1. El proceso de extracción TruTip y el flujo de trabajo, independientemente del sistema de manejo de líquidos. Otros preparación de la muestra o los pasos de manipulación de líquidos se pueden incorporar en las rutinas automatizadas dependiendo de las capacidades del instrumento de manipulación de líquidos y software específicos.

Figura 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 muestra de diseño de la placa. (B) Disposición de los reactivos / Consumables en la mesa de trabajo. La placa de la muestra se pueden configurar para un máximo de 24 muestras (columnas 1, 5 y 9, respectivamente), aunque el epMotion sólo procesará un máximo de 8 muestras simultáneamente. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 3. Hamilton ESTRELLA disposición de la cubierta para la purificación de ADN genómico a partir de sangre entera (no a escala) Cubierta Posición 1 = Hamilton 1 ml consejos filtrados;. 2 = Hamilton 1 ml sugerencias no filtrados; 3 = Akonni / Hamilton ml LPT TruTips mm 1 2 4; = entrada de soporte de muestras de sangre (tubos de recogida de sangre o tubos de microcentrífuga); 5-9 = 290 ml depresiones reactivas para Lysis Buffer F, el etanol, el tampón de lavado J, K tampón de lavado y elución Buffer A2, respectivamente, 10 = 96 deep placa de unión; 11 = 96 pozo profundo Lave J, 12 = 96 pozo profundo Lavar K, 13 = 96 plato hondo elución bien; 14 = Hamilton HHS2 calentador / agitador con Nunc 96 plato hondo de incubación bien, 15 = 50 ml a través de reactivos conteniendo proteinasa K. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

La Figura 4. Hamilton STARPLUS disposición de la cubierta para la purificación de ADN a partir de muestras de plasma de grandes volúmenes (no a escala). El sistema está equipado con 8 canales x 5 ml y 8 canales x 1 ml (no se muestra en la disposición de la cubierta). Cubierta Posición 1 = Hamilton 4 consejos ml filtradas; 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips; 3 = muestras de plasma de origen; 4 = tubos cónicos de 50 ml, 5 = 120 depresiones reactivas ml con CN-W1, W2 y CN-CN-W4 Reagetes, 6 = bajo volumen depresiones reactivas que contienen proteinasa K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB y CN-W3 reactivos; 7 = 290 ml a través de reactivos que contiene reactivo CN-L1; 8 = 290 ml a través de reactivos que contiene CN -B1 reactivo; 9 = 96 placas de pocillos profundos para el Paso 1, 10 = 96 placas de pocillos profundos para el Paso 2, 11 = portadores de muestra para purificado, producto final; 12 = Hamilton de 1 ml puntas sin filtro; 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 TruTips mm. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 5. (A). En tiempo real los resultados de PCR de extracción TruTip automatizado de virus de la gripe agregados en aspirado nasofaríngeo (NPA). Entrada de volumen NPA = 100 l, volumen de elución = 50 l. Los resultados son la media de 3 replicar extractions de 5 diferentes fondos NPA (n = 15) por nivel de dilución y de destino influenza. qPCR se realizó en el sistema LightCycler 480 con las condiciones de ensayo descritas anteriormente ^15. (B) se detectó la contaminación cruzada al 12 muestras positivas NPA se entremezclan con la plantilla no controles y sujetos al procedimiento de extracción automatizada. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

La Figura 6. Resultados de la extracción de ADN genómico a partir de sangre humana entera. A) Las trazas UV-visible desde 1000 NanoDrop (ThermoFisher) de 10 seleccionados al azar repeticiones. B) 1% en gel de agarosa de TruTip purificada gDNA. M = Fisher 24 kb Max DLadder NA. Los carriles 1 - 4 = ~ 100 ng purificada gDNA de cuatro seleccionados al azar repeticiones. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 7. En tiempo real los resultados de PCR de ocho replicar TruTip extracciones de libre circulación de ADN de muestras de plasma. Denotados con un asterisco (* o **) se extrajeron en días separados. CHY cuantifica ADN fetal masculino y CH1 cuantifica ADN total presente (fetal y materna). qPCR se realizó en un sistema LightCycler 480 (Roche) con los ensayos previamente publicados dirigidos CHY y CH1 ^18.

Discusión

La simplicidad del concepto TruTip y flujo de trabajo (Figura 1) que sea fácilmente adaptado, automatizado, eficiente y eficaz para un número de matrices de muestras clínicas, los volúmenes de muestra de entrada, y los sistemas de manejo de líquidos. Debe reconocerse, sin embargo, que cada muestra clínica es único, y pueden variar uno al siguiente en la viscosidad, partículas, moco, contaminantes de la superficie, microbianos, y / o fondos genéticos humanos. Teniendo en cuenta las variaciones esperadas en la composición de la muestra clínica y usos previstos de un protocolo de preparación de la muestra TruTip automatizado, para ello puede ser necesario modificar algunos pasos en un procedimiento TruTip con el fin de lograr los resultados deseados para un tipo de muestra específica. Independientemente del tipo de muestra, sin embargo, los parámetros de TruTip que típicamente tienen el impacto más significativo sobre la pureza del ácido nucleico y / o de recuperación incluyen:

1. Ejemplo de mezcla y homogeneización con tampón de lisis (y el alcohol). Mientras TruTips tienen una retamaño de poro lativamente grande, homogeneización de la muestra y la licuefacción es muy importante para la lisis celular eficaz, y etapas de unión posteriores a la TruTip monolito. Con un lisado homogénea y bien licuado, las muestras pueden moverse a través de la TruTip con caudales más altos, lo que reduce el tiempo total de procesamiento de la muestra. El protocolo de plasma de gran volumen demuestra el potencial de los usuarios para homogeneizar bien y licuar muestras difíciles (on-line u off-line), a pesar del gran volumen de la muestra de entrada.
2. Las velocidades de flujo. Tasas de flujo más lento durante la unión a ácido nucleico o elución suelen dar lugar a mayores rendimientos de ácido nucleico, aunque a expensas de tiempo de procesamiento total. Las tasas de flujo más lento también pueden reducir el grado de cizallamiento de ADN.
3. Los números de ciclo. El número óptimo de ciclos de aspiración y dispensación depende de tipo de muestra, el volumen total de la muestra, y las tasas de flujo. Paso 1 en la figura 1 es normalmente el punto en el que Numbe ciclors (y velocidades de flujo) puede requerir alguna optimización empírica, con muestras tales como aspirado nasofaríngeo (Figura 5), que representa uno de los lisados ​​más desafiantes para optimizar debido a la gama de viscosidades NPA de diferentes pacientes.
4. Secado. Secado completo de la TruTip monolito es imperativo para evitar disolventes orgánicos residuales procedentes de la co-eluyendo con la muestra purificada de ácido nucleico y la inhibición de los procesos aguas abajo o pruebas. Debido a TruTip no se seca a través de centrifugación o filtración al vacío, es importante para maximizar tanto la velocidad de flujo y los números de ciclo durante la etapa de secado. A veces hay una gota residual de la solución de lavado en el término de TruTip después de completar los ciclos de secado. El Hamilton robot tiene la capacidad de realizar una "punta toque" en el lado del pozo para liberar la gota, garantizando así una elución libre de disolvente. El sistema de epMotion no tiene esta característica, sino una pre-enjuague del terminal TruTip en ellución tampón puede ser programado para lograr el mismo efecto.

Debido a la geometría, material de la punta de pipeta, y el método de fijación de los brazos robóticos de canal son únicos para cada fabricante de instrumentos, se requiere una construcción TruTip diferente para cada sistema de manejo de líquidos. Las dimensiones monolito TruTip (diámetro, grosor y tamaño de poro) se correlacionan con la capacidad de unión a ácido nucleico (y las eficiencias de elución), como se espera que para cualquier técnica de extracción en fase sólida. Si bien gruesas matrices (> 4 mm) se pueden incrustar en un TruTip 1 ml a aumentar la capacidad de unión a ácido nucleico para muestras de gran volumen y / o igualar la capacidad de unión a través de formatos de TruTip específicas, hay un equilibrio entre el espesor de TruTip y velocidades de flujo durante la etapa de unión inicial (en la presencia de lisados ​​crudos). Por lo tanto, a veces es ventajoso incorporar monolitos de mayor diámetro en la punta de la pipeta de mayor volumen para las etapas iniciales de un protocolo automatizado (por ejemplo </ Em> los ml Hamilton / Akonni TruTips 5 de extracciones a gran volumen). Dadas las configuraciones TruTip específicas dictadas por los fabricantes de robots de manipulación de líquidos, sin embargo, no necesariamente esperamos rendimientos de ácido nucleico TruTip sean idénticos en todas las plataformas de manejo de líquidos de diferentes fabricantes, o en diferentes tamaños TruTip.

Las muestras clínicas (por definición) contendrán cantidades significativas de ADN genómico humano a menos que se adquieren a partir de sitios normalmente estériles (por ejemplo líquido cefalorraquídeo). A veces se desea el ADN genómico humano (como en la Figura 6), mientras que en otras aplicaciones el ADN humano representa un fondo genómico no deseados (como para la Figura 5). La presencia de ADN de fondo no suele ser problemático, ya que siempre que la cantidad total de ácido nucleico en la muestra no exceda la capacidad de unión del monolito, y el ADN de fondo puede servir como un portador si la nucleico diana deseadaácido está presente en cantidades traza. El objetivo del protocolo de extracción de plasma de gran volumen (Figura 7) es para aislar (fragmentado) ADN fetal en presencia de un exceso de 10-20 veces de ADN materno, que es similar a la preparación de la muestra objetivo de las pruebas de enfermedades infecciosas, excepto que las secuencias son muy congruentes y sólo se pueden distinguir por las pruebas moleculares altamente específica y / o tamaño de la discriminación. En este caso, el ADN circulante total se aisló utilizando un TruTip 5 ml, y ADN fetal de alto peso molecular y de bajo peso molecular posterior se separan en la posterior unión y elución a un ml TruTip 1 mediante la alteración de las condiciones de tampón de unión. Tamaño de la separación y el enriquecimiento selectivo de los ácidos nucleicos diana sobre la base de sus propiedades de unión y elución a un monolito de sílice es un modo significativamente diferente de acción que la conseguida por membranas o columnas de centrifugado de exclusión por tamaño. Tamaño separación y enriquecimiento de ADN microbiano a partir de ADN genómico humano pueden ser unaccomplished en aplicaciones futuras a través de la personalización de tampones de elución de unión y TruTip.

Los protocolos automatizados demostraron aquí hincapié en la utilidad de la TruTip sí mismo monolito para el procesamiento de diversas muestras clínicas, y cómo puede ser adaptado para grandes volúmenes y los robots de manejo de líquidos específicos. Los métodos simplificados suelen dar lugar a protocolos de extracción más rápido en comparación con otros sistemas automatizados. La simplicidad de la tecnología TruTip, sin embargo, también ofrece algunas ventajas de costes para los interesados ​​en la compra de un nuevo sistema de purificación de ácidos nucleicos automatizada,, porque el hardware primaria requerida para la automatización de los procedimientos de TruTip es el brazo pipeta propio canal en lugar de varillas magnéticas, sistemas de vacío , oa bordo de centrifugadoras. La utilización de placas de reactivos precargados también puede reducir el espacio y consumibles necesarios, y el doble de rendimiento por ciclo. Minimizar el espacio de la cubierta con los protocolos TruTip también permite a los usuarios avanzados la integración aguas arriba o aguas dprocesos automatizados ownstream con la TruTip. Por ejemplo solución easyBlood de Hamilton a la sangre completa fraccionar puede incorporarse con el método de extracción TruTip automatizada, lo que agilizar significativamente los procesos bio-banking. Los procesos de post-extracción tales como la cuantificación de ácido nucleico, la normalización, la PCR configuración, o la secuenciación de ADN también se integran fácilmente con TruTip en las plataformas de manejo de líquidos más grandes.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	300-11120
95% Ethanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC615110040
99% Acetone	Sigma-Aldrich	270725-4L
DEPC-treated water	Life Technologies	AM9906
Reagent Reservoir, 30 ml	Eppendorf	960050100
Deep well plate 96/2,000 μl	USA Scientific	30502302
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl	Eppendorf	960050100
			Equipment
epMotion 5070 System	Eppendorf	5070 000.000
Dispensing tool TM1000-8		960001061
Reservoir rack		960002148
			Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.
			Reagent/Material
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	300-20341
95% ethanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC615110040
Proteinase K	AMRESCO LLC	E195
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack	Hamilton Robotics, Inc.	235905
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack	Hamilton Robotics, Inc.	235904
50 ml Reagent Trough	Hamilton Robotics, Inc.	187297
Deep Well 2 ml plate	USA Scientific	1896-2800
Nunc 96 DWP-2 ml	Thermofisher	27874
Reagent Trough	Fisher	14-222-412
			Equipment
Hamilton STAR System	Hamilton Robotics, Inc.	173027
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm	Hamilton Robotics, Inc.	173081/173050
1 ml 96-channel head	Hamilton Robotics, Inc.	199090
Tip Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182085
Sample Carriers/Inserts	Hamilton Robotics, Inc.	173400/182238
Plate Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182090
Multiflex Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188039
HHS2 Heater Shaker Unit	Hamilton Robotics, Inc.	199033
Rack Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188047
			Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.
			Reagent/Material
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	Call to inquire
100% ethanol	Sigma-Aldrich	459828-1L
Isopropanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC327270010
Proteinase K	AMRESCO LLC	E195
Filtered 4 ml Tips	Hamilton Robotics, Inc.	184022
Unfiltered 1 ml Tips	Hamilton Robotics, Inc.	235939
96-Deep Well Plates	USA Scientific	1896-2800
50 ml Conical Tubes	Corning/ThermoFisher Scientific	05-526B
50 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	187297
120 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	182703
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs	ThermoFisher Scientific	14-222-412
			Equipment
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module	Hamilton Robotics, Inc.	173025/190012
1 ml Independent Pipette Channels / Arm	Hamilton Robotics, Inc.	173081/173052
5 ml Independent Channel / Modular Arm	Hamilton Robotics, Inc.	184090/173050
Plate Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182090
Multiflex Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188039
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	188047
120 ml Reagent trough carrier	Hamilton Robotics, Inc.	185290
Tip Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182085
50 ml Tube Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182245
24 Position Sample Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	173400
32 Position Sample Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	173410
			Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.